專利名稱：一種膠質(zhì)芽孢桿菌耐鹽突變菌株的高通量篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種膠質(zhì)芽孢桿菌耐鹽突變菌株的高通量篩選方法。
背景技術(shù)：
設(shè)施農(nóng)業(yè)是人類獲取大量綠色農(nóng)產(chǎn)品最理想的種植方式，已成為世界農(nóng)業(yè)發(fā)
展中最具活力的新興產(chǎn)業(yè)之一。目前全世界設(shè)施農(nóng)業(yè)面積已達(dá)400余萬hm2，我 國2006設(shè)施農(nóng)業(yè)面積為250萬hm2，是世界設(shè)施農(nóng)業(yè)大國。設(shè)施農(nóng)業(yè)己成為農(nóng) 業(yè)增效和農(nóng)民增收最直接、最有效的途徑，它在反季節(jié)和跨地區(qū)種植中起了重 要作用，實(shí)現(xiàn)了蔬菜等經(jīng)濟(jì)作物的周年生產(chǎn)和均衡供應(yīng)，經(jīng)濟(jì)、社會和生態(tài)效 益可觀。然而，設(shè)施農(nóng)業(yè)由于長期實(shí)行高集約化、高復(fù)種指數(shù)、高投入、連作 重茬的種植模式，設(shè)施土壤結(jié)構(gòu)、理化及生物特性發(fā)生了很大變化，嚴(yán)重制約 了設(shè)施農(nóng)業(yè)的持續(xù)發(fā)展。
次生鹽漬化是設(shè)施土壤最普遍的障礙因子。日本在70年代就發(fā)現(xiàn)蔬菜設(shè)施 土壤存在較嚴(yán)重的鹽分積累。40 %以上的設(shè)施土壤的可溶性鹽濃度在10. 0-16. 0 g/kg，適宜蔬菜生長的面積僅占設(shè)施蔬菜栽培面積的20%-30%。我國設(shè)施土壤 鹽漬化相當(dāng)普遍、突出。引起設(shè)施土壤次生鹽漬化的離子包括K+、 Na+、 Ca2+、 Mg2+、 C1—、 S042—、 N03—。有些設(shè)施土壤引起鹽漬化的主要陰離子是SO/—或C1—，這與施 用化肥的種類和用量有關(guān)。微生物區(qū)系失衡是設(shè)施土壤存在的另一主要問題。 在設(shè)施栽培條件下，土壤中細(xì)菌和放線菌顯著減少，真菌明顯增加，其中病原 菌聚集尤其突出，成為設(shè)施農(nóng)業(yè)的主要障礙因子之一。引起設(shè)施土壤微生物區(qū) 系變化的重要原因是鹽漬化。三大類微生物區(qū)系比例是土壤肥力的一個衡量指 標(biāo)，因此恢復(fù)設(shè)施土壤的微生物區(qū)系尤其是增加有益細(xì)菌數(shù)量是提高設(shè)施土壤 肥力的重要措施。
預(yù)防設(shè)施土壤次生鹽漬化以及由此帶來的一系列問題，首要是限制化肥施用，
優(yōu)先施用含N(v的肥料，少施含so/—及cr的肥料。目前，生產(chǎn)中對設(shè)施土壤的
修復(fù)主要采用傳統(tǒng)的手段—一施用秸稈和淤泥等。秸稈施入土壤以后，在微生 物降解過程中，同化土壤中的氮素和鹽分，改善土壤鹽漬化、增加土壤有益微生 物數(shù)量，抑制病原菌活性。微生物肥料在無公害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著越來越重要 的作用，同樣也將在設(shè)施農(nóng)業(yè)中發(fā)揮重要作用，同時可減少化肥而間接緩解鹽 漬化問題。但設(shè)施土壤畢竟不同于露地土壤，目前還沒有設(shè)施土壤專用微生物產(chǎn)品，因此這方面的研究開發(fā)顯得較為迫切。
膠質(zhì)芽孢桿菌是我國微生物肥料的重要菌種，由該菌所生產(chǎn)的微生物鉀肥在
經(jīng)濟(jì)作物種植中發(fā)揮了重要作用。但該菌的耐鹽性較差，在0.1%含鹽培養(yǎng)基中
生長受到顯著抑制。因此針對設(shè)施土壤的主要障礙因子進(jìn)行膠質(zhì)芽孢桿菌耐鹽 突變菌株的篩選，并進(jìn)行相關(guān)產(chǎn)品研究和開發(fā)，拓展微生物鉀肥的應(yīng)用范圍， 對促進(jìn)我國設(shè)施農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展將具有舉足輕重的作用。
突變菌株的篩選一般多用篩選培養(yǎng)基在培養(yǎng)平板上進(jìn)行，該篩選方法存在
篩選工作量大、篩選效率低等問題。96孔培養(yǎng)板作為一種通量相對較大的篩選 工具在大規(guī)模藥物篩選中發(fā)揮了重要作用，但在細(xì)菌優(yōu)良菌株選育中未見應(yīng)用， 將96孔培養(yǎng)板應(yīng)用于細(xì)菌突變菌株的篩選，可有效提高篩選效率，減少篩選工 作量。本專利結(jié)合96孔培養(yǎng)板和普通培養(yǎng)平板篩選兩種方式，對誘變后的膠質(zhì) 芽孢桿菌進(jìn)行高通量篩選和復(fù)篩，獲得耐鹽突變菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種膠質(zhì)芽孢桿菌耐鹽突變菌株 的高通量篩選方法。 包括如下步驟
1) 將膠質(zhì)芽孢桿菌在無氮培養(yǎng)基上活化后，轉(zhuǎn)接于抑制莢膜生長的液體培 養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集菌體，用生理鹽水或磷酸緩沖液懸浮菌體， 并將菌體濃度調(diào)整至10"-10、fUm";
2) 將菌體懸浮液用Q^誘變，誘變劑量為l-8kGy;將誘變后的菌體懸浮 液離心，獲得誘變菌體；
3) 誘變菌體用液體篩選培養(yǎng)基稀釋至103-104 cfu ml"后，分裝于96孔培 養(yǎng)板中培養(yǎng)，進(jìn)行高通量篩選，然后經(jīng)過復(fù)篩，獲得耐鹽突變菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膠質(zhì)芽孢桿菌耐鹽突變菌株的高通量篩選方 法，其特征在于所述的無氮培養(yǎng)基配方為蔗糖5.0-10.0 g; K2HP04 0.5-2.0 g; MgS04 7H20 0.2-0.5 g;瓊脂粉15.0-20.0 g;蒸餾水1000 ml; pH 7.0-7.5。
所述的抑制莢膜生長的液體培養(yǎng)基配方為麥芽糖10.0-20.0 g; (NH4)2S04 0.5-2.0 g;酵母粉0.1-1.0 g; MgS04*7H20 0.2-1.0 g; K2HP04 0.5-2.0 g;蒸餾水 1000 ml; pH 7.0-7.5。
所述的高通量篩選方法的步驟為
1)制備篩選培養(yǎng)基，其配方為蔗糖5.0-10.0 g; K2HP04 0.5 g;
MgS04 7H20 0.2-0.5 g; NaCl 5.0-10.0 g;鹽漬性設(shè)施土壤浸提液0-1000 ml;
5蒸餾水0-1000ml; pH7.0-7.5;其中鹽漬性設(shè)施土壤浸提液是由連續(xù)使用5年以 上的設(shè)施土壤用5-10倍體積的蒸餾水浸提60-180 min、濾紙過濾后得到；
2) 用篩選培養(yǎng)基懸浮誘變菌體，調(diào)整誘變菌體濃度至10M(^cfU ml",充 分搖勻后，分裝于96孔培養(yǎng)板中，每孔100-200
3) 28-32"C培養(yǎng)5-7天，用分光光度計檢測96孔培養(yǎng)板中的誘變菌體吸光 值，將96孔培養(yǎng)板中吸光值為0.2-0.5的誘變菌體進(jìn)行復(fù)篩。
所述96孔培養(yǎng)板中吸光值為0.2-0.5的誘變菌體進(jìn)行復(fù)篩的方法步驟為
1)制備復(fù)篩培養(yǎng)基，其配方為蔗糖5.0-10.0 g; 土壤礦物2.0-5.0 g;
MgS04'7H20 0.2-0.5 g;瓊脂粉15.0-20.0 g;溴酚藍(lán)或甲基紅指示劑0.002-0.005 g '1";其中鹽漬性設(shè)施土壤浸提液0-1000 ml;蒸餾水0-1000 ml; pH 7.0-7.5; 2) 將96孔培養(yǎng)板中吸光值為0.2-0.5的誘變菌體稀釋至103-104 cfli ml",取100-200 ^誘變菌體稀釋液涂布于復(fù)篩培養(yǎng)平板上，重復(fù)3-5次，28-32 。C培養(yǎng)3-5 d， 出現(xiàn)黃色暈圈的菌落為目標(biāo)菌落，將目標(biāo)菌落在復(fù)篩培養(yǎng)平板上進(jìn)行2-3次單菌 落純化后獲得耐鹽突變菌株。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，可有效減少篩選工作量，進(jìn)而提高篩選效率。本 發(fā)明的目的是通過誘變和篩選獲得適應(yīng)設(shè)施土壤特殊環(huán)境的耐鹽突變菌株，為 活化設(shè)施土壤的磷、鉀營養(yǎng)并改善鹽漬化、逐步恢復(fù)設(shè)施土壤肥力奠定基礎(chǔ)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l
應(yīng)用核輻射誘導(dǎo)膠質(zhì)芽孢桿菌AS1. 153變異，篩選獲得耐鹽性為0. 5 %以上 突變菌株。在無氮培養(yǎng)基上活化膠質(zhì)芽孢桿菌，3(TC培養(yǎng)36h后，轉(zhuǎn)接于抑制 莢膜生長的液體培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)16h后，離心收集菌體，用生理鹽水或磷 酸緩沖液懸浮菌體，并將菌體濃度調(diào)整為104-105Cfumr。將菌體懸浮液用Co6。 誘變，誘變劑量為5kGy，將誘變后的菌體離心收集后，用液體篩選培養(yǎng)基懸浮， 調(diào)整濃度至103-104 cfuml—、充分搖勻后，分裝于96孔培養(yǎng)板中，每孔150 y 1， 30'C培養(yǎng)5天，用分光光度計檢測96孔培養(yǎng)板中的誘變菌體吸光值，對96孔 培養(yǎng)板中吸光值為0. 2以上的誘變菌體進(jìn)行復(fù)篩。
將96孔培養(yǎng)板中吸光值為0. 2以上的誘變菌體稀釋至103-104 cfu ml—1,取 100ul誘變菌體稀釋液涂布于復(fù)篩培養(yǎng)平板上，重復(fù)3次，32 'C培養(yǎng)5d， 16 個菌落出現(xiàn)黃色暈圈即為目標(biāo)菌落，將16個目標(biāo)菌落在復(fù)篩培養(yǎng)平板上進(jìn)行2 次單菌落純化后獲得15株耐鹽性為0. 5 %以上的耐鹽突變菌株。
將15株耐鹽突變菌株接種于裝有50 ml液體復(fù)篩培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，在32 。C、 200轉(zhuǎn)/min條件下培養(yǎng)5 d，將培養(yǎng)液離心，分別用磷鉬酸法及原子 吸收光譜法測定培養(yǎng)液上清中的游離磷和鉀含量，其中培養(yǎng)液上清中的游離磷 和鉀含量增加5.0%以上的菌株有2株，這2個菌株為高效耐鹽突變菌株。 所用培養(yǎng)基配方分別如下-
1) 無氮培養(yǎng)基配方蔗糖5.0 g; K2HP04 0.5 g; MgS04 7H20 0.2 g;瓊 脂粉20.0g;蒸餾水1000 ml; pH7.5;
2) 抑制莢膜生長的培養(yǎng)基麥芽糖15.0g; (NH4)2S041.5g;酵母粉0.5g; MgS04* 7H20 0. 5 g; K2HP04 1.0 g;蒸餾水1000 ml; pH 7.0;
3) 篩選培養(yǎng)基配方蔗糖10.0 g; K2HP04 0.5 g; MgS04 7H20 0 . 2 g; NaCl 5.0 g;鹽漬性設(shè)施土壤浸提液1000 ml; pH 7.0;其中鹽漬性設(shè)施土壤 浸提液由連續(xù)使用5年以上的設(shè)施土壤用5倍體積的蒸餾水浸提60min、濾紙過 濾后得到；
4) 復(fù)篩培養(yǎng)基配方蔗糖10. Og; 土壤礦物5.0g; MgS04 7H20 0. 2 g; 瓊脂粉20.0 g;溴酚藍(lán)指示劑0.003 g* I—1; NaCl 5.0 g;鹽漬性設(shè)施土壤浸 提液IOOO ml; pH 7.0。
實(shí)施例2
應(yīng)用核輻射誘導(dǎo)膠質(zhì)芽孢桿菌KNP2變異，篩選獲得耐鹽性為0. 7 %以上的 耐鹽突變菌株。在無氮培養(yǎng)基上活化膠質(zhì)芽孢桿菌，32 i:培養(yǎng)36h后，將菌落 轉(zhuǎn)接于抑制莢膜生長的液體培養(yǎng)基中，32 'C培養(yǎng)14 h后，離心收集菌體，用 生理鹽水或磷酸緩沖液懸浮菌體，并將菌體濃度調(diào)整為104-105 cfu mr1。將菌 體懸浮液用Co6o誘變，誘變劑量為3kGy，將誘變后的菌體離心收集后，用液體 篩選培養(yǎng)基懸浮，調(diào)整濃度至103-104 cfu m1—1,充分搖勻后，分裝于96孔培養(yǎng) 板中，每孔IOO ul， 32。C培養(yǎng)5天，用分光光度計檢測96孔培養(yǎng)板中的誘變 菌體吸光值，對96孔培養(yǎng)板中吸光值為0. 2以上的誘變菌體進(jìn)行復(fù)篩。
將96孔培養(yǎng)板中吸光值為0. 2以上的誘變菌體稀釋至103-104 cfu ml—、取 100ul誘變菌體稀釋液涂布于復(fù)篩培養(yǎng)平板上，重復(fù)5次，32 。C培養(yǎng)5d， 11 個菌落出現(xiàn)黃色暈圈即為目標(biāo)菌落，將11個目標(biāo)菌落在復(fù)篩培養(yǎng)平板上進(jìn)行3 次單菌落純化后獲得11株耐鹽性為0. 7 %以上的耐鹽突變菌株。
將11株耐鹽突變菌株接種于裝有50ml液體篩選培養(yǎng)基的250ml三角瓶中， 在32-C、 200轉(zhuǎn)/min條件下培養(yǎng)5d，將培養(yǎng)液離心，分別用磷鉬酸法及原子吸 收光譜法測定培養(yǎng)液上清中的游離磷和鉀含量，其中培養(yǎng)液上清中的游離磷和 鉀含量增加2%以上的菌株有2株，這2個菌株為高效耐鹽突變菌株。所用培養(yǎng)基配方分別如下
1) 無氮培養(yǎng)基配方蔗糖5.0 g; K2HPO41.0g; MgS04 7H20 0.2 g;瓊 脂粉18.0g;蒸餾水1000ml; pH7.5;
2) 抑制莢膜生長的培養(yǎng)基麥芽糖10.0g; (NH4)2S041.2g;酵母粉0. 5 g;
MgS(V 7H20 0.5 g; K2HP04 1.0 g;蒸餾水1000 ml; pH 7.0;
3) 篩選培養(yǎng)基配方蔗糖10. Og; K2HP041.5g; MgS04 7H20 0. 2 g; NaCl 7.0 g;鹽漬性設(shè)施土壤浸提液1000 ml; pH 7.5。鹽漬性設(shè)施土壤浸提液由連 續(xù)使用5年以上的設(shè)施土壤用5倍體積的蒸餾水浸提160 min、濾紙過濾后得到；
4) 復(fù)篩培養(yǎng)基配方蔗糖10.0 g; 土壤礦物5.0 g; MgS04 7H20 0. 2 g; 瓊脂粉20.0 g;溴酚藍(lán)指示劑0.003 g' I—1; NaCl 7.0 g;鹽漬性設(shè)施土壤浸 提液1000 ml; pH 7. 5。
實(shí)施例3
應(yīng)用核輻射誘導(dǎo)膠質(zhì)芽孢桿菌認(rèn)P13變異，篩選耐鹽性為1.0%以上的耐鹽 突變菌株。在無氮培養(yǎng)基上活化菌株KNP13， 28'C培養(yǎng)36 h后，將菌落轉(zhuǎn)接于 抑制莢膜生長的液體培養(yǎng)基中，28。C培養(yǎng)16h后，離心收集菌體，用生理鹽水 或磷酸緩沖液懸浮菌體，并將菌體濃度調(diào)整為104-105 cfu m1—1。將菌體懸浮液 用CcT誘變，誘變劑量為8kGy，將誘變后的菌體離心收集后，用液體篩選培養(yǎng) 基懸浮，調(diào)整濃度至103-104 cfu m1—1，充分搖勻后，分裝于96孔培養(yǎng)板中，每 孔200 ul， 28"C培養(yǎng)7天，用分光光度計檢測96孔培養(yǎng)板中的誘變菌體吸光 值，對96孔培養(yǎng)板中吸光值為0. 2以上的誘變菌體進(jìn)行復(fù)篩。
將96孔培養(yǎng)板中吸光值為0. 2以上的誘變菌體稀釋至103-104 cfu m1—1，取 IOOPI誘變菌體稀釋液涂布于復(fù)篩培養(yǎng)平板上，重復(fù)5次，28"C培養(yǎng)7d， 5個 菌落出現(xiàn)黃色暈圈即為目標(biāo)菌落，將5個目標(biāo)菌落在復(fù)篩培養(yǎng)平板上進(jìn)行3次 單菌落純化后獲得5株耐鹽性為1. 0 %以上的耐鹽突變菌株。
將5株耐鹽突變菌株接種于裝有50 ml液體篩選培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中， 在32t、 200轉(zhuǎn)/min條件下培養(yǎng)5 d，將培養(yǎng)液離心，分別用磷鉬酸法及原子吸 收光譜法測定上清中的游離磷和鉀含量，其中上清中的游離磷和鉀含量增加2% 以上的菌株有1株，該菌株為高效耐鹽突變菌株。
所用培養(yǎng)基配方分別如下
1) 無氮培養(yǎng)基配方蔗糖6.0 g; K2HP041.5g; MgS04 7H20 0.5 g;瓊 脂粉20.0g;蒸餾水1000 ml; pH7.5;
2) 抑制莢膜生長的培養(yǎng)基:麥芽糖10.0g; (NH4)2S041.5g;酵母粉0. 5 g;MgS(V 7H20 0. 5 g; K2HP04 2 . 0 g;蒸餾水1000 ml; pH 7.5;
3) 篩選培養(yǎng)基配方蔗糖10.0 g; K2HPO42.0 g; MgS04'7H20 0. 5 g; NaCl 7.0 g;鹽漬性設(shè)施土壤浸提液1000 ml; pH 7.5;其中鹽漬性設(shè)施土壤 浸提液由連續(xù)使用5年以上的設(shè)施土壤用5倍體積的蒸餾水浸提120 min、濾紙 過濾后得到；
4) 復(fù)篩培養(yǎng)基配方蔗糖10.0 g; 土壤礦物5.0 g; MgS04 7H20 0.5 g; 瓊脂粉20.0 g;溴酚藍(lán)指示劑0.005 g' l—1; NaCl 10.0 g;鹽漬性設(shè)施土壤浸 提液IOOO ml; pH 7. 5。
權(quán)利要求
1.一種膠質(zhì)芽孢桿菌耐鹽突變菌株的高通量篩選方法，其特征在于包括如下步驟1)將膠質(zhì)芽孢桿菌在無氮培養(yǎng)基上活化后，轉(zhuǎn)接于抑制莢膜生長的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集菌體，用生理鹽水或磷酸緩沖液懸浮菌體，并將菌體濃度調(diào)整至104-105cfu ml-1；2)將菌體懸浮液用Co60誘變，誘變劑量為1-8kGy；將誘變后的菌體懸浮液離心，獲得誘變菌體；3)誘變菌體用篩選培養(yǎng)基稀釋至103-104cfu ml-1后，分裝于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，進(jìn)行高通量篩選，然后經(jīng)過復(fù)篩，獲得耐鹽突變菌株。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膠質(zhì)芽孢桿菌耐鹽突變菌株的高通量篩選方 法，其特征在于所述的無氮培養(yǎng)基配方為蔗糖5.0-10.0 g; K2HP04 0.5-2.0 g; MgS04 7H20 0.2-0.5 g;瓊脂粉15.0-20.0 g;蒸餾水1000 ml; pH 7.0-7.5。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膠質(zhì)芽孢桿菌耐鹽突變菌株的高通量篩選方法，其特征在于所述的抑制莢膜生長的液體培養(yǎng)基配方為麥芽糖10.0-20.0 g;(NH4)2S04 0.5-2.0 g;酵母粉O.l陽l.O g; MgS04*7H20 0.2-1.0 g; K2HP04 0.5-2.0 g; 蒸餾水1000 ml; pH 7.0-7.5。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膠質(zhì)芽孢桿菌耐鹽突變菌株的高通量篩選方 法，其特征在于所述的高通量篩選方法的步驟為1) 制備篩選培養(yǎng)基，其配方為蔗糖5.0-10.0 g; K2HP04 0.5-2.0 g; MgS04 7H20 0.2-0.5 g; NaCl 5.0-10.0 g;鹽漬性設(shè)施土壤浸提液0-1000 ml; 蒸餾水0-1000ml; pH7.0-7.5;其中鹽漬性設(shè)施土壤浸提液是由連續(xù)使用5年以 上的設(shè)施土壤用5-10倍體積的蒸餾水浸提60-180 min、濾紙過濾后得到；2) 用篩選培養(yǎng)基懸浮誘變菌體，調(diào)整誘變菌體濃度至103-104 0& ml",充 分搖勻后，分裝于96孔培養(yǎng)板中，每孔100-2003) 28-32"C培養(yǎng)5-7天，用分光光度計檢測96孔培養(yǎng)板中的誘變菌體吸光 值，將96孔培養(yǎng)板中吸光值為0.2-0.5的誘變菌體進(jìn)行復(fù)篩。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種膠質(zhì)芽孢桿菌耐鹽突變菌株的高通量篩選方 法，其特征在于所述96孔培養(yǎng)板中吸光值為0.2-0.5的誘變菌體進(jìn)行復(fù)篩的方法 步驟為1)制備復(fù)篩培養(yǎng)基，其配方為蔗糖5.0-10.0 g; 土壤礦物2.0-5.0 g;MgS04 '7H20 0.2-0.5 g;瓊脂粉15.0-20.0 g;溴酚藍(lán)或甲基紅指示劑0.002-0.005 g.L";其中鹽漬性設(shè)施土壤浸提液0-1000 ml;蒸餾水0-1000 ml; pH 7.0-7.5;2)將96孔培養(yǎng)板中吸光值為0.2-0.5的誘變菌體稀釋至103-104 cfU ml", 取100-20(Hd誘變菌體稀釋液涂布于復(fù)篩培養(yǎng)平板上，重復(fù)3-5次，28-32。C培養(yǎng) 3-5 d，出現(xiàn)黃色暈圈的菌落為目標(biāo)菌落，將目標(biāo)菌落在復(fù)篩培養(yǎng)平板上進(jìn)行2-3 次單菌落純化后獲得耐鹽突變菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種膠質(zhì)芽孢桿菌耐鹽突變菌株的高通量篩選方法。包括如下步驟1)將膠質(zhì)芽孢桿菌在無氮培養(yǎng)基上活化后，轉(zhuǎn)接于抑制莢膜生長的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集菌體，用生理鹽水或磷酸緩沖液懸浮菌體，并將菌體濃度調(diào)整至10⁴-10⁵cfu ml^-1；2)將菌體懸浮液用Co⁶⁰誘變，誘變劑量為1-8kGy；將誘變后的菌體懸浮液離心，獲得誘變菌體；3)誘變菌體用液體篩選培養(yǎng)基稀釋至10³-10⁴cfu ml^-1后，分裝于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，進(jìn)行高通量篩選，然后經(jīng)過復(fù)篩，獲得耐鹽突變菌株。本發(fā)明應(yīng)用核輻射誘變及高通量篩選方法，獲得膠質(zhì)芽孢桿菌的耐鹽突變菌株，為設(shè)施土壤的修復(fù)提供菌株。
文檔編號C12Q1/04GK101314789SQ20081006295
公開日2008年12月3日 申請日期2008年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月14日
發(fā)明者吳金光, 方瓊樓, 竺錫武, 胡秀芳, 陳集雙 申請人:浙江理工大學(xué)