專(zhuān)利名稱(chēng)：一種示蹤食品致病性細(xì)菌生長(zhǎng)的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及示蹤細(xì)菌生長(zhǎng)狀況的快速檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是多頻大幅脈沖 智能化學(xué)分析系統(tǒng)在監(jiān)測(cè)液體培養(yǎng)基中食源性致病菌生長(zhǎng)情況的方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，食品致病性細(xì)菌引發(fā)的食物中毒等疾病受到社會(huì)高度關(guān)注。大腸
桿菌0157 : H7 (E.coli 0157 : H7)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus)、 鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmondla typhimurium)等被認(rèn)為是幾種危害最大的食源性致 病菌，它們不但造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也嚴(yán)重威脅到人類(lèi)健康與安全。因此， 在食品生產(chǎn)、加工、儲(chǔ)藏和銷(xiāo)售等過(guò)程中，示蹤食品致病性細(xì)菌生長(zhǎng)狀況及其 規(guī)律和有毒代謝產(chǎn)物產(chǎn)生規(guī)律的綜合信息，對(duì)指導(dǎo)食品的安全生產(chǎn)和衛(wèi)生檢測(cè) 具有重要意義。
目前，所有示蹤食品致病性細(xì)菌生長(zhǎng)狀況及其趨勢(shì)的檢測(cè)方法，包括傳統(tǒng) 的國(guó)標(biāo)法和其他的快速檢測(cè)方法和新技術(shù)，都只能對(duì)菌體數(shù)量或?qū)δ骋环N成份 如ATP等含量的變化規(guī)律進(jìn)行測(cè)定，不能反應(yīng)菌體生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的消耗
狀況、代謝變化規(guī)律的綜合信息。因此，建立一種準(zhǔn)確、靈敏、簡(jiǎn)便且經(jīng)濟(jì)的 示蹤食品致病性細(xì)菌生長(zhǎng)代謝狀況綜合信息的快速檢測(cè)方法尤為重要。
菌種不同，自身所含酶系統(tǒng)不同，代謝方式和代謝途徑就不相同，對(duì)營(yíng)養(yǎng) 物質(zhì)的分解利用和產(chǎn)生的產(chǎn)物亦不相同。即使是同一種菌體，乃至同株甚至克 隆菌體的不同生長(zhǎng)時(shí)期，在同一個(gè)限定的環(huán)境中，對(duì)基質(zhì)的利用程度和代謝產(chǎn) 物也是不盡相同的，利用多頻大幅脈沖傳感系統(tǒng)可以分析和示蹤這些變化的綜 合信息，并具有不受樣品顏色、濁度的影響，樣品可以不經(jīng)處理，檢測(cè)前后無(wú) 損耗，所用儀器設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。
目前，有用免疫傳感器、石英晶體壓電傳感器其他生物傳感器監(jiān)測(cè)食品微 生物的研究報(bào)道，這些方法均存在一些關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題沒(méi)有得到解決，從而限制 了其發(fā)展和應(yīng)用。用高靈敏度的電子舌快速評(píng)價(jià)食品質(zhì)量安全性是為國(guó)內(nèi)外研 究的前沿，目前僅應(yīng)用于檢測(cè)食品和農(nóng)產(chǎn)品中重金屬污染、農(nóng)藥殘留和產(chǎn)品真 偽辨識(shí)等領(lǐng)域。
智能化學(xué)分析系統(tǒng)(通常稱(chēng)作電子舌)，通過(guò)傳感器陣列(相當(dāng)于生物系統(tǒng) 中的舌頭)感受不同的化學(xué)物質(zhì)，采集各種不同的信號(hào)信息輸入電腦。電腦代 替了生物系統(tǒng)中的大腦功能，通過(guò)軟件進(jìn)行分析處理，區(qū)分辨識(shí)不同性質(zhì)物質(zhì) 的整體特征。
專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?00710068869.X的專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)了一種用于液體樣品的智能 化學(xué)分析系統(tǒng)，包括傳感器陣列、信號(hào)激勵(lì)采集裝置和智能分析單元，信號(hào)激 勵(lì)采集裝置將預(yù)定的激發(fā)脈沖序列加到輔助電極，同時(shí)釆集工作電極產(chǎn)生的響 應(yīng)信號(hào)；智能分析單元包括信號(hào)激勵(lì)采集裝置上位機(jī)和數(shù)據(jù)智能分析軟件，用 于對(duì)響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行處理和分析；該智能化學(xué)分析系統(tǒng)的信號(hào)激勵(lì)采集裝置為多 頻脈沖信號(hào)激勵(lì)采集裝置，能產(chǎn)生多頻率段的大幅脈沖電勢(shì)；它的動(dòng)作步驟如 下1.通過(guò)單片機(jī)控制DAC數(shù)/模轉(zhuǎn)換模塊，激勵(lì)信號(hào)輸入恒電位儀后加至輔助 電極；2.工作電極產(chǎn)生的電流由程控電流跟隨器轉(zhuǎn)換為電壓信號(hào)，進(jìn)入反相放大 器；3.由低通濾波去除信號(hào)中的噪聲，輸入ADC模/數(shù)轉(zhuǎn)換模塊轉(zhuǎn)換成數(shù)字量反 饋給單片機(jī)。
由于該智能化學(xué)分析系統(tǒng)采用多頻脈沖伏安法為信號(hào)激發(fā)采集模式，相比 現(xiàn)有技術(shù)響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)，信噪音比高，信息量更豐富；同時(shí)采用了適合其自身數(shù) 據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使用的，方便、智能化的智能分析軟件，具有響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)、信號(hào)穩(wěn)
定，信噪音比高，信息量豐富、分辨率高、易于操作等特點(diǎn)。
利用該智能化學(xué)分析系統(tǒng)具有非專(zhuān)一性、弱選擇性、對(duì)溶液中不同組分(有 機(jī)和無(wú)機(jī)，離子和非離子)具有高度交叉敏感的特性，對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期的菌群培 養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合適當(dāng)?shù)哪Ｊ阶R(shí)別算法和多變量分析方法對(duì)陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行處 理，獲得培養(yǎng)液樣本定性定量信息，從而可以監(jiān)測(cè)菌群的生長(zhǎng)情況。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種準(zhǔn)確、靈敏、簡(jiǎn)便、高效、經(jīng)濟(jì)的示蹤食品致 病性細(xì)菌生長(zhǎng)和代謝綜合信息的檢測(cè)方法，即一種用多頻大幅脈沖智能化學(xué)分 析系統(tǒng)監(jiān)測(cè)菌群生長(zhǎng)的方法。
本發(fā)明的上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種示蹤食品致病性細(xì)菌生長(zhǎng)的檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟-
a. 將待測(cè)菌種接種于1%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中，靜止培養(yǎng)18小時(shí)，制備種子
液；
b. 將種子液分別等量轉(zhuǎn)接于裝有50mll。/。葡萄糖肉湯培養(yǎng)基的三角瓶中，分 另lj培養(yǎng)0h、 lh、 2h、 3h、 4h、 5 h、 6h、 7 h、 8 h、 9 h、 10 h、 11 h、 12 h、 13 h、 24h、 30h后，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行滅活；
c. 在多頻大幅脈沖智能化學(xué)分析系統(tǒng)的信號(hào)激勵(lì)采集裝置上位機(jī)上選擇信 號(hào)激勵(lì)采集裝置所需的電壓、脈沖頻率、脈沖間隔時(shí)間；
d. 把多頻大幅脈沖智能化學(xué)分析系統(tǒng)的傳感器陣列浸入培養(yǎng)液中，所述的傳 感器陣列以鉑電極、金電極、鈀電極、鎳電極、鉤電極、鈦電極等非修飾金屬 電極作為工作電極，鉑電極作為輔助電極，Ag/AgCl作為參比電極；
e. 在工作電極上施加電壓，對(duì)傳感器陣列中的每個(gè)工作電極進(jìn)行一次脈沖序
列；
f.采集電流響應(yīng)信號(hào)，提取頂點(diǎn)和拐點(diǎn)值作為檢測(cè)樣品的變量，用多頻大幅 脈沖智能化學(xué)分析系統(tǒng)的數(shù)據(jù)智能分析軟件進(jìn)行分析處理。
進(jìn)一步地，本發(fā)明所述的食品致病菌可以是金黃色葡萄球菌，所述多頻大 幅脈沖智能化學(xué)分析系統(tǒng)的傳感器陣列和脈沖激發(fā)頻率段為Wu電極的100Hz 頻率段、Pt電極的1Hz頻率段、Ag電極的10Hz頻率段、Ti電極的10Hz頻率段。
本發(fā)明所述的食品致病菌還可以是大腸桿菌0157:H7，所述多頻大幅脈沖 智能化學(xué)分析系統(tǒng)的傳感器陣列和脈沖激發(fā)頻率段為:Au電極的100Hz頻率段、 Pt電極的1Hz頻率段。
本發(fā)明所述的食品致病菌還可以是枯草芽孢桿菌，所述多頻大幅脈沖智能 化學(xué)分析系統(tǒng)的傳感器陣列和脈沖激發(fā)頻率段為Ba電極的lHz、 10Hz、 100Hz 三個(gè)頻率段。
更進(jìn)一步地，每個(gè)脈沖頻率段的脈沖幅度均從1.0 V開(kāi)始，然后每次變化 0.2V—直至U-1.0V，在兩個(gè)不同的頻率段之間插入5s時(shí)間間隔。
本發(fā)明采用多頻大幅脈沖作為激發(fā)掃描信號(hào)，檢測(cè)食品致病性細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò) 程的整體響應(yīng)信號(hào)，用多種不同的非修飾金屬電極組成三電極陣列系統(tǒng)的多頻 大幅脈沖傳感系統(tǒng)，示蹤各種菌的生長(zhǎng)與代謝規(guī)律。
本發(fā)明采用的多頻大幅脈沖智能化學(xué)分析系統(tǒng)，傳感器電極陣列可以包括 鉑電極、金電極、鈀電極、鎳電極、鎢電極、鈦電極作為工作電極，鉑電極作 為輔助電極，Ag/AgCl作為參比電極，組成的多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)三電極系統(tǒng)。
信號(hào)激勵(lì)采集裝置采用多頻大幅脈沖伏安法。多頻大幅脈沖激發(fā)電位由1
Hz、 10Hz和100Hz三個(gè)脈沖頻率段組成，分別相當(dāng)于脈沖時(shí)間間隔為ls， 0.1 s， 0.01 s的大幅脈沖伏安法。每個(gè)脈沖頻率段的大幅脈沖的脈沖幅度均采用相 同脈沖幅度變化，從1.0V開(kāi)始，然后每次變化0.2V—直到-1.0V。在兩個(gè)不同 的頻率段之間插入5s時(shí)間間隔，可以消除各個(gè)頻率間響應(yīng)遲滯的干擾。
智能分析單元采用多元統(tǒng)計(jì)分析中比較常用的統(tǒng)計(jì)方法，即主成分分析方 法(principal component analysis, PCA)對(duì)多頻大幅脈沖傳感系統(tǒng)采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行 處理，提取電流采集信號(hào)的頂點(diǎn)和拐點(diǎn)值作為檢測(cè)樣品的變量，通過(guò)主成分分 析方法獲得的得分圖，對(duì)不同的檢測(cè)樣品進(jìn)行區(qū)分、識(shí)別。首先，以行向量代 表樣品，縱向量代表變量把不同電極不同頻率段的數(shù)據(jù)分別保存成數(shù)據(jù)表格， 進(jìn)行主成分分析。然后，比較不同電極的主成分得分圖，在二維和三維平面上 比較各個(gè)電極在不同頻率下對(duì)樣品的區(qū)分效果，把主成分得分圖具有互補(bǔ)作用 的電極數(shù)據(jù)橫向疊加，重新組成以行向量代表樣品，縱向量代表變量的數(shù)據(jù)陣 列，最終尋找具有最好區(qū)分效果的主成分得分圖和電極數(shù)據(jù)疊加方式，尋找區(qū) 分這類(lèi)樣品最適合的電極陣列組合方式以及電極最適合的多頻脈沖頻率段，最 終確定適宜的2-3個(gè)電極及其脈沖頻率段作為監(jiān)測(cè)目的菌生長(zhǎng)狀況的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。
本發(fā)明采用多頻大幅脈沖智能化學(xué)分析系統(tǒng)對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期的菌群培養(yǎng)液 進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，采集液體培養(yǎng)基內(nèi)不斷變化的復(fù)雜成分多項(xiàng)綜合指標(biāo)的響應(yīng)信 息，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析中的主成分分析方法進(jìn)行相關(guān)信息分析，選擇出了適于 監(jiān)測(cè)細(xì)菌、特別是金黃色葡萄球菌、大腸桿菌0157:H7和枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)情 況的傳感器陣列和頻率段，大大增強(qiáng)了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。適于監(jiān)測(cè)金黃色葡 萄球菌生長(zhǎng)情況的傳感器陣列和頻率段為Wu電極的100Hz頻率段、Pt電極的 1Hz頻率段、Ag電極的10Hz頻率段、Ti電極的10Hz頻率段等。大腸桿菌O157:H7 的適宜傳感器陣列和頻率段為Au電極的100Hz頻率段、Pt電極的1Hz頻率段。
適于監(jiān)測(cè)枯草芽孢桿菌的傳感器陣列和頻率段為Ba電極的lHz、 10Hz、 100Hz
三個(gè)頻率段。
本發(fā)明是由一種可以檢測(cè)溶液整體品質(zhì)特征綜合信息為特點(diǎn)的現(xiàn)代化分析 檢測(cè)儀器_一基于電極陣列的多頻大幅脈沖傳感系統(tǒng)，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法 中的主成分分析方法，對(duì)食品致病性細(xì)菌生長(zhǎng)代謝綜合信息及其變化規(guī)律進(jìn)行 示蹤檢測(cè)構(gòu)成的。具有低選擇性、非特異性和交互敏感性、準(zhǔn)確、靈敏、經(jīng)濟(jì) 和快速等特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。


圖1是多頻大幅脈沖智能化學(xué)分析系統(tǒng)檢測(cè)金黃色葡萄球菌不同時(shí)期培養(yǎng) 液的主成分得分圖；其中，(a)Wu電極在100Hz頻率段的主成分得分圖；(b) Pt 電極在1Hz頻率段的主成分得分圖；(c)Ag電極在10Hz頻率段的主成分得圖； (d)Ti電極在10Hz頻率段的主成分得分圖。
圖2是多頻大幅脈沖智能化學(xué)分析系統(tǒng)檢測(cè)大腸桿菌0157:H7不同時(shí)期培 養(yǎng)液的主成分得分圖；其中，(a)Pt電極在lHz頻率段的主成分得分圖；(b)Au 電極在100Hz頻率段的主成分得分圖3是多頻大幅脈沖智能化學(xué)分析系統(tǒng)檢測(cè)枯草芽孢桿菌不同時(shí)期培養(yǎng)液 的主成分得分圖；其中，(a)Ba電極在lHz頻率段的主成分得分圖；(b)Ba電極 在10Hz頻率段的主成分得分圖；(c)Ba電極在100Hz頻率段的主成分得分圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)情況分析
將金黃色葡萄球菌菌種接種于1%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中，靜止培養(yǎng)18~24h，
制備種子液。
將種子液分別等量轉(zhuǎn)接于裝有50 ml 1%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基的三角瓶中，37 。C下分另贈(zèng)養(yǎng)0h、 lh、 2h、 3h、 4h、 5 h、 6h、 7 h、 8h、 9h、 10 h、 11 h、 12 h、 13 h、 24h、 30h后，對(duì)培養(yǎng)液10(TC、 40min水浴滅活。
用多頻大幅脈沖智能化學(xué)分析系統(tǒng)對(duì)滅活后的培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)。傳感器陣 列選用Wu電極、Pt電極、Ag電極、Ti電極為工作電極，鉑電極作為輔助電極， Ag/AgCl作為參比電極。
多頻大幅脈沖激發(fā)電位由1 Hz、 10Hz和100Hz三個(gè)脈沖頻率段組成，分 別相當(dāng)于脈沖時(shí)間間隔為1 s， 0.1 s， 0.01 s的大幅脈沖伏安法。每個(gè)脈沖頻率段 的大幅脈沖的脈沖幅度均采用相同脈沖幅度變化，從1.0V開(kāi)始，然后每次變化 0.2V—直到-1.0 V。在兩個(gè)不同的頻率段之間插入5s時(shí)間間隔，可以消除各個(gè) 頻率間響應(yīng)遲滯的干擾。
將智能化學(xué)分析系統(tǒng)的傳感器陣列放入培養(yǎng)Oh、 lh、 2h、 3h、 4h、 5h、 6 h、 7h、 8h、 9h、 10h、 11 h、 12h、 13 h、 24h、 30h后并已滅活的培養(yǎng)液中， 在工作電極上施加電壓，對(duì)傳感器陣列中的每個(gè)工作電極進(jìn)行一次脈沖序列。 連續(xù)測(cè)試三次，數(shù)據(jù)求平均值，每檢測(cè)完一個(gè)被測(cè)液體后，對(duì)電極陣列打磨， 蒸餾水沖洗；參比電極用蒸餾水清洗，然后用濾紙吸干。
用主成分分析方法(principal component analysis, PCA)對(duì)多頻大幅脈沖傳感 系統(tǒng)采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，提取電流采集信號(hào)的頂點(diǎn)和拐點(diǎn)值作為檢測(cè)樣品的 變量，通過(guò)主成分分析方法獲得的得分圖，對(duì)不同的檢測(cè)樣品進(jìn)行區(qū)分、識(shí)別。 首先，以行向量代表樣品，縱向量代表變量把不同電極不同頻率段的數(shù)據(jù)分別 保存成數(shù)據(jù)表格，進(jìn)行主成分分析。然后，比較不同電極的主成分得分圖，在 二維和三維平面上比較各個(gè)電極在不同頻率下對(duì)樣品的區(qū)分效果，把主成分得 分圖具有互補(bǔ)作用的電極數(shù)據(jù)橫向疊加，重新組成以行向量代表樣品，縱向量 代表變量的數(shù)據(jù)陣列，最終尋找具有最好區(qū)分效果的主成分得分圖和電極數(shù)據(jù) 疊加方式，尋找區(qū)分這類(lèi)樣品最適合的電極陣列組合方式以及電極最適合的多
頻脈沖頻率段，最終確定Wu電極100Hz頻率段、Pt電極1Hz頻率段、Ag電極 10Hz頻率段、Ti電極10Hz頻率段作為監(jiān)測(cè)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)狀況的監(jiān)測(cè)系 統(tǒng)。
如圖1所示，(a)Wu電極在100Hz頻率段的主成分得分圖；(b) Pt電極在1Hz 頻率段的主成分得分圖；(c)Ag電極在10Hz頻率段的主成分得圖；(d)Ti電極在 10Hz頻率段的主成分得分圖。
從圖1中(a)，可以看出Wu電極在100Hz頻率段主要是在成分二上體現(xiàn)出 來(lái)的一個(gè)生長(zhǎng)趨勢(shì)。(d)中顯示Ti電極的10Hz頻率段在成分二上有明顯的生長(zhǎng) 趨勢(shì)；(b)和(c)，表明Pt電極的1Hz頻率段和Ag電極的10Hz頻率段在成分一 上有顯著的生長(zhǎng)趨勢(shì)。0h時(shí)的樣品是剛接種未培養(yǎng)就滅活的，它與其它生長(zhǎng)時(shí) 期的樣品有較大的離散度，這表明了金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)代謝對(duì)培養(yǎng)基產(chǎn)生 了很大的影響；從lh到8h左右，樣品的離散度也很大，這主要是因?yàn)榻瘘S色 葡萄球菌在培養(yǎng)2h后逐漸進(jìn)入了對(duì)數(shù)期，生長(zhǎng)代謝特別旺盛所造成的；9h后金 黃色葡萄球菌生長(zhǎng)進(jìn)入了穩(wěn)定期，生長(zhǎng)與衰亡基本保持平衡，所以后面到30h 時(shí)的樣品的離散度較小。在這些主成分得分圖中很容易看到金黃色葡萄球菌的 生長(zhǎng)。與傳統(tǒng)的濁度法測(cè)得結(jié)果進(jìn)行比較，完全吻合，同是在8h-9h逐漸進(jìn)入穩(wěn) 定期，而且都可以表明之前的生長(zhǎng)及代謝很旺盛。因此多頻大幅脈沖傳感系統(tǒng) 在監(jiān)測(cè)液體培養(yǎng)基里的金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)情況是可行的。
實(shí)施例2:大腸桿菌0157:H7生長(zhǎng)情況分析
將大腸桿菌Q157:H7菌種接種于1%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中，靜止培養(yǎng)
18~24h，制備種子液。
將種子液分別等量轉(zhuǎn)接于裝有50mll。/。葡萄糖肉湯培養(yǎng)基的三角瓶中，分別 培養(yǎng)Oh、 lh、 2h、 3h、 4h、 5 h、 6h、 7h、 8 h、 9h、 10 h、 11 h、 12 h、 13 h、 24h、 30h后，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行滅活。
用多頻大幅脈'沖智能化學(xué)分析系統(tǒng)對(duì)滅活后的培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)。傳感器陣 列選用Pt電極、Au電極為工作電極，鉑電極作為輔助電極，Ag/AgCl作為參比 電極。
脈沖電壓、脈沖頻率、脈沖間隔時(shí)間、檢測(cè)方法和信號(hào)分析方法與具體實(shí) 施例1相同。
最終確定Pt電極1Hz頻率段、Au電極100Hz頻率段作為監(jiān)測(cè)大腸桿菌 0157:H7生長(zhǎng)狀況的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。
如圖2所示，多頻大幅脈沖智能化學(xué)分析系統(tǒng)檢測(cè)大腸桿菌0157:H7不同 時(shí)期培養(yǎng)液的主成分得分圖；其中，(a)Pt電極在lHz頻率段的主成分得分圖； (b) Au電極在100Hz頻率段的主成分得分圖。
在圖2中Pt電極的1Hz頻率段、Au電極的100Hz頻率段的主成分得分圖 是比較相似的。都是在前6h的時(shí)候在主成分得分圖上的離散度是較大的，而在 6h和7h有一個(gè)拐點(diǎn)，且7h后它們的離散度較小。這說(shuō)明了大腸桿菌0157:H7 的生長(zhǎng)在前五個(gè)小時(shí)對(duì)培養(yǎng)的影響特別大，也就是說(shuō)大腸桿菌0157:H7的生長(zhǎng) 在這個(gè)階段特別活躍；而7h后它的生長(zhǎng)逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期。從得分圖中可以了解 到大腸桿菌0157:H7的生長(zhǎng)一般在培養(yǎng)6h-7h左右達(dá)到了頂峰，培養(yǎng)基里的菌 體繁殖最快，代謝最旺盛。 實(shí)施例3:枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)情況分析
將枯草芽孢桿菌菌種接種于1%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中，靜止培養(yǎng)18~24h，制 備種子液。
將種子液分別等量轉(zhuǎn)接于裝有50ml 1%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基的三角瓶中，分別 培養(yǎng)Oh、 lh、 2h、 3h、 4 h、 5 h、 6h、 7h、 8h、 9h、 10 h、 11 h、 12 h、 13 h、 24 h、 30h后，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行滅活。
用多頻大幅脈沖智能化學(xué)分析系統(tǒng)對(duì)滅活后的培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)。傳感器陣 列選用Ba電極為工作電極，鉑電極作為輔助電極，Ag/AgCl作為參比電極。
脈沖電壓、脈沖頻率、脈沖間隔時(shí)間、檢測(cè)方法和信號(hào)分析方法與具體實(shí) 施例l相同。
最終確定Ba電極1Hz頻率段、10Hz頻率段、100Hz頻率段作為監(jiān)測(cè)枯草 芽孢桿菌生長(zhǎng)狀況的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。
如圖3所示，多頻大幅脈沖智能化學(xué)分析系統(tǒng)檢測(cè)枯草芽孢桿菌不同培養(yǎng) 時(shí)期培養(yǎng)液的主成分得分圖；其中，(a)、 (b) 、 (c)分別是Ba電極在1Hz頻率段、 10Hz頻率段、100Hz頻率段上的主成分得分圖。
從圖3可以看出，由于Oh時(shí)的樣品未經(jīng)培養(yǎng)，所以它與其他樣品的離散度 相對(duì)較大。Ba電極的10Hz頻率段和100Hz的主成分得分圖顯示枯草芽孢桿菌 在1%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)到4h左右進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期。在三張主成分得分 圖中，我們可以看出llh前的樣品離散度都較大，即在這個(gè)時(shí)間段里枯草芽孢 桿菌的生長(zhǎng)對(duì)培養(yǎng)基的影響活躍。而后面的時(shí)間段的樣品的離散度相對(duì)較小， 說(shuō)明枯草芽孢桿菌逐漸進(jìn)入了穩(wěn)定期。
本發(fā)明采用的多頻大幅脈沖傳感智能化學(xué)分析系統(tǒng)將常規(guī)大幅脈沖拓展到 三種頻率，并且以主成分分析方法為數(shù)據(jù)處理手段，在監(jiān)測(cè)食源性致病菌的生 長(zhǎng)趨勢(shì)中所獲得的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法(濁度法)基本一致。并且和其它方法比較，
它具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、性能穩(wěn)定、信息量豐富、易智能化、使用壽命長(zhǎng)、成本低廉、 快速簡(jiǎn)便等獨(dú)有特點(diǎn)。從多頻大幅脈沖傳感系統(tǒng)監(jiān)測(cè)液體培養(yǎng)基里的金黃色葡
萄球菌、大腸桿菌0157:H7和枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)情況的研究結(jié)果表明，多頻大幅 脈沖傳感系統(tǒng)在監(jiān)測(cè)、分析、區(qū)分以及快速檢測(cè)食源性致病微生物方面有很大 的應(yīng)用前景。
當(dāng)然，本技術(shù)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，以上的實(shí)施例僅是用來(lái) 說(shuō)明本發(fā)明，而并非作為對(duì)本發(fā)明的限定，只要在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)，對(duì)以 上所述實(shí)施例的變化、變型都將落在本發(fā)明權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種示蹤食品致病性細(xì)菌生長(zhǎng)的檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟a.將待測(cè)菌種接種于1％葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中，靜止培養(yǎng)18小時(shí)，制備種子液；b.將種子液分別等量轉(zhuǎn)接于裝有50ml 1％葡萄糖肉湯培養(yǎng)基的三角瓶中，分別培養(yǎng)0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、24h、30h后，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行滅活；c.在多頻大幅脈沖智能化學(xué)分析系統(tǒng)的信號(hào)激勵(lì)采集裝置上位機(jī)上選擇信號(hào)激勵(lì)采集裝置所需的電壓、脈沖頻率、脈沖間隔時(shí)間；d.把多頻大幅脈沖智能化學(xué)分析系統(tǒng)的傳感器陣列浸入培養(yǎng)液中，所述的傳感器陣列以鉑電極、金電極、鈀電極、鎳電極、鎢電極、鈦電極等非修飾金屬電極作為工作電極，鉑電極作為輔助電極，Ag/AgCl作為參比電極；e.在工作電極上施加電壓，對(duì)傳感器陣列中的每個(gè)工作電極進(jìn)行一次脈沖序列；f.采集電流響應(yīng)信號(hào)，提取頂點(diǎn)和拐點(diǎn)值作為檢測(cè)樣品的變量，用多頻大幅脈沖智能化學(xué)分析系統(tǒng)的數(shù)據(jù)智能分析軟件進(jìn)行分析處理。
2. 如權(quán)利要求1所述的示蹤食品致病性細(xì)菌生長(zhǎng)的檢測(cè)方法，其特征在于所述 的食品致病菌為金黃色葡萄球菌，所述多頻大幅脈沖智能化學(xué)分析系統(tǒng)的傳感 器陣列和脈沖激發(fā)頻率段為Wu電極的100Hz頻率段、Pt電極的lHz頻率段、 Ag電極的10Hz頻率段、Ti電極的10Hz頻率段。
3. 如權(quán)利要求1所述的示蹤食品致病性細(xì)菌生長(zhǎng)的檢測(cè)方法，其特征在于所述 的食品致病菌為大腸桿菌0157:H7，所述多頻大幅脈沖智能化學(xué)分析系統(tǒng)的傳 感器陣列和脈沖激發(fā)頻率段為Au電極的100Hz頻率段、Pt電極的1Hz頻率段。
4、 如權(quán)利要求1所述的示蹤食品致病性細(xì)菌生長(zhǎng)的檢測(cè)方法，其特征在于所述 的食品致病菌為枯草芽孢桿菌，所述多頻大幅脈沖智能化學(xué)分析系統(tǒng)的傳感器 陣列和脈沖激發(fā)頻率段為Ba電極的lHz、 10Hz、 100Hz三個(gè)頻率段。
5. 如權(quán)利要求1、或2、或3、或4所述的示蹤食品致病性細(xì)菌生長(zhǎng)的檢測(cè)方法， 其特征在于每個(gè)脈沖頻率段的脈沖幅度均從1.0 V開(kāi)始，然后每次變化0.2V — 直至IJ-1.0V，在兩個(gè)不同的頻率段之間插入5s時(shí)間間隔。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種低選擇性、非特異性、交互敏感性為特點(diǎn)的準(zhǔn)確、靈敏、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)和快速示蹤食品致病性細(xì)菌生長(zhǎng)及其代謝綜合信息的快速檢測(cè)方法，包括菌種接種，分別培養(yǎng)不同時(shí)間后，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行滅活；用多頻大幅脈沖智能化學(xué)分析系統(tǒng)對(duì)滅活后的培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)，采集響應(yīng)信號(hào)并對(duì)該信號(hào)進(jìn)行分析等步驟。用基于多頻大幅脈沖伏安法為原理的智能多頻脈沖掃描儀為儀器結(jié)合一個(gè)包括工作電極陣列的三電極體系，能夠低選擇性、非特異性、交互敏感性的采集食品致病性細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程的綜合信息，再結(jié)合主成分分析方法處理采集的信息，能簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏地示蹤食品致病性細(xì)菌的生長(zhǎng)與代謝。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK101339153SQ20081006319
公開(kāi)日2009年1月7日 申請(qǐng)日期2008年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月28日
發(fā)明者田師一, 趙廣英, 鄧少平, 黃建鋒 申請(qǐng)人:浙江工商大學(xué)