專利名稱：：大豆7S球蛋白(α+β)亞基缺失型種質(zhì)的α-亞基基因的特異性序列片斷的制作方法大豆7S球蛋白(oc+p)亞基缺失型種質(zhì)的oc-亞基基因的特異性序列片斷.
技術(shù)領(lǐng)域：
.本發(fā)明涉及一種大豆蛋白的棊因序列片斷。
背景技術(shù)：
：7S球蛋白是大豆種子貯藏蛋白的重要組分之一，大豆7S球蛋白亞基組成的不同直接影響大豆蛋白的營養(yǎng)品質(zhì)和加工特性。大豆7S球蛋白也稱P-伴大豆球蛋白，是由a'-(76kDa),a-(72kDa)禾Q卩-(52-54kDa)三個亞基組成的分子量為150kDa的三聚體化合物，具有天然的降血脂和降低血清膽固醇含量的保健功能。近年的研究結(jié)果表明大豆7S球蛋白的a-亞基是大豆蛋白的主要過敏源之一，但現(xiàn)有技術(shù)不能夠?qū)崿F(xiàn)在分子水平上調(diào)控大豆7S球蛋白o(hù)c-亞基的表達(dá)
發(fā)明內(nèi)容.本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)不能在分子水平上調(diào)控大豆7S球蛋白o(hù)c-亞基的表達(dá)的問題，而提供大豆7S球蛋白(oc+p)亞基缺失型種質(zhì)的a-亞基基因的特異性序列片斷。大豆7S球蛋白(cc+(3)亞基缺失型種質(zhì)的oc-亞基基因的特異性序列片斷長度為1379bp，基因序列如SEQIDNO.l所示。本發(fā)明成功的制備出與大豆7S球蛋白(a+p)亞基缺失型種質(zhì)a-亞基缺失特性相關(guān)的ot-亞基基因的特異性序列片斷，實(shí)現(xiàn)了在分子水平上調(diào)控大豆7S球蛋白o(hù)t-亞基的表達(dá)。(a+P)-亞基缺失型與日E(^基表現(xiàn)正常型)的部分a-亞基基因擴(kuò)增片段的序列(NCBI序列號為GeneBank:M36686)進(jìn)行比較，日E(亞基表現(xiàn)正常型)與(a+p)-亞基缺失型之間相同的核苷酸同源性為90.9%。具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式一本實(shí)施方式按照如下方法制備大豆7S球蛋白(a+j3)亞基缺失型種質(zhì)的ot-亞基基因的特異性序列片斷一、大豆7S球蛋白a-亞基缺失突變體的分析確認(rèn)(SDS-PAGE梯度電泳法)a、稱取5mg的大豆粉，加入0.5mL的抽提緩沖液(0.05M鹽酸緩沖液(Tris-HCl,pH8.0)，0.2%十二烷基硫酸鈉(SDS)，5M尿素(Urea))充分混勻，在室溫條件下靜置過夜，加入10pL的巰基乙醇，混勻，在4'C的條件下以14000r/min的速度離心15min,取20pL上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳與考馬斯亮藍(lán)染色；b、凝膠制備(1)分離膠11.98%的分離膠配方如表1所示，依表中順序加入試劑，攪拌均勻，最后加入N，N，N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)，混勻后快速灌入裝好的玻璃板內(nèi)，用膠頭滴管加入一水層，等待分離膠凝固大約IO分鐘，凝固后倒掉水層；'表1<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(2)聚合膠4.38%的聚合膠配方如表2所示，藥品配制步驟同分離膠，最后加入TEMED，混勻后快速灌在分離膠上，插入梳子，等待其凝固大約15分鐘，小心拔出梳子，待用；.表2.<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>c、電泳將聚丙烯酰胺膠板固定于電泳槽上。加lxTAE于電泳槽內(nèi)，確保電泳槽內(nèi)不漏液。用微量移液器取1015pL上清液，點(diǎn)入點(diǎn)樣孔內(nèi)，待所有的材料點(diǎn)樣完成后，開動電泳儀，先將電泳儀的電流調(diào)到15mA進(jìn)行15分鐘，后調(diào)到30mA進(jìn)行40-60分鐘；d、染色、脫色電泳結(jié)束后，先卸板，將板上部的聚合膠去除，切角(目的記住點(diǎn)樣順序)，然后放到染色劑中染色30min，染色結(jié)束后換成脫色劑脫色數(shù)小時直至條帶清晰。染色、脫色過程需在搖床上進(jìn)行；e、譜帶分析用BIO-IDImage軟件對圖象進(jìn)行處理、分析，根據(jù)各譜帶峰面積的大小，分析每個電泳樣品的蛋白質(zhì)^a成，計(jì)算a-亞基的相對含量。二、大豆種子基因組DNA的提取a、取經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)確認(rèn)過亞基表現(xiàn)的大豆種子，去掉種皮，研磨成粉末狀，稱取20mg的豆粉裝入1.5mL的離心管內(nèi)；b、加入DNA提取液(pH值為7.8，具體成分見表3)40(^L和6^iL的蛋白酶K浸透粉末，倒轉(zhuǎn)離心管，使粉末充分散開。然后在55。C水浴中保溫20min;表3<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>c、加入400mLPCI溶液(pH值為7.8，具體成分見表4)充分混勻，然后在4。C的條件下以12000r/min的速度離心5min;表4<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>d、取上清液放入1.5mL的離心管中，加入400nL的異丙醇，混勻后室溫下靜置30min，再在4。C的條件下以12000r/min的速度離心5min;e、棄去上清液，加入400pL的TE(Tris-HCl和乙二胺四乙酸(EDTA)的混合液，具體成分如表5所示)溶解后在4。C的條件下以12000r/min的速度離心3min;表5<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>f、取上清液放入1.5mL的離心管中，加入2pLRNA酶在37。C的水浴保溫30min，再加入40pL的濃度為3mol/L的NaAC溶液和lmL的巰基乙醇，混勻后在室溫下靜置10min，然后在4。C的條件下以12000r/min的速度離心5min，棄去上清液，加入lmL的質(zhì)量濃度為7(P/。的酒精，然后在4"C的條件下以12000r/min的速度離心5min，再次棄去上清液后在4°C的條件下以12000r/min的速度離心5min，再棄去上清液;g、將離心管倒置在吸水紙上，自然干燥至上清液消失，再加200pL的無菌去離子水溶解，4。C保存；即得到大豆種子基因組的DNA。三、用PCR反應(yīng)制備(a+(3)亞基缺失型種質(zhì)的a-亞基基因的特異性序列片斷oc-亞基基因的特異性弓I物序列正向弓I物CTTCAATCTGGTGATGCCCT反向引物CAAAGGACCCTTTCTTCCCTPCR反應(yīng)體系如表6所示，反應(yīng)程序如表7所示表6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表7<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>三、將PCR'產(chǎn)物用EZ-10spincolumnDNA回收試劑盒(上海生工出品)進(jìn)行切出與純化a、加入48mL質(zhì)量濃度為99%乙醇于洗脫液中待用；將洗脫緩沖溶液放到55"C的水浴鍋中預(yù)熱；'b、稱量1.5mL離心管，記錄重量；c、切膠，并將DNA膠移至稱量好重量的1.5mL離心管內(nèi)，再稱重量，計(jì)算出膠塊的重量；d、按每100mg膠塊加400pL結(jié)合緩沖液II(BindingbufferII)的比例加入結(jié)合緩沖液II(BindingbufferII)，再放入506(TC的水浴10min，期間每隔3min上下顛倒離心管直至凝膠完全溶解；e、溶解的凝膠加到EZ-10柱中，在375(TC的恒溫金屬浴中靜置2min后以8000r/min的速度離心lmin，棄離出液;'f、加入500^L的洗脫液(ElutionBuffer)到上步的'EZ-IO柱中，再以8000r/min離心lmin棄離出液，重復(fù)本步驟一次；g、再以10，000r/min的速度離心lmin，棄離出液；h、將上步的EZ-10柱放到一個新的1.5mL離心管中，在柱的中心加入3050)iLS5。C預(yù)熱的洗脫緩沖液，在3750。C的恒溫金屬浴中靜置2min，再以10000r/min的速度離心lmin，然后回收DNA，放到-20。C中保存。四、大腸桿齒感受態(tài)細(xì)胞的制備a、取DH-5ot大腸桿菌原種，于LB瓊脂板上劃線培養(yǎng)(過夜)；b、挑取新鮮單菌落，接種于30mL的LB培養(yǎng)基中，37。C震蕩培養(yǎng)過夜；c、取對數(shù)生長期的菌液，按1/100的稀釋比例接種于50mL的LB液體培養(yǎng)基中，'繼續(xù)培養(yǎng)至OD6oo為0.40.5;d、菌液冰浴"min,分.裝于1.5mL無菌離心管中，在4。C的條件下以4000r/min的速度離心6min，收集細(xì)菌沉淀；e、加入600pL的冰預(yù)冷無菌的0.1mol/L的CaCl2溶液，懸浮細(xì)菌沉淀，在冰浴條件下保溫30min，再在4°C的條件下以4000r/min的速度離心10min，收集細(xì)菌沉淀；'f、每管加入100pL冰浴冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，重懸細(xì)菌沉淀，即為感受態(tài)細(xì)胞，在4'C下保存；五、目的片段的連接反應(yīng).a、PCR產(chǎn)物濃度需確保為0.2pmol/L，體系最終用去離子水調(diào)整至終體積為10iaL，反應(yīng)體系如表8所示，其中T4QNA連接酶應(yīng)最后加入;b、連接產(chǎn)物在16'C的金屬浴中過夜；表8.<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>六、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌a、向在16。C過夜的連接產(chǎn)物內(nèi)加入l^iL、5mol/L的NaCl溶液中，用槍頭輕輕混勻，加入100pL的感受態(tài)細(xì)胞，混勻后在冰上放置30min，再放42°C的水浴中熱'激45s后，迅速置于冰上冷卻2min;b、加入90(HiL的LB液體培養(yǎng)基，，在37。C的水浴中以100r/min的速度振蕩培養(yǎng)1.5h;c、將200mg/mL異丙基-(3-D-硫代半乳糖苷(IPTG，具體成分如表9所示)和Mmg/mL5-溴4-氯-3-卩引哚-P-D-半乳糖苷(X-gal，具體成分如表10所示)依次均勻涂布于^"有抗生素(100mg/mL的氨芐青霉素(Amp))的預(yù)先制備好的LA培養(yǎng)基上，待用。表9藥品.劑量IPTG2g<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>d、將培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管內(nèi)，收集細(xì)菌沉淀，并將菌液均勻涂布于LA板上，37。C倒置培養(yǎng)14~16小時；七、克隆產(chǎn)物的篩選a、藍(lán)、白斑確認(rèn)選擇LA板上白色單一菌落，編好序號，轉(zhuǎn)移至新LA板上；'b、重組質(zhì)粒的篩選和鑒定，'質(zhì)粒檢測PCR反應(yīng)體系如表11所示，PCR反應(yīng)程序如表12所示，質(zhì)粒篩選通用引物序列為正向弓I物5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'反向引物5'-AGAGGATAACAATTTCACACAGGA-3'表11<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>八、質(zhì)粒DNA的制備堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA(采用EZ—IOSpinColumn質(zhì)粒DNA提取試劑盒)a、將洗脫緩沖液放到375(TC的水浴中待用；檢查SolutionII是否有沉淀，若有，37"保溫至沉淀溶解，加RNaseA溶液(具體成分如表13所示)到SolutionI中混勻，在4。C保存，加入48mL、濃度為96%~100%的乙醇到12mL的洗脫液中混勻；<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>b、挑取一個PCR檢測為陽性的單菌落在10mL的LA液體培養(yǎng)基中、37"C的條件下振蕩培養(yǎng)過夜；c、取2個1.5mL離心管，每管加入1.5mL的過夜培養(yǎng)的菌液，在4"C的條件下以12000r/min的速度離心lmin，除去上清液，重復(fù)此步驟35次；d、加入200^iL的SolutionI到離心管中，振蕩至懸浮，靜置2min，再加入400pL的SolutionII，上下顛倒46次，室溫靜置lmin，然后加入700pL的SolutionIII，輕緩混勻，室溫靜置2min，然后以12000r/min的速度離心5min;e、取上清液于EZ—10柱中，室溫靜置lmin，以8000r/min的速度離心lmin，棄掉離出液，再加入500pL的洗脫液到EZ—10柱中，以8000r/min的速度離心lmin，棄掉離出液，.然后加入50(HiL的洗脫液到EZ—10柱中，以8000r/min的速度離心lmin，棄掉離出液，再以10000r/min的速度離心lmin，棄掉離出液；f、把EZ—10柱放到一個新的1.5mL離心管中，加50pL的洗脫緩沖液到EZ—10柱的中心處，室溫靜置2min，再以10/000r/min的速度離心2min，回收質(zhì)粒DNA，將獲得的質(zhì)粒DNA放到-20。C保存；九、將PCR檢測呈陽性的菌株進(jìn)行測序，即得到大豆7S球蛋白(a+卩)亞基缺失型種質(zhì)的oc-亞基基因的特異性序列片段，長度為i379bp，基因序列如下所示<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>序列表<110〉劉珊珊-〈120大豆7S球蛋白(a+(3)亞基缺失型種質(zhì)的a-亞基基因的特異性序列片斷<160>5<210>1<211>1379<212>DNA<213>人工序列<220><223>大豆73球蛋白(a+P)亞基缺失型種質(zhì)的qc-亞基基因的特異性序列片斷<400>1.gtgatgccctaagcagctccctgcaggaaccttcaatctgctgacaa&gagatUgaggtcaaatcttaagctccagtagcgacccgtttccgcgcggggggttctgaagatcaagttgtttcagtgttgtgcactttcttcctttgttcacgtactagtgacggcgaacg3tactgaatttctcatattttgttttattaatt犯tttgaaggcgttccctggttgtggatgccgagaatctcactacttattgatcaatcttcctacttgcaacaccatctattgattttatcagcaacaag已ttcgggaacgagattacccg3t3tgCgtt3gttsgagtttgggtatttgtaatttgcttttgg3tatcacgatacatgtgagtctgcai61tcagcctcagag3tg3t^ctttataacttttcttttctgttcagcatacgctagc8g3CCattggggtg3gCaC3acttgsggaaacct已ttcagctctt-tttaggcaaacgccctttgCCC3gC3ggttatcaatgcccatagctgac33tgtgataag3ta"ttg3gacaggcactcgccataattaattaactgcagagttgt3ttcaaattcaatagctgcagtgccaaatctccgcgaccccccctcagctt3aaa3ctg3ttgagactttctgccacactattgaacttggaagtgcggatatccagttggagaacccatgctgttgatgagctatttgccagataccacctaataaacacatact3tacccgttaacttattattcttcttcctatctagaggcctcttatcattatcaaggttcgtgattgagttcaaggatctattccacgggacttgg3ta^tg3ttcaattcaaattggcattaatggtccgcagaggaacttagtgUgttactaatccttttagtc3gtggagccaaagtgtggttaacc60acccggta120aatttgUtc180tagcactc240atacgacgta300ccttatattt360tgtttggtag420tggaaatctc480agaccatttc540tcgcttgg600atgtcttcct660gagttctatt720ttactttttt780ggcc由gtg840agaacaacaa900tgaattgtct960tacctcagat1020cttgcaggta1080cUtUUgt1140ggtgattgaa1200caggagcttg1260gagtcctact1320ggtcctttg1379,<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>a:亞基基因特異性的正向引物<400>2cttcaatctggtgatgccct20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>a-亞基基因特異性的反向引物<400>3caaaggaccctttcttccct20<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>.<223>質(zhì)粒篩選通用的正向引物<400>4cgccagggttttcccagtcac.gac24<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>質(zhì)粒篩選通用的反向引物<400>5agaggataacaatttcacac3gga2權(quán)利要求1、大豆7S球蛋白(α+β)亞基缺失型種質(zhì)的α-亞基基因的特異性序列片斷，其特征在于大豆7S球蛋白(α+β)亞基缺失型種質(zhì)的α-亞基基因的特異性序列片斷如下所示CTTCAATCTGGTGATGCCCTAAGCAGCTCCCTGCAGGAACCACATACTATGTGGTTAACCCTGACAACGACGAGAATCTCAGAATGAIAACACTCGCCATACCCGTTAACAAACCCGGTAGATTTGAGGTACTACTTATTCTTTATAACTAATTAATTAATTATTATTCTAATTTGTTTCCAAATCTTAAGATCAATCTTTTTCTTTTCTCTGCAGAGTTTCTTCCTATCTAGCACTCAAGCTCAACAGTCCTACTTGCAAGGGTTCAGCAAGAATATTCTAGAGGCCTCATACGACGTAAGCGACCAACACACCATCTAATACGCTAGCAAATTCAATATTATCATTATCCTTATATTTGTTTCCGCGCTTGATTTTATAGACCAAATTCGAGGAGATAAACAAGGTTCTGTTTGGTAGAGAGGAGGGGCAGCAACAAGGGGAGGAGAGGCTGCAAGAGAGTGTGATTGTGGAAATCTCAAAGAAACAAATTCGGGAACTGAGCAAACATGCCAAATCTAGTTCAAGGAAGACCATTTCTTCTGAAGATAAACCTTTCAACTTGAGAAGCCGCGACCCCATCTATTCCATCAAGCTTGGCAAGTTGTTTGAGATTACCCCAGAGAAAAACCCTCAGCTTCGGGACTTGGATGTCTTCCTCAGTGTTGTGGATATGAACGAGGTAAGCAGAAAAACTGAACATGACAATTGAGTTCTATTCACTTTCTTCTTAGTTAGAGAAACCTATTCTTGAGACTTTAAATAATGATTTACTTTTTTCTTTGTTCACAAATATAGGGAGCTCTTTTTCTGCCACACTTCAATTCAAAGGCCATAGTGGTACTAGTGATTAATGAAGGAGAAGCAAACATTGAACTTGTTGGCATTAAAGAACAACAACAGAGGCAGCAACAGGAAGAGCAACCTTTGGAAGTGCGGAAATATAGAGCTGAATTGTCTGAACAAGATATATTTGTAATCCCAGCAGGTTATCCAGTTGTGGTCAACGCTACCTCAGATCTGAATTTCTTTGCTTTTGGTACAATGCCGAGAACAACCAGAGGAACTTCTTGCAGGTACATATTTTGTATATCACGATCAAATAGAACATGCTGTTGAAGTGTTGTTACTTTTTTTGTTTTATTAATTACATGTGAAACATAGCTGACTGAGCTATTTCTAATCCTTTGGTGATTGAAAATTTGAAGGTTCGAAAGACAATGTGATAAGCCAGATACCTAGTCAAGTGCAGGAGCTTGCGTTCCCTGGGTCTGCAAAAGATATTGAGAACCTAATAAAGAGCCAAAGTGAGTCCTACTTTGTGGATGCTCAGCCTCAGCAGAAAGAGGAGGGGAACAAGGGAAGAAAGGGTCCTTTG。全文摘要大豆7S球蛋白(α+β)亞基缺失型種質(zhì)的α-亞基基因的特異性序列片斷，它涉及一種大豆蛋白的基因序列片斷。本發(fā)明是解決了現(xiàn)有技術(shù)不能在分子水平上調(diào)控大豆7S球蛋白α-亞基的表達(dá)的問題。本發(fā)明利用PCR獲得大豆7S球蛋白(α+β)亞基缺失型種質(zhì)的α-亞基基因的特異性序列片斷，大豆7S球蛋白(α+β)亞基缺失型種質(zhì)的α-亞基基因的特異性序列片斷長度為1379bp。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了在分子水平上調(diào)控大豆7S球蛋白α-亞基的表達(dá)。文檔編號C12N15/10GK101363023SQ20081006456公開日2009年2月11日申請日期2008年5月23日優(yōu)先權(quán)日2008年5月23日發(fā)明者劉珊珊,張永強(qiáng),李文濱申請人:劉珊珊