專利名稱：乳源抗高血壓7肽串聯(lián)基因及其合成方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基因工程技術，具體涉及的是采用基因工程手段設計、合成的乳源抗高 血壓7肽串聯(lián)基因，該基因可在畢赤酵母中高水平表達，其表達產物經胰蛋白酶酶切后可形 成單一的N端和C端都完整的乳源抗高血壓7肽。(二) 背景技術高血壓是一種慢性的心腦血管疾病，是冠心病，腦卒中等心腦血管疾病的主要危險因素。 據統(tǒng)計，全世界每年因高血壓引起的心腦血管疾病的死亡人數(shù)超過1200萬，高血壓病己成為 人類健康的第一殺手，成為全球性的重大的公共衛(wèi)生問題。目前，世界衛(wèi)生組織(WHO)批準 用于治療高血壓病的一線藥物主要有利尿劑、e受體阻斷劑、血管緊張素轉換酶抑制劑 (ACEI)、鈣通道阻滯劑(CaA)、 a受體阻斷劑、血管緊張素(Ang)受體拮抗劑等六大類。研究表明，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在機體的血壓調節(jié)過程中起著十分重要的作用。 在該系統(tǒng)中，ACE酶是血壓調節(jié)過程中一個關鍵的酶，它可以將無活性的血管緊張素I(AngI) 水解生成具有血管收縮作用的血管緊張素II(AngII)，從而導致血管收縮，機體的血壓升高。 ACEI可抑制ACE酶的活性，從而抑制了 Angl向AngII的轉化，使機體血壓維持恒定。因此， ACEI在治療高血壓病中的應用也越來越廣泛。但是使用藥物治療都有一定的副作用，所以， 尋找安全的、天然的、食物來源的ACEI物質來治療高血壓引起了廣大科學家們極大的關注。有研究報道，在牛乳酪蛋白的胰蛋白酶水解物中分離到了一些在體外具有ACE酶抑制活 性、經動物實驗(體內實驗)證明具有降低血壓作用的抗高血壓生物活性肽。這一研究結果引 起了科學家們的極大興趣，極大地促進了乳源抗高血壓小肽的研究。然而，到目前為止，所 有的乳源抗高血壓小肽都是通過蛋白酶對乳蛋白質的水解獲得的，還沒有通過基因工程技術 來表達抗高血壓小肽的研究報道。本發(fā)明依據畢赤酵母密碼子用法和高表達優(yōu)越密碼子，設 計的乳源抗高血壓7肽串聯(lián)基因，采用ABI3900高通量DNA合成儀合成若干寡核苷酸片段， 通過重疊延伸PCR合成基因，將PCR產物克隆到質粒pMD18-T上。該基因可在畢赤酵母中 高水平表達，其表達產物經胰蛋白酶酶切后可形成單一的N端和C端都完整的乳源抗高血壓 7肽。(三) 發(fā)明內容本發(fā)明目的在于提供一種乳源抗卨血壓7肽串聯(lián)基因及其合成方法。 本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的1.適合在畢赤酵母中表達的乳源抗高血壓7肽串聯(lián)基因的設計根據乳源抗高血壓7肽AVPYPQR的氨基酸序列、畢赤酵母密碼子用法和高表達優(yōu)越密碼子設計乳源抗高血壓7肽串聯(lián)基因，編碼7肽的核苷酸序列間無間隔，以保證其表達產物 經胰蛋白酶酶切后可形成單一的N端和C端都完整的乳源抗高血壓7肽。為適合該基因在畢 赤酵母中的分泌表達，在串聯(lián)基因的5'端引入了酵母分泌信號肽切割位點。為了便于表達 載體的構建，在基因的兩端分別引入了XhoI、 Notl酶切位點。即設計的串聯(lián)基因的結構為 XhoI-信號切割序列-七肽氨基酸序列重復-終止密碼子-NotI。目的基因序列為etc gagaaaaga gag get gaa get get gtt cca tac cca caa aga (get gtc cca tac cca caa aga get gtt cca tac cca caa aga) n taagcggccgc，其中()n表示括號內的序列重復n次。 2.基因的合成根據目的基因序列，設計了以下4條寡核苷酸，用于基因合成。 AHP-1 5，-Ctc gag aaa aga gag get g陽3， 19ntAHP-2 5，-Ctcgagaaaagagaggctgaagctgctgttccatacccacaaag-3' 44ntAHP-3 5，-ct ttg tgg gta tgg aac age tct ttg tgg gta tgg gac age tct ttg tgg gta tgg aac-3 ， 59ntAHP-4 5' -gegg cege tta tct ttg tgg gta tgg aac ag-3' 29nt首先將AHP-2與AHP-3混合，進行重疊延伸PCR反應。 PCR反應體系去離子水10x Pyrobest Buffer Mg2+ (25mM) dNTPAHP-2 (20nM) AHP-3 (20,) Pyrobest酶(5U/(xL) 總體積PCR反應條件94。C預變性 94"C變性 55°(2退火 72"C延伸 72'C延伸 4'C終止反應 回收〉500bp的PCR產物作為模板，16.375)iL 2.5nL 2攀 2攀 0單 l單 0.125pL 25 pLlmin30s ， 30s丄 30s 10min以AHP-1 、 AHP-4為弓I物進行PCR擴增,30個循環(huán).PCR反應體系:
去離子水
10x Pyrobest Buffer Mg2+ (25mM) dNTP
AHP-1 (20一) AHP-4 (20jiM)
模板
Pyrobest酶(5U/|_iL)
總體積
16.375pL
2攀
2攀
0.5inL
0.5nL
l單
0.125pL
25
30個循環(huán)
PCR反應條件
94'C預變性 94'C變性 55'C退火 72'C延伸 72t:延伸 4°〇終止反應
反應產物加A后回收〉300bp的PCR產物，克隆至PMD18 -T載體，送交上海生工測序， 測序后序列分析。 測序結果
ctcgagaaaa gagaggctga agctgctgtt ccatacccsc aaagagctgt tccatsccca 60 ca犯gagctg ttccataccc acetaagagct gttccatacc cacaaagagc tgtcccstac 120 ccacaaagag ctgttccata cccacaaags gctgttccat acccac肪ag agctgttcca 180 tacccacaaa gagctgttcc 8tacccaca3 agagctgttc catacccaca aagagctgtt 240 ccatacccac aaagagctgt cccataccca caaagagctg ttccataccc acaaagataa 300
編碼的成熟分泌蛋白的氨基酸序列
AVPYPQR AVPYPQR AVPYPQR AVPYPQR AVPYPQR AWYPQR AVPYPQR AVPYPQR AVPYPQR AVPYPQR AVPYPQR AVPYPQR AVPYPQR
本發(fā)明采用基因工程手段設計、合成的乳源抗高血壓7肽串聯(lián)基因，該基因可在畢赤酵 .母中高水平表達，其表達產物經胰蛋白酶酶切后可形成單一的N端和C端都完整的乳源抗高 血壓7肽AVPYPQR。畢赤酵母是一種代謝旺盛的真菌，將設計、合成的乳源抗高血壓7肽 串聯(lián)基因轉化到畢赤酵母上，制備出一株基因工程酵母，其代謝產物經胰蛋白酶酶切后，制備AVPYPQR，為食品級ACEI的生產提供了方便途徑，同時大大降低了生產成本，提高了產
品安全性，具有很大的開發(fā)潛力。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明作更詳細的描述
實施例
1) .適合在畢赤酵母中表達的乳源抗高血壓7肽串聯(lián)基因的設計
根據乳源抗高血壓7肽AVPYPQR的氨基酸序列、畢赤酵母密碼子用法和高表達優(yōu)越密 碼子設計乳源抗高血壓7肽串聯(lián)基因，編碼7肽的核苷酸序列間無間隔，以保證其表達產物 經胰蛋白酶酶切后可形成單一的N端和C端都完整的乳源抗高血壓7肽。為適合該基因在畢 赤酵母中的分泌表達，在串聯(lián)基因的5'端引入了酵母分泌信號肽切割位點。為了便于表達 載體的構建，在基因的兩端分別引入了.XhoI、 Notl酶切位點。即設計的串聯(lián)基因的結構為 XhoI-信號切割序列-七肽氨基酸序列重復-終止密碼子-NotI。目的基因序列為etc gag aaa aga gag get gaaget get gtt cca tac cca caa aga (get gtc cca tac cca caa aga get gtt cca tac cca caa aga) n taagcggccgc，其中()n表示括號內的序列重復n次。
2) 基因的合成
根據目的基因序列，設計了以下4條寡核苷酸，用于基因合成。 AHP-1 5' -Ctc gag aaa aga gag get g-3' 19nt
AHP-2 5'-Ctc gag aaa aga gag get gaa get get gtt cca tac cca caa ag-3' 44nt
AHP-3 5'-ct ttg tgg gta tgg aac age tct ttg tgg gta tgg gac age tct ttg tgg gta tgg aac-3， 59nt
AHP隱4 5，-gcggccgcttatctttgtgggtatggaacag-3' 29nt
首先將AHP-2與'AHP-3混合，進行重疊延伸PCR反應。 PCR反應體系
去離子水16.375pL
10x Pyrobest Buffer
Mg2+ (25mM)2攀
dNTP
AHP-2 (2(VM)
AHP-3 (20|iM)1.5nL
Pyrobest酶(5U/nL)(U25(iL
總體積25 (xL
PCR反應條件:94'C預變性 lmin
94'C變性 30s 〕
55。C退火 30s ^ 30個循環(huán)
72。C延伸 30s
72。C延伸 10min
4'C終止反應
回收〉500bp的PCR產物作為模板，以AHP-1、八1 >-4為引物進行？01擴增( PCR反應體系
去離子水
10x Pyrobest Buffer Mg2+ (25mM) dNTP
AHP-1 (20|aM) AHP-4 (20pM)
模板
Pyrobest酶(5U/|aL)
總體積
16.375(iL
2單 2舉 0.5nL
l單 0.125nL 25 pL
PCR反應條件
94'C預變性 5min
94'C變性 30s ，
55'C退火 30s j" 30個循環(huán)
72"延伸 lmin
72。C延伸 10min
4'C終止反應
反應產物加A后回收〉300bp的PCR產物，克隆至PMD18 -T載體，送交上海生工測序， 測序后序列分析，測序結果見乳源抗高血壓7肽串聯(lián)基因序列表。
編碼的成熟分泌蛋白的氨基酸序列見乳源抗高血壓7肽串聯(lián)基因編碼的成熟分泌蛋白的氨基 酸序列表。
該蛋白經胰蛋白酶酶切后可形成單一的N端和C端都完整的乳源抗高血壓7肽 AVPYPQR。乳源抗高血壓7肽串聯(lián)基因序列表
ctcgagaaaa gagaggctga agctgctgtt cc3t3cccac aaagagctgt tccataccca caaagagctg ttccataccc acaaagagct gttccatacc cacaaagagc tgtcccatac ccacaaagag ctgttccata cccacaaaga gctgttccat acccacaaag agctgttcc3 tacccacaaa gagctgttcc atacccacaa agagctgttc catacccaca aagagctgtt ccatacccac aaagagctgt cccataccca caaagagctg ttccataccc acaaagataa
乳源抗高血壓7肽串聯(lián)基因編碼的成熟分泌蛋白的氨基酸序列表
Ala Val Pro Tyr Pro Gin Arg Ala Val Pro Tyr Pro Gin Arg Ala 1 5 10 . 15
Val Pro Tyr Pro Gin Arg Ala Val Pro Tyr Pro Gin Arg Ala Val
20 25 30
Pro Tyr Pro Gin Arg Ala Val Pro Tyr Pro Gin Arg Ala Val Pro
35 40 45
Tyr Pro Gin Arg Ala Val Pro Tyr Pro Gin Arg Ala Val Pro Tyr
50 55 60
Pro Gin Arg Ala Val Pro Tyr Pro Gin Arg Ala Val Pro Tyr Pro
65 70 75
Gin Arg Ala Val Pro Tyr Pro Gin Arg Ala Val Pro Tyr Pro Gin
80 85 90
Arg
60 120 180 240 300
權利要求
1、一種適合在畢赤酵母中表達的乳源抗高血壓7肽串聯(lián)基因，其特征是串聯(lián)基因的結構為XhoI-信號切割序列-七肽氨基酸序列重復-終止密碼子-NotI；目的基因序列為ctc gag aaaaga gag gct gaa gct gct gtt cca tac cca caa aga(gct gtc cca tac cca caa aga gct gtt cca tac cca caa aga)n taa gcggccgc，其中n表示括號內的序列重復n次。該基因可在畢赤酵母中高水平表達，其表達產物經胰蛋白酶酶切后可形成單一的N端和C端都完整的乳源抗高血壓7肽。
2、 一種適合在畢赤酵母中表達的乳源抗高血壓7肽串聯(lián)基因的合成方法，其特征是 根據目的基因序列，設計以下4條寡核苷酸，利用AHP-3與其互補序列間的交錯重疊延伸反應逐步合成長的串聯(lián)基因。AHP-1 5' -Ctc gag aaa aga gag get g-3' 19ntAHP-2 5 ，-Ctc gag aaa aga gag get gaa get get gtt cca tac cca caa ag-3' 44ntAHP-3 5 '-ct ttg tgg gta tgg aac age tct ttg tgg gta tgg gac age tct ttg tgg gta tgg aac-3 ， 59ntAHP-4 5' -gegg cege tta tct ttg tgg gta tgg aac ag-3' 29nt首先將AHP-2與AHP-3混合，進行重疊延伸PCR反應， PCR反應體系去離子水10x Pyrobest Buffer Mg2+ (25mM) dNTPAHP-2 (20nM) AHP-3 (20(iM) Pyrobest酶(5U/|iL) 總體積PCR反應條件94'C預變性' 94'C變性 55'C退火 72'C延伸 72'C延伸 4'C終止反應 回收〉500bp的PCR產物作為模板， PCR反應體系去離子水16.375pL 2.5nL ' 2攀 2攀l早0.125pL25fiLlmin30s 〕 30s丄 30s 10min以AHP-1 、 AHP-4為弓1物進行PCR擴增，30個循環(huán)16.375pL10x Pyrobest Buffer 2.5^LMg2+ (25mM) 2.0|iLdNTP 2.0^AHP-1 (20pM) 0.5|aLAHP-4 (20一) 0.5pL模板 l.O)aLPyrobest酶(5U/pL) 0.125^L總體積 25nLPCR反應條件94'C預變性 5min94。C變性 30s ，55"退火 30s } 30個循環(huán)72。C延伸 lmin72。C延伸 10min4。C終止反應 ， 反應產物加A后回收〉300bp的PCR產物，克隆至PMD18-T載體，測序，測序后序列 分析，獲得目的基因序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種適合在畢赤酵母中表達的乳源抗高血壓7肽串聯(lián)基因及其合成方法。串聯(lián)基因的結構為XhoI-信號切割序列-七肽氨基酸序列重復-終止密碼子-NotI；目的基因序列為CTC GAG AAAAGA GAG GCT GAA GCT GCT GTT CCA TAC CCA CAAAGA(GCT GTCCCA TAC CCA CAA AGA GCT GTT CCA TAC CCA CAA AGA)n TAA GCGGCCGC，其中n表示括號內的序列重復n次。合成方法為1)適合在畢赤酵母中表達的乳源抗高血壓7肽串聯(lián)基因的設計；2)乳源抗高血壓7肽串聯(lián)基因的合成。該基因可在畢赤酵母中高水平表達，其表達產物經胰蛋白酶酶切后可形成單一的N端和C端都完整的乳源抗高血壓7肽。
文檔編號C12N15/10GK101407811SQ200810064959
公開日2009年4月15日 申請日期2008年7月21日 優(yōu)先權日2008年7月21日
發(fā)明者杰 李, 李名遠, 滕春紅, 博 路, 韓建春 申請人:東北農業(yè)大學