專利名稱：應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)中的散射光及自發(fā)熒光參數(shù)進(jìn)行粘孢子蟲分類的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及魚類寄生粘孢子蟲的分類，具體的說，涉及一種通過流式細(xì)胞 術(shù)中的散射光及自發(fā)熒光參數(shù)進(jìn)行粘孢子蟲分類的方法。
技術(shù)背景流式細(xì)胞儀是在上世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種對(duì)細(xì)胞特征及細(xì)胞或細(xì)胞器 的組成進(jìn)行定性及定量分析的方法，其基本原理是光學(xué)和電學(xué)原理。近年來， 隨著細(xì)胞和分子生物學(xué)技術(shù)尤其是單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展和分子探針的開發(fā)， 流式細(xì)胞技術(shù)日見成熟，在國內(nèi)外被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐。目 前流式細(xì)胞儀在腫癌學(xué)、臨床細(xì)胞免疫學(xué)，血液病及相關(guān)病征的診斷和治療中 應(yīng)用較多。粘孢子蟲是一類對(duì)水養(yǎng)殖業(yè)具有嚴(yán)重危害的一類病原孢子蟲。對(duì)粘孢子蟲 的研究，尤其對(duì)其系統(tǒng)地位的研究，是目前國際間研究的一個(gè)熱點(diǎn)，經(jīng)典的形 態(tài)分類學(xué)一直將粘孢子蟲視為一種單細(xì)胞動(dòng)物迸行研究，但在分子技術(shù)問世后， 粘孢子蟲的單細(xì)胞地位逐漸受到人們的質(zhì)疑；直至目前，當(dāng)分子手段亦用于揭 示某些粘孢子蟲分類學(xué)上的系統(tǒng)地位時(shí)，國際間大部分的分子數(shù)據(jù)都認(rèn)為粘孢 子蟲應(yīng)歸屬多細(xì)胞起源的動(dòng)物。由于該蟲體孢子階段具備堅(jiān)硬的幾丁質(zhì)外殼， 如要破殼并保持其內(nèi)的原生質(zhì)體的完整性是實(shí)驗(yàn)過程中難以攻克的一個(gè)環(huán)節(jié)， 因此，這成為人們始終對(duì)粘孢子蟲細(xì)胞學(xué)的數(shù)據(jù)知之甚少的主要原因。粘孢子蟲的形態(tài)分類學(xué)主要是人們以光鏡下蟲體的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行主觀能動(dòng) 性的經(jīng)驗(yàn)判定，相對(duì)來說涉及的主觀因素較多，故有時(shí)難免會(huì)存在失誤或不準(zhǔn) 確之處；分子手段雖可在一定程度上解決部分形態(tài)學(xué)上的疑難種或存疑種，但 其同樣存在主觀因素的類似問題，故引入一種可不依賴于人為因素的判定粘孢 子蟲的方法是亟待進(jìn)行的。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行粘孢子蟲分類的方法，該 方法應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)粘孢子蟲散射光及自發(fā)熒光參數(shù)以獲取散點(diǎn)圖與直方 圖進(jìn)行直觀比較。本發(fā)明的技術(shù)方案如下首先收集需要區(qū)分的粘孢子蟲材料；將需要使用的相關(guān)儀器及設(shè)備進(jìn)行校正儀器Nikon E-600生物顯微鏡，Nikon SMZ1500體視鏡，流式細(xì)胞儀(美 國BDFASCSCalibur)，離心機(jī)(Hermle Z323K)等；儀器校正及數(shù)據(jù)獲取分析檢測(cè)前應(yīng)用流式細(xì)胞儀自帶程序并以標(biāo)準(zhǔn)校正微 球校正儀器；采用CdlQuest軟件獲取數(shù)據(jù)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 步驟l，樣品的制備1) 破孢囊于Nikon SMZ1500體視鏡下用解剖針將粘孢子蟲的孢囊壁戳破， 待其孢子完全流出。2) 提純制備單細(xì)胞懸液用PBS清洗孢子及孢囊壁，盡量將孢囊內(nèi)的孢子 清洗干凈，然后濾膜多次過濾去雜屑；超聲波振碎，離心，去上清，加 PBS后振蕩；以上過程3 5次重復(fù)；最后一次離心后加PBS懸浮孢子，待其單個(gè)孢子完全分散開后調(diào)整其濃度達(dá)1 X 105 1 X 106/ml 。 步驟2，上機(jī)檢測(cè)將制備好的粘孢子蟲的單細(xì)胞懸液進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)并用CellQuest獲取數(shù)據(jù)分 別以散點(diǎn)圖與直方圖顯示。其中散點(diǎn)圖分別以SSC與FSC (二者均為散射光) 為縱橫坐標(biāo)顯示，并且具備相應(yīng)的數(shù)值；而直方圖則分以收集細(xì)胞數(shù)目與自發(fā) 熒光強(qiáng)度為縱橫坐標(biāo)顯示。步驟3，數(shù)據(jù)分析和比較，將各獲取的粘孢子蟲的單細(xì)胞懸液的散點(diǎn)圖和直 方圖分別進(jìn)行比較研究，以此可提示兩點(diǎn)重要信息(1)有無自發(fā)光熒光可作為 一種類判定指標(biāo)；(2)如果有自發(fā)熒光，則強(qiáng)度會(huì)以相應(yīng)的峰值顯示。通過獲取 的各粘孢子蟲的單細(xì)胞懸液的散點(diǎn)圖和直方圖，以及疊加比較，便可比較容易 地判定所測(cè)的粘孢子蟲是否為同種。流式細(xì)胞儀要獲取的兩種重要的物理參數(shù)是散射光(FSC與SSC)與自發(fā) 熒光，其中散射光是不依賴于任何細(xì)胞樣品的制備技術(shù)(如染色)的參數(shù)，因 此，它具物種的穩(wěn)定性；通常情況下，F(xiàn)SC常與被測(cè)細(xì)胞的大小有關(guān)，確切是 與細(xì)胞直徑的平方密切相關(guān)，故它常與細(xì)胞的大小呈正相關(guān)；SSC常與細(xì)胞內(nèi) 的精細(xì)結(jié)構(gòu)及顆粒性質(zhì)相關(guān)，故它常與胞內(nèi)的復(fù)雜程度呈正相關(guān)。而自發(fā)熒光 也具有物種或細(xì)胞特異性，并不是所有的粘孢子蟲都具有自發(fā)熒光，或者具有 自發(fā)熒光的不同蟲種的熒光強(qiáng)度(峰值)亦存在差異。有益效果本發(fā)明可直接從各數(shù)據(jù)及圖形的情況(如散點(diǎn)圖中細(xì)胞群的數(shù) 量、直方圖中峰的數(shù)目及峰值的分離等)進(jìn)行觀察分析得出結(jié)果；同時(shí)也可通 過數(shù)據(jù)圖形進(jìn)行疊加比較，亦可判斷每種粘孢子蟲的物理固有值(如FSC、 SSC 及自光熒光)的穩(wěn)定性，通過這些物理固有值的比較即可獲得比較結(jié)果。該方法檢測(cè)方便、快捷。如果對(duì)每種粘孢子蟲的相關(guān)物理參數(shù)(如散射光及自發(fā)熒光)進(jìn)行測(cè)定、分析、存檔；然后通過對(duì)待分析的多種粘孢子進(jìn)行相同的測(cè)定后進(jìn) 行對(duì)比分析，(如在已測(cè)定完足夠的蟲種的情況下)即可比較容易地判斷出為具 體的某一種粘孢子蟲。同時(shí)檢測(cè)中不需任何染色方法的介入即可排除人為主觀 因素對(duì)判定蟲體的影響。


圖1為粘孢子蟲Afyxo6o/wawyw〃/ca/ww/us的形態(tài)結(jié)構(gòu)圖； 圖2為粘孢子蟲M^ra6o/w e/7&《縱wa/^的形態(tài)結(jié)構(gòu)圖；圖3為茅占孢子蟲A^ao6o/wS訓(xùn)戶///￡ ，1^ 的散點(diǎn)圖；圖4為粘孢子蟲Afyxo6o/ws aw/ w肌ca;ww/ws的自發(fā)熒光直方圖；圖5為粘孢子蟲A^o6o/ws ep/^wawato的散點(diǎn)圖；圖6為粘孢子蟲Afyjcok)/ws ep/^wa/wg/^的自發(fā)熒光直方圖；圖7為兩禾中茅占孢子蟲A^ao6o/ws a/wp"http://^/^/ ^禾口 A^:o6o/wj e/ /w""脂/z'j 的混合上樣散點(diǎn)圖；圖8為兩禾中茅占抱子蟲il^xo6o/ws am/ w〃/ca/ww/us禾口 Afyxo6o/ws 的混合上樣的自發(fā)熒光直方圖；圖9為圖1中Ml標(biāo)注的為紅色細(xì)胞群；圖10為圖1中M2標(biāo)注的為綠色細(xì)胞群。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例11、材料所選取的兩種粘孢子蟲隸屬于碘泡蟲屬下的兩種不同的碘泡蟲，分別為綺jco6o/ms ampw〃/o 戸w/ws 及 A^o:o&o/ws wawa/Zs 。
其中 Afyxo6o/w5aw/w〃/ca/ww/ws采自重慶淡水鯽魚的魚暨絲，而A^xo6o/m ep/^wawa/Zs貝!j采自廈門沿海的海水淄魚之皮膚鱗片上，且二者都已形成孢囊。2、 儀器及儀器校正儀器Nikon E-600生物顯微鏡，Nikon SMZ1500體視鏡，流式細(xì)胞儀(美 國BDFASCSCalibur)，離心機(jī)(Hermle Z323K)等儀器校正及數(shù)據(jù)獲取分析檢測(cè)前應(yīng)用流式細(xì)胞儀自帶程序并以標(biāo)準(zhǔn)校正 微球校正儀器；采用CdlQuest軟件獲取數(shù)據(jù)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。3、 樣品的制備及檢測(cè)破孢囊于Nikon SMZ1500體視鏡下用解剖針將Af;o:o6o/iw ampw肌ca/ww/w;y 及Mjao6o/ws ep/wwama"s的孢囊壁戳破，待其孢子完全流出。提純制備單細(xì)胞懸液用PBS清洗孢子及孢囊壁，盡量將孢囊內(nèi)的孢子清 洗千凈，然后將孢子經(jīng)過濾膜過濾去雜屑；超聲波振碎約5min， 12000 rpm/min 離心5min，加PBS懸浮，去上清；重復(fù)3次操作；最后一次離心后加PBS懸 浮，待其單個(gè)孢子完全分散開后調(diào)整其濃度達(dá)1X105 lX106/ml左右，然后 上樣檢測(cè)并獲取數(shù)據(jù)。就形態(tài)學(xué)特征而言，Afyjco6o/船ampM仿ca/ww/us屬于中到大型的淡水粘孢子 蟲，蟲體平均直徑均超過lOjxm (參見圖1)，而A^coZjo/mj e/ /ww"ma//j則屬于 相對(duì)小型的海水粘孢子蟲，其蟲體直徑均低于l(Him (參見圖2)。按如下設(shè)計(jì)方 案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。具體方案如下首先取采自淡水鯽魚的M;^o6o/w "w; w〃/ca戸w/附及海水淄 魚的il^xo6o/^e;^^^wafe的單細(xì)胞懸液上機(jī)檢測(cè)，分別獲取二者的散射光及 自發(fā)熒光的數(shù)據(jù)，以散點(diǎn)圖及直方圖分別顯示。其中圖3為A^;co6o/"《 ^^///a^w^的散點(diǎn)圖，圖4為其自發(fā)熒光的直方圖；同樣，圖5為M^co6o/"sepz'^w"wato的散點(diǎn)圖，圖6為其自發(fā)熒光的直方圖。通過圖3 (A^ro6o/w aw/w肌ca/ww/us)與圖5 (Afyjco6o/w ep/^wama/^s)的散點(diǎn)圖的比較可以看出 Afyxo6o/w fl附戸〃fca戸w/us的FSC值明顯大于Afyxofto/ws e/ —認(rèn)則//51， 說明 A^ao6o/iw am/ 滿ca戸w/tw的個(gè)體普遍較Afyxo6o/ws e/7/5^wamafc大，這與二者的 形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)一致；同時(shí)A/丌o6o/附amp"〃/ca戸w/"s的SSC值也大于il^jco6o/船 ep/^Mamato ， 貝(J說明 A^x。6o/wj aw/w〃/ca/wiz/us 的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)較 Afyxo6o/ws 印/^w"mafo復(fù)雜，這是單純的形態(tài)學(xué)手段難以觀察及揭示的特征。從各自的自 發(fā)熒光圖亦可看出二者的自發(fā)熒光強(qiáng)度明顯不同，其中A^jco6o/w flwpw//z'ca/ww/ws的自發(fā)熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于Afyxo6o/"51 e/j/s^af/wa^s: Jl^xo6o/i^ ampw〃/ca/ww/"s的自發(fā)熒光峰值約在102處，而A^;co6o/ws e/ /ww"wa/^的自發(fā) 熒光峰值卻遠(yuǎn)低于102 (介于10'與102之間)。 實(shí)施例21、材料；2、儀器及儀器校正；與實(shí)施例l相同， 3、樣品的制備及檢測(cè)破孢囊于Nikon SMZ1500體視鏡下用解剖針將Mjao6o/ws am/w///ca/ww/Ms 及M;;jco6o/m印/wMamato的孢囊壁戳破，待其孢子完全流出。提純制備單細(xì)胞懸液用PBS清洗孢子及孢囊壁，盡量將孢囊內(nèi)的孢子清 洗干凈，然后將孢子經(jīng)過濾膜過濾去雜屑；超聲波振碎10min， 6000 rpm/ min 離心10min，力HPBS懸浮，去上清；重復(fù)4次操作；最后一次離心后加PBS懸 浮，待其單個(gè)孢子完全分散開后調(diào)整其濃度達(dá)1X105 lX106/ml左右，然后 上樣檢測(cè)并獲取數(shù)據(jù)。具體方案如下將制備好的二者的單細(xì)胞懸液等比例混合后，再將此混合液進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)并獲取相關(guān)數(shù)據(jù)。(參見圖7)從散點(diǎn)圖可觀察到二者雖有交叉聚集，(參見圖8) 但從自發(fā)熒光直方圖則可觀察到兩個(gè)明顯的峰，說明獲取的混合單細(xì)胞懸液中 確實(shí)存在兩個(gè)不同的蟲種。根據(jù)兩個(gè)峰分別以Marker設(shè)門，便可輕易地將散點(diǎn) 圖中聚集的二者區(qū)別開來其中通過Ml設(shè)門可將紅色細(xì)胞群分辨及分離出來 (如圖9所示)；通過M2設(shè)門可將綠色細(xì)胞群分辨及分離出來(如圖IO所示)； 而且綠色細(xì)胞群的FSC及SSC值均大于紅色細(xì)胞群，則說明綠色細(xì)胞群的個(gè)體 大小及胞內(nèi)復(fù)雜程度均明顯大于或強(qiáng)于紅色細(xì)胞群，這與分別上樣獲取數(shù)據(jù)結(jié) 果一致，根據(jù)該結(jié)果即可推斷Ml標(biāo)注的紅色細(xì)胞群為M盧o6o/M甲/^""附"/&， 而M2標(biāo)注的綠色細(xì)胞群貝U為A^x:o6o/ws aw/w肌ca; s"/"s。 比較研究為了驗(yàn)證分別獲取及混合獲取數(shù)據(jù)時(shí)，兩種粘孢子蟲各自物理固有特征 (FSC， SSC及自發(fā)熒光)的穩(wěn)定性，我們分別作了疊加比較研究(圖4)。疊加研究一單獨(dú)調(diào)出M盧o6o/w am/^///ca;ww/w的自發(fā)熒光圖，然后將之 與M^ro6o/M印/^觸m"to的自發(fā)熒光圖疊加，發(fā)現(xiàn)二者的自發(fā)熒光強(qiáng)度截然不 同Afyxo6o/us awpz^/Zcapsw/ws明顯強(qiáng)于Afyxo6o/ws卬&《"(3附<3/&，這與分另!j獲取 的自發(fā)熒光強(qiáng)度比較結(jié)果一致。疊加研究二單獨(dú)調(diào)取混合液的自發(fā)熒光圖，然后將之與二者先前獨(dú)立上 樣時(shí)的自發(fā)熒光圖進(jìn)行疊加，分別獲取的自發(fā)熒光強(qiáng)度峰值恰好與以混合上樣 獲取的峰值相吻合。該研究結(jié)果表明每種粘孢子蟲都具各自獨(dú)立、穩(wěn)定的自發(fā) 熒光。實(shí)施例31、材料；2、儀器及儀器校正；與實(shí)施例l相同； 3、樣品的制備及檢測(cè)破孢囊于Nikon SMZ1500體視鏡下用解剖針將A/yjcoZjo/w aw/ w〃/ca;w"/us 及M"o6o/ms e/7/^wamato的孢囊壁戳破，待其孢子完全流出。提純制備單細(xì)胞懸液用PBS清洗孢子及孢囊壁，盡量將孢囊內(nèi)的孢子清 洗干凈，然后將孢子經(jīng)過濾膜過濾去雜屑；超聲波振碎5min， 10000 rpm/ min 離心8min，加PBS懸浮，去上清；重復(fù)操作5次；最后一次離心后加PBS懸 浮，待其單個(gè)孢子完全分散開后調(diào)整其濃度達(dá)1X105 1X10Vml左右，然后上樣檢測(cè)并獲取數(shù)據(jù)。具體方案如下將制備好的二者的單細(xì)胞懸液按7: 3的比例混合后，再將 此混合液進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)并獲取相關(guān)數(shù)據(jù)。(參見圖7)從散點(diǎn)圖可觀察到二者雖 有交叉聚集，(參見圖8)從自發(fā)熒光圖仍可觀察到兩個(gè)明顯的峰，說明獲取的 混合單細(xì)胞懸液中確實(shí)存在兩個(gè)不同的種。根據(jù)兩個(gè)峰分別以Marker設(shè)門，便 可輕易地將散點(diǎn)圖中聚集的二者區(qū)別開來:其中通過M1設(shè)門可將紅色細(xì)胞群分 辨及分離出來如圖9所示；通過M2設(shè)門可將綠色細(xì)胞群分辨及分離出來如圖 10所示。而且綠色細(xì)胞群的FSC及SSC值均大于紅色細(xì)胞群，則說明綠色細(xì)胞 群的個(gè)體大小及胞內(nèi)復(fù)雜程度均明顯大于或強(qiáng)于紅色細(xì)胞群，這與分別上樣獲 取數(shù)據(jù)結(jié)果一致，根據(jù)該結(jié)果即可推斷Ml標(biāo)注的紅色細(xì)胞群為A/^oco6o/m 印is^a附a^，而M2標(biāo)注的綠色細(xì)胞群貝!j為A^:vo6o/ws "wpw〃/ca戸w/1^。 比較研究為了驗(yàn)證分別獲取及混合獲取數(shù)據(jù)時(shí)，兩種粘孢子蟲各自固有特征(FSC， SSC及自發(fā)熒光)的穩(wěn)定性，我們分別作了疊加研究(圖4)。疊加研究一單獨(dú)調(diào)出^/>^060^"柳戸//&"戸"/ > 的自發(fā)熒光圖，然后將之 與A^xo6o/w epz^"amafe的自發(fā)熒光圖疊加，發(fā)現(xiàn)二者的自發(fā)熒光強(qiáng)度截然不 同Afy:w6o/us "附/ m〃/c";wm/"s明顯強(qiáng)于il^;co6。/wj《/ /5^"0/ 0/&，這與分另廿獲取 的自發(fā)熒光強(qiáng)度比較結(jié)果一致。疊加研究二單獨(dú)調(diào)取混合液的自發(fā)熒光圖，然后將之與二者先前獨(dú)立上 樣時(shí)的自發(fā)熒光圖進(jìn)行疊加，分別獲取的自發(fā)熒光強(qiáng)度峰值恰好與以混合液獲 取的峰值相吻合。該研究結(jié)果仍表明每種粘孢子蟲的都具各自獨(dú)立、穩(wěn)定的自 發(fā)熒光。
權(quán)利要求
1、一種應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)中的散射光及自發(fā)熒光參數(shù)進(jìn)行粘孢子蟲分類的方法，其特征在于包括如下步驟步驟1樣品的制備，收集進(jìn)行分類的粘孢子蟲，將收集的粘孢子蟲的孢囊壁戳破，提取流出孢子；然后將孢子經(jīng)過濾膜過濾去雜屑；超聲波振碎5～10min，6000～12000rpm/min離心5～10min，加PBS懸浮，去上清，以上過程3～5次重復(fù)，最后一次離心后加PBS懸浮，待其單個(gè)孢子完全分散開后調(diào)整其濃度達(dá)1×105～1×106/ml；步驟2將制備好的粘孢子蟲的單細(xì)胞懸液進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，CellQuest獲取數(shù)據(jù)，且數(shù)據(jù)分別以散點(diǎn)圖與直方圖顯示；步驟3數(shù)據(jù)分析和比較。將各獲取的粘孢子蟲的單細(xì)胞懸液的散點(diǎn)圖和直方圖分別進(jìn)行比較研究，得出結(jié)果。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)中的散射光及自發(fā)熒光參數(shù)進(jìn)行粘孢子蟲分類的方法，其特征在于步驟1所述將孢囊壁戳破，提取流出孢子是在Nikon SMZ1500體視鏡下，用解剖針將粘孢子蟲的孢囊壁戳破后待其孢子完 全流出，使用適合蟲體大小孔徑的濾膜過濾，超聲波破碎并將其制成單細(xì)胞懸 液。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)中的散射光及自發(fā)熒光參數(shù)進(jìn)行粘 孢子蟲分類的方法，其特征在于步驟2，散點(diǎn)圖分別以SSC為縱坐標(biāo)，以FSC 為橫坐標(biāo)，以揭示粘孢子蟲的蟲體大小及內(nèi)部結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度；直方圖以收集 細(xì)胞數(shù)目為縱坐標(biāo)，以自發(fā)熒光強(qiáng)度為橫坐標(biāo)，以揭示粘孢子蟲的自發(fā)熒光的有無或自發(fā)熒光的強(qiáng)度<
全文摘要
本發(fā)明公開了一種應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)中的散射光及自發(fā)熒光參數(shù)進(jìn)行粘孢子蟲分類的方法，步驟如下材料的收集、儀器校正、樣品的制備、上機(jī)檢測(cè)、流式細(xì)胞學(xué)數(shù)據(jù)分析；其中數(shù)據(jù)分析是先進(jìn)行分別上樣獲取的散點(diǎn)圖與直方圖的比較分析，然后再進(jìn)行與混合上樣獲取的散點(diǎn)圖與直方圖分別進(jìn)行對(duì)比研究，并通過相關(guān)數(shù)據(jù)及圖形的比較研究，得出結(jié)果。本發(fā)明檢測(cè)方便、快捷。如果對(duì)每種粘孢子蟲的相關(guān)物理參數(shù)(如散射光及自發(fā)熒光)進(jìn)行測(cè)定、分析、存檔，(如在已測(cè)定完足夠蟲種的情況下)然后通過對(duì)多種待測(cè)粘孢子進(jìn)行相同的測(cè)定，并進(jìn)行對(duì)比分析，即可比較容易地判斷出為具體的某一種粘孢子蟲。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101245368SQ20081006948
公開日2008年8月20日 申請(qǐng)日期2008年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月20日
發(fā)明者唐發(fā)輝, 唐安科, 趙元莙 申請(qǐng)人:重慶師范大學(xué)