專利名稱：用于檢測煙草青枯病菌的引物、探針及實(shí)時(shí)熒光pcr試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種適合于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、植物保護(hù)等部門使用的生物工 程技術(shù)，特別是一種用于檢測煙草生產(chǎn)中的重大毀滅性土傳病害一一 煙草青枯病病原菌Wa7"o/7/sso7a/ acear"/ 7的引物、探針及實(shí)時(shí)熒光 PCR試劑盒。
背景技術(shù)：
煙草青枯病是影響全球煙草產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大毀滅性病害，在我國 各地發(fā)生較為普遍。植株根、莖、葉均可受害，其最典型的癥狀是枯 萎。由于植株感病枯萎很快，而葉片萎垂仍呈青綠色，故稱青枯病。 該病一旦發(fā)生即可造成全株死亡，特別在苗期，此病常致幼苗成片枯 死，造成大量缺苗，對煙草的產(chǎn)量和質(zhì)量影響極大。此病害以土傳為 主，風(fēng)雨、流水、農(nóng)事操作等都是其傳播途徑。對于煙草青枯病菌的檢測方法有典型癥狀目測法、組織病理切片 法、致病性測定法等常規(guī)檢測方法。常規(guī)方法的優(yōu)點(diǎn)在于直觀、簡便 易行，但其缺點(diǎn)在于檢測周期長，經(jīng)驗(yàn)不足者誤判率高，而且不能在 病原侵染初期進(jìn)行檢測。此外，對煙草青枯病菌的檢測還有酶聯(lián)免疫 吸附法、斑點(diǎn)免疫吸附法等，但存在過程復(fù)雜、靈敏度低、檢測成本 高、周期較長等問題。繼常規(guī)PCR檢測技術(shù)之后，新興的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)憑借其 對初始模板量準(zhǔn)確定量、靈敏度高、特異性強(qiáng)、閉管操作、簡便迅速 等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為國內(nèi)外分子生物學(xué)研究中的主流技術(shù)，它同樣也在 植物病原體的檢測和診斷中逐漸得到了廣泛使用。近年來國內(nèi)外陸續(xù) 開始將實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)應(yīng)用于植物病害診斷檢測。實(shí)時(shí)定量熒光PCR是利用熒光信號伴隨著PCR產(chǎn)物的增加而增強(qiáng) 的原理，在PCR擴(kuò)增過程中，連續(xù)不斷地檢測反應(yīng)體系中熒光信號的 變化。根據(jù)熒光信號基線的平均值和平均標(biāo)準(zhǔn)差，在99.7%的置信度 時(shí)計(jì)算出大于平均值的熒光值即閾值，然后收集熒光信號增強(qiáng)到預(yù)定 閾值時(shí)的PCR循環(huán)次數(shù)(即Ct值)。該參數(shù)和PCR反應(yīng)體系中起始DNA模板量的對數(shù)值之間有嚴(yán)格的線性關(guān)系。利用陽性梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的ct值繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)檢測樣品的ct值就可以準(zhǔn)確地測定耙標(biāo)病原菌的起始模板拷 貝數(shù)。實(shí)時(shí)熒光PCR根據(jù)其產(chǎn)生熒光的原理分為使用探針和不使用探 針的兩類方法。由于探針與待檢測病原菌DNA序列有很高的特異性， 而且可以有效避免常規(guī)PCR的假陽性問題，所以目前使用較為普遍的 是熒光標(biāo)記探針法。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法用于植物病原菌的檢測，在國內(nèi)外都還是 剛剛起步。目前，在煙草青枯病菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測中，以5' - CCG ACA CCA CGA CCC TGA A -3，禾口 5， - GCG GAC GGA TAG ATG TAG TTG C -3， 為引物、以在5， - ACC TGG CAT ACC TTG GCG ACA CC -3，兩端向上游 移位2個(gè)堿基或下游移位3個(gè)堿基區(qū)域內(nèi)的任意一條核苷酸序列為探 針制備成相應(yīng)的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，尚無相關(guān)報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一就是提供一種用于檢測煙草青枯病菌的引物， 它可以在PCR檢測過程中，定性檢測煙草青枯病菌，而且特異性強(qiáng)。本發(fā)明所提供用于檢測煙草青枯病菌的引物包括正向引物R. soil和反 向引物R. sol2組成的引物對，所述正向引物R. soil的核苷酸序列見序列表 中的序列1所示，R. soil: 5，- CCG ACA CCA CGA CCC TGA A-3，；所述反向 引物R. sol2核苷酸序列見序列表中的序列2所示，R. sol2: 5，-GCG GAC GGA TAG ATG TAG TTG C -3，。申請人是經(jīng)過長期大量的實(shí)驗(yàn)，從眾多用于檢測煙草青枯病菌的PCR 引物中篩選出上述的由正向引物R. soil和反向引物R. so12組成的引物，其 擴(kuò)增片段大小為331 bp。該引物的特點(diǎn)是對煙草青枯病菌具有高度的保守 性，與其它近緣生物種之間不具有顯著的同源性，用該引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 實(shí)現(xiàn)煙草青枯病菌的準(zhǔn)確定性檢測，且特異性強(qiáng)。本發(fā)明的目的之二就是提供一種用于檢測煙草青枯病菌的探針，它 可以在實(shí)時(shí)熒光PCR檢測過程中，定量檢測煙草青枯病菌，顯著地提 高檢測靈敏度。該探針的堿基序列是在5'- ACC TGG CAT ACC TTG GCG ACA CC -3，兩端向上游移位2個(gè)堿基或下游移位3個(gè)堿基區(qū)域內(nèi)的任意一條核苷 酸序列，所述探針一端連接有熒光淬滅基團(tuán)，另一端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)。所述探針熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記在5'端，熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記在3'端，構(gòu)成熒光標(biāo)記探針。所述探針是在5，- ACC TGG CAT ACC TTG GCG ACA CC -3'向上游移位2 個(gè)堿基的核苷酸序列5，- CCA CCT GGC ATA CCT TGG CGA CAC C -3，，見序 列表中的序列4所示。所述探針的核苷酸序列是序列表中的序列3所示的序列5，- ACC TGG CAT ACC TTG GCG ACA CC -3，。所述探針是在5，- ACC TGG CAT ACC TTG GCG ACA CC -3，向下游移位3 個(gè)堿基的核苷酸序列5，- ACC TGG CAT ACC TTG GCG ACA CCG CC _3，， 見 序列表中的序列5所示。本發(fā)明的目的之三就是提供一種利用目的一中的引物和目的二中 的探針制成的檢測煙草青枯病菌的試劑盒，可以在實(shí)時(shí)熒光PCR檢測 過程中，快速、準(zhǔn)確地定量檢測土壤中和植株上的煙草青枯病菌，而 且穩(wěn)定可靠、靈敏度高。所述試劑盒還包括待測樣品提取試劑、定量標(biāo)準(zhǔn) 品、實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液和檢測用品，所述實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液包括有如下 的組份及其相對應(yīng)的終濃度PCR緩沖液:10%; MgCl2: 2. 5 mmol/L; dNTPs: 0.2 mmol/L; Taq DNA聚合酶1 U/25叱；正向引物R. soil: 0.3 |Jmol/L; 反向引物R. sol2: 0.3 Mmol/L;熒光標(biāo)記探針0.2 Mmol/L;采用無菌雙蒸 水調(diào)整終濃度。根據(jù)實(shí)際情況，在實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液中各組份采用的是PCR緩沖液 是10 X PCR緩沖液;MgCl2的初濃度是25 mmol/L; dNTPs的初濃度是5 mmol/L; Taq DNA聚合酶的初濃度是1 U/叱；正向引物R. soil的初濃度是5 Mmol/L; 反向引物R. so12的初濃度是5 Mmol/L;熒光標(biāo)記探針的初濃度是5陶ol/L; PCR緩沖液、MgCl2 、 dNTPs、 TaqDNA聚合酶、正向引物R. soll、反向引物 R.sol2、熒光標(biāo)記探針的體積比是5:5:2:2:3:3:2。在實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液中，各組份采用的是PCR緩沖液是10XPCR緩 沖液；MgCl2的初濃度是25咖ol/L; dNTPs的初濃度是10函ol/L; Taq DNA 聚合酶的初濃度是2.5 U/叱；正向引物R. soll的初濃度是10 Mmol/L;反 向引物R. so12的初濃度是10 Mmol/L;熒光標(biāo)記探針的初濃度是5 Mmol/L; PCR緩沖液、MgCl2、 dNTPs、 Taq DNA聚合酶、正向引物R. soll、反向引物 R.S0l2、熒光標(biāo)記探針的體積比是50: 50: 10: 8: 15: 15: 20。采用本發(fā)明中的試劑盒， 一方面，在待測樣品預(yù)處理過程中，待測樣品提取試劑可以直接提取土壤樣品或煙草葉片中的煙草青枯病菌DNA用作PCR 擴(kuò)增模板，節(jié)約了時(shí)間；另一方面，在待測樣品的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增過程中， 直接將已按最佳組份及其體積比配制好的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液加入八連管 中，既節(jié)約了大量的時(shí)間，且穩(wěn)定可靠，從而達(dá)到了快速、準(zhǔn)確地檢測土 壤中和植株上的煙草青枯病菌。由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn)(1) 特異性強(qiáng)本發(fā)明中引物和探針均根據(jù)煙草青枯病菌特異性序列設(shè) 計(jì)，并與其它生物種比對，沒有顯著同源性，檢測特異性強(qiáng)；(2) 靈敏度高利用本發(fā)明中實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒對煙草青枯病菌進(jìn)行 檢測時(shí)，可以準(zhǔn)確定量，目標(biāo)菌DNA在IO ng/化-1 fg/叱濃度范圍內(nèi)，都 有很好的線性關(guān)系，靈敏度高；(3) 實(shí)用性好本發(fā)明中實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒具有開啟即用、標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一、 簡單方便等優(yōu)點(diǎn)，可以快速、準(zhǔn)確地檢測田間土壤中和植株上的煙草青枯病 菌，實(shí)用性好；(4) 應(yīng)用范圍廣可以定量檢測土壤和植株上的煙草青枯病菌，適用于 煙草青枯病菌田間動(dòng)態(tài)監(jiān)測和病害診斷，同時(shí)可用于煙草青枯病菌在煙草植 株中的增殖速度和種子帶菌的定量檢測。綜上所述，采用本發(fā)明，能在田間帶病土壤中和植株上快速、準(zhǔn)確地檢 測煙草青枯病菌，從而為及時(shí)采取措施切斷病害的侵染源提供準(zhǔn)確依據(jù)，也 可以快速、準(zhǔn)確地檢測植株上的病害，其意義十分重大。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明在本發(fā)明中，用于檢測煙草青枯病菌的引物包括正向引物R.SOll和反 向引物R，so12，其堿基序列分別是-R. soil: 5，- CCG ACA CCA CGA CCC TGA A -3，， 見序列表中的序列1 所示；R. sol2: 5，- GCG GAC GGA TAG ATG TAG TTG C -3，，見序列表中的序列2所示。在本發(fā)明中，用于檢測煙草青枯病菌的探針，它的堿基序列是在5'-ACC TGG CAT ACC TTG GCG ACA CC -3'兩端向上游移位2個(gè)堿基或下游移位3個(gè) 堿基區(qū)域內(nèi)的任意一條核苷酸序列，在該條核苷酸序列上，熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記在5'端，熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記在3'端，以構(gòu)成熒光標(biāo)記探針。在由正向引物R. soil和反向引物R. so12組成的引物的擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)，按 照探針的設(shè)計(jì)原理和設(shè)計(jì)方法，設(shè)計(jì)出用于煙草青枯病菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測 的探針，它的堿基序列是在5，- ACC TGG CAT ACC TTG GCG ACA CC -3，兩端 向上游移位2個(gè)堿基或下游移位3個(gè)堿基區(qū)域內(nèi)的任意一條核苷酸序列；用 所設(shè)計(jì)的所有探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，對所設(shè)計(jì)的探針進(jìn)行篩選；根據(jù) 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的結(jié)果，最后篩選出最佳探針。在5，_ ACC TGG CAT ACC TTG GCG ACA CC -3，向上游移位2個(gè)堿基的 核苷酸序列可以是5，- CCA CCT GGC ATA CCT TGG CGA CAC C -3，，見序列 表中的序列4所示熒光標(biāo)記探針的核苷酸序列也可以是5，- ACC TGG CAT ACC TTG GCG ACA CC -3',見序列表中的序列3所示，它是最佳實(shí)施方式。在5，- ACC TGG CAT ACC TTG GCG ACA CC -3'向下游移位3個(gè)堿基的 核苷酸序列還可以是5，- ACC TGG CAT ACC TTG GCG ACA CCG CC _3，，見 序列表中的序列5所示。在熒光標(biāo)記探針的5'端標(biāo)有記報(bào)告基團(tuán)FAM， 3'端標(biāo)記有熒光淬滅基 團(tuán)TAMRA 。當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收， 儀器檢測不到信號。隨著PCR進(jìn)行，Taq DNA聚合酶在鏈延伸過程中遇到與 模板結(jié)合的探針，其5' —3'外切核酸酶活性就會將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離 淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號，報(bào)告基團(tuán)所釋放的熒光可以被定 量檢測儀內(nèi)的熒光計(jì)檢測，模板每復(fù)制一次，就有一個(gè)探針被切斷，伴隨一 個(gè)熒光信號的釋放。由于被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目和PCR產(chǎn)物數(shù)量是一對一的 關(guān)系，所以熒光量的增加與PCR產(chǎn)物的積累量呈比例關(guān)系。Ct值是PCR過 程中熒光量的積累超過基底熒光量的循環(huán)數(shù)。利用陽性梯度標(biāo)準(zhǔn)模板的Ct 值制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測樣品的Ct值可準(zhǔn)確地定量被檢測樣品中煙草 青枯病菌的濃度，從而顯著提高檢測靈敏度。本發(fā)明所述的檢測煙草青枯病菌的試劑盒，它包括有待測樣品提取試 劑、定量標(biāo)準(zhǔn)品、實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液和檢測用品，其中實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液包括有如下的組份及其相對應(yīng)的終濃度PCR緩沖液10%; MgCl2 : 2.5 畫1/L; d證s: 0. 3畫1/L; Taq DNA聚合酶:1 U/25 ML;正向引物R. soil: 0.4 Mmol/L;反向引物R. sol2: 0.4 Mmol/L;熒光標(biāo)記探針0.2 Mmol/L;采用無菌雙蒸水調(diào)整濃度。待測樣品提取試劑由TES緩沖液和TE緩沖液組成，TES緩沖液和TE緩 沖液均是常規(guī)試劑，是根據(jù)《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(第四版)》中相關(guān) 方法配制而成的。定量標(biāo)準(zhǔn)品包括基于煙草青枯病菌特有核酸序列設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)陽性對照 模板、無煙草青枯病菌土樣和健康植株陰性對照模板。標(biāo)準(zhǔn)陽性對照模板由 含有插入目標(biāo)片段的pMD18-T載體(購自Takara公司)制備而成。制備過 程為采用引物R.soll和1 .3012擴(kuò)增煙草青枯病菌基因組DNA， PCR產(chǎn)物 電泳后切膠回收目標(biāo)片段，與pMD18-T載體于16'C下連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在含有X-gal和IPTG的氨節(jié) 青霉素平板上培養(yǎng)，挑取白斑，搖菌后采用SDS堿解法提取質(zhì)粒，通過酶切 和測序鑒定陽性克隆。陽性克隆的質(zhì)粒DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)A^定量，經(jīng) IOX梯度稀釋為IO ng-l fg/叱，保存于-20。C 。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液包括有如下的組份及其相對應(yīng)的終濃度PCR緩沖 液10%; MgCl2: 2.5咖ol/L; dNTPs: 0.2mmol/L; TaqDNA聚合酶1U/25 ML;正向引物R. soil: 0.3 Mmol/L;反向引物R. sol2: 0.3 Pmol/L;熒光 標(biāo)記探針0. 2 Mmol/L;采用無菌雙蒸水調(diào)整濃度。其中，PCR緩沖液、MgCl2、 dNTPs、 Taq DNA聚合酶都是PCR常規(guī)試劑，均購自北京鼎國生物技術(shù)責(zé)任有 限公司，引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，熒光標(biāo)記探針在Takara 公司合成。檢測用品包括有自封式塑料袋、復(fù)合濾膜過濾器和0.2 mL八連管。 在利用目的一中的引物和目的二中的最佳探針的基礎(chǔ)上，優(yōu)化反應(yīng) 體系和反應(yīng)條件，確定最佳的煙草青枯病菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測體系。本發(fā)明優(yōu)化的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系總體積為25化，其中10XPCR緩 沖液2. 5叱，25咖ol/L MgCl2 2. 5pL， 5 mmol/L dNTPs 1 ML， 1 U/^L Taq DNA聚合酶1叱，5 Wnol/L正向引物R. soll和反向引物R. sol2各1.5 ML, 5陶ol/L熒光標(biāo)記探針1叱，無菌雙蒸水13叱，DNA模板1叱。實(shí)時(shí)熒光 PCR采用兩步法，擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5。C， 4min;然后42個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為95。C， 10 s, 63°C， 30 s，在每個(gè)循環(huán)的退火/延伸階段(63°C)收集熒光。利用本發(fā)明中的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒對煙草青枯病菌進(jìn)行檢測，包括 待測樣品預(yù)處理和待測樣品的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。待測樣品PCR擴(kuò)增模板的制備和待測樣品的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。 待測樣品PCR擴(kuò)增模板的制備包括土壤樣品PCR擴(kuò)增模板的制備和植 株樣品PCR擴(kuò)增模板的制備① 土壤樣品PCR擴(kuò)增模板的制備(1) 稱取0.5克土壤樣品于5ml離心管中，加入0.2 g聚乙烯聚吡咯垸 酮(PVPP)，渦旋30 s，再加入3 mL DNA extraction buffer混合均勻；(2) 迅速置于-196 r:液氮中冰凍2niin，取出后于65 。C水浴融解(約3 min，注意時(shí)間不能太長，融解后馬上取出)，如此反復(fù)2-3次裂解細(xì)胞；(3) 加入20 Pl 10 mg/ml蛋白酶K、 0. 5 ml 50 mg/ml溶菌酶，上下顛 倒混勻，置于37 'C搖床上振蕩30 min (225 r/min);(4) 加入600 Pl 100 g/LSDS， 65 。C水浴30 min，其間每隔5-10 min 輕輕顛倒混勻；(5) 室溫離心(12，000r/min) 10min，收集上清液，轉(zhuǎn)移到另一新的5mL 離心管中；(6) 土壤沉淀再加入0.5 ml提取液和100 W 100 g/L SDS，渦旋30 s， 65。C水浴10min，室溫離心(12, 000 r/min) 10 min，收集上清液并與前次 上清液合并；(7) 上清液中加入0. 05 g PVPP，室溫結(jié)合20 min后，室溫離心(12, 000 r/min) 10 min，收集上清液，轉(zhuǎn)移到另一新的5 ml離心管中；(8) 上清液用等體積的氯仿/異戊醇(24:1)抽提兩次，離心(12，000 r/min， 10 min)后吸取水相轉(zhuǎn)移至另一 5 mL離心管中；(9) 用預(yù)冷的0.6倍體積異丙醇室溫沉淀30 min，室溫離心(12，000 r/min)10 min，收集核酸沉淀；(10) 用冷的700 mL/L乙醇洗滌沉淀兩次，自然吹干，溶解于100叱滅 菌的超純水中。② 植株樣品PCR擴(kuò)增模板的制備(1) 用70%酒精擦拭工作臺，以確保在無菌狀態(tài)下操作全過程；(2) 隨機(jī)地選取煙草葉片，剪碎后加入裝有10 mL TES緩沖液的塑料 袋中，浸泡15分鐘(期間振蕩2-3次)，然后裝入50mL離心管，5000 r/min 離心1 min，然后用復(fù)合濾膜過濾器過濾；(3) 從濾膜上洗下菌體，將濾膜浸入IOO吣TE緩沖液，劇烈振蕩， 洗脫的菌液即為后續(xù)PCR待測模板。待測樣品的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)步驟為-(1) 將實(shí)時(shí)熒光PCR儀開機(jī)設(shè)置備用；(2) 向0.2 mL八連管中加入24叱實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液；(3) 加入1叱待測樣品液，將試劑盒提供的無煙草青枯病菌土樣或 健康煙草植株陰性對照加入陰性對照管中，陽性對照管加入陽性對照標(biāo)準(zhǔn)品 的10X梯度稀釋液，對照樣品的用量均為每管l叱；(4) 混合均勻之后即可進(jìn)行PCR反應(yīng)；(5) 待PCR擴(kuò)增完成，采用儀器自帶的分析軟件，分析擴(kuò)增結(jié)果，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測樣品反應(yīng)體系中煙草青枯病菌的DNA量。 采用本發(fā)明中的試劑盒， 一方面，在待測樣品預(yù)處理過程中，待測樣品 提取試劑可以直接提取土壤樣品或煙草葉片中的煙草青枯病菌DNA用作PCR 擴(kuò)增模板，節(jié)約了時(shí)間；另一方面，在待測樣品的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增過程中， 直接將已按最佳組份及其體積比配制好的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液加入八連管 中，既節(jié)約了大量的時(shí)間，且穩(wěn)定可靠，從而達(dá)到了快速、準(zhǔn)確地檢測土 壤中和植株上的煙草青枯病菌。在上述實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液中，各組份采用的是PCR緩沖液是10XPCR 緩沖液；MgCl2的初濃度是25 mmol/L; dNTPs的初濃度是5咖ol/L; Taq DNA 聚合酶的初濃度是1 U/叱；正向引物R. soil的初濃度是5 Hmol/L;反向 引物化3012的初濃度是5陶01/1;熒光標(biāo)記探針的初濃度是5陶ol/L; PCR 緩沖液、MgCl2、 dNTPs、 Taq DNA聚合酶、正向引物R. soll、反向引物R. so12、 熒光標(biāo)記探針的體積比是5:5:2:2:3:3:2。在上述實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液中，各組份采用的是PCR緩沖液是10XPCR 緩沖液；MgCl2的初濃度是25 mmol/L; dNTPs的初濃度是10 mmol/L; Taq DNA 聚合酶的初濃度是2.5 U/IC;正向引物R. soil的初濃度是10 Mmol/L;反 向引物R. so12的初濃度是10 Mmol/L;熒光標(biāo)記探針的初濃度是5 Hmol/L; PCR緩沖液、MgCl2 、 dNTPs、 TaqDNA聚合酶、正向引物R.soll、反向引物 R. S0l2、熒光標(biāo)記探針的體積比是50: 50: 10: 8: 15: 15: 20。序列表<110>重慶大學(xué)〈120>用于檢測煙草青枯病菌的引物、探針及實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒 〈130〉 無 <160〉 5<170> Patentln version 3. 5〈210〉 1 〈211〉 19 〈212〉 DNA<213> 煙草青枯病病原菌(Ralstonia solanacearum) <400> 1ccgacaccac gaccctgaa 19<210〉 2 <211> 22 〈212〉 DNA<213> 煙草青枯病病原菌 (Ralstonia solanacear咖) <400> 2gcggacggat agatgtagtt gc 22〈210> 3<211> 23<212> DNA〈213> 煙草青枯病病原菌(Ralstonia solanacearum)<400> 3acctggcata ccttggcgac acc 23<210〉 4<211> 25 <212>腿<213〉 煙草青枯病病原菌 (Ralstonia solanacear咖)〈400〉 4ccacctggca taccttggcg acacc 25<210〉 5<211> 26 〈212〉腿〈213〉 煙草青枯病病原菌 (Ralstonia solanacearum)<400> 5acctggcata ccttggcgac accgc c 2權(quán)利要求
1.一種用于檢測煙草青枯病菌的引物，它包括正向引物R.sol1和反向引物R.sol2組成的引物對，所述正向引物R.sol1的核苷酸序列見序列表中的序列1所示，R.sol15’-CCG ACA CCA CGA CCC TGA A-3’；所述反向引物R.sol2核苷酸序列見序列表中的序列2所示，R.sol25’-GCG GAC GGATAG ATG TAG TTG C-3’。
2. —種用于檢測煙草青枯病菌的探針，其堿基序列是在5'- ACC TGG CAT ACC TTG GCG ACA CC -3'兩端向上游移位2個(gè)堿基或下游移位3個(gè)堿基區(qū)域 內(nèi)的任意一條核苷酸序列，熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記在5'端，熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記在 3'端，構(gòu)成熒光標(biāo)記探針。
3. 如權(quán)利要求2所述的用于檢測煙草青枯病菌的探針，其特征在于所 述探針是在5，- ACC TGG CAT ACC TTG GCG ACA CC -3，向上游移位2個(gè)堿 基的核苷酸序列5，- CCA CCT GGC ATA CCT TGG CGA CAC C -3，，見序列表 中的序列4所示。
4. 如權(quán)利要求2所述的用于檢測煙草青枯病菌的探針，其特征在于所 述探針的核苷酸序列是序列表中的序列3所示的序列5'- ACC TGG CAT ACC TTG GCG ACA CC -3'。
5. 如權(quán)利要求2所述的用于檢測煙草青枯病菌的探針，其特征在于所 述探針是在5，_ ACC TGG CAT ACC TTG GCG ACA CC -3，向下游移位3個(gè)堿 基的核苷酸序列5，- ACC TGG CAT ACC TTG GCG ACA CCG CC -3，， 見序列 表中的序列5所示。
6. —種檢測煙草青枯病菌的試劑盒，包括權(quán)利要求1所述的引物和權(quán) 利要求3、 4或5所述的探針。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括待 測樣品提取試劑、定量標(biāo)準(zhǔn)品、實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液和檢測用品，所述實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液包括有如下的組份及其相對應(yīng)的終濃度PCR緩沖液10%;MgCl2 : 2.5 mmol/L; dNTPs: 0.2咖ol/L; Taq DNA聚合酶1 U/25 ML; 正向引物R. soil: 0.3 Mmol/L;反向引物R. sol2: 0.3 Mmol/L;熒光標(biāo)記 探針0.2 Mmol/L;采用無菌雙蒸水調(diào)整終濃度。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測煙草青枯病菌的試劑盒，其特征在于在 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液中，各組份采用的是PCR緩沖液是10XPCR緩沖液；MgCl2的初濃度是25 mmol/L; dNTPs的初濃度是5 mmol/L; Taq DNA聚合酶 的初濃度是1U/ PL;正向引物R. soil的初濃度是5 Mmol/L;反向引物R. sol2 的初濃度是5 Hmol/L;熒光標(biāo)記探針的初濃度是5 Mmol/L; PCR緩沖液、 MgCl2 、 dNTPs、 Taq DNA聚合酶、正向引物R. soll、反向引物R. so12、熒 光標(biāo)記探針的體積比是5:5:2:2:3:3:2。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測煙草青枯病菌的試劑盒，其特征在于 在實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液中，各組份采用的是PCR緩沖液是IOXPCR緩沖液; MgCl2的初濃度是25 mmol/L; dNTPs的初濃度是10咖ol/L; Taq DNA聚合 酶的初濃度是2. 5 U/化；正向引物R. soll的初濃度是10 Mmol/L;反向引 物R. so12的初濃度是10 tool/L;熒光標(biāo)記探針的初濃度是5 Mmol/L; PCR 緩沖液、MgCl2 、 dNTPs、 Taq DNA聚合酶、正向引物R. soll、反向引物R. sol2、熒光標(biāo)記探針的體積比是50: 50: 10: 8: 15: 15: 20。
全文摘要
一種用于檢測煙草青枯病菌的引物、探針及實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，所述的引物包括正向引物R.sol1和反向引物R.sol2，其堿基序列分別是R.sol15’-CCG ACA CCA CGA CCC TGA A-3’，R.sol25’-GCG GAC GGA TAGATG TAG TTG C-3’。所述的探針的堿基序列是在5’-ACC TGG CAT ACC TTGGCG ACA CC-3’兩端向上游移位2個(gè)堿基或下游移位3個(gè)堿基區(qū)域內(nèi)的任意一條核苷酸序列，在該條核苷酸序列上，熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記在5’端，熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記在3’端，以構(gòu)成熒光標(biāo)記探針。并用上述的引物和探針制備成相應(yīng)的試劑盒。本發(fā)明能在田間病土中快速、準(zhǔn)確地檢測煙草青枯病菌，從而為及時(shí)采取措施切斷病害的侵染源提供準(zhǔn)確依據(jù)，也可以快速、準(zhǔn)確地檢測植株上的病害，其意義十分重大。
文檔編號C12Q1/68GK101250580SQ20081006955
公開日2008年8月27日 申請日期2008年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月11日
發(fā)明者吳金鐘, 李常軍, 肖崇剛, 黃俊麗 申請人:重慶大學(xué)