專利名稱：：細(xì)胞染色試劑及其配制方法和在細(xì)胞染色中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種能同時(shí)分別將細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)染上不同顏色的細(xì)胞染色試劑，及其配制方法和在細(xì)胞染色中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：近一個(gè)世紀(jì)以來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，病理研究的深入，對(duì)細(xì)胞的定性和定量檢測(cè)己成為醫(yī)學(xué)上的常用方法。細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析就是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定性檢測(cè)的方法，通過(guò)在顯微鏡下觀察脫落細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征來(lái)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定性分析，以供是否作進(jìn)一步病理分析作參考。為了對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察，通常要先對(duì)整個(gè)細(xì)胞進(jìn)行染色，令細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核可以容易的在顯微鏡下觀察，常用的染色方法有蘇木精伊紅染色法(同組織切片染色)、巴氏染色法、紹氏染色法、邁格吉染色等。在細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析中僅有幾種描述性的細(xì)胞特征(如很大的細(xì)胞核、很大的核漿比例或者顆?；瘒?yán)重的細(xì)胞核等)，但是，這些觀察都是主觀的，不具有很好的重復(fù)性，而且細(xì)胞學(xué)家必須經(jīng)過(guò)很好的訓(xùn)練才能正確地檢測(cè)和診斷疾病。此外，由于此種觀測(cè)方法主觀因素太強(qiáng)，醫(yī)生自身及醫(yī)生之間存在著很大的差異，容易導(dǎo)致分析不夠準(zhǔn)確。雖然細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析的診斷準(zhǔn)確率只有60%左右，但在近一個(gè)世紀(jì)以來(lái)仍然在醫(yī)學(xué)中得到了廣泛的應(yīng)用。許多國(guó)家?guī)资甑姆腊┢諙私Y(jié)果證實(shí)，用巴氏涂片作為子宮頸癌的篩査方法可以及早對(duì)子宮頸癌發(fā)現(xiàn)和治療，使子宮頸癌死亡率明顯下降。然而，由于受取材方法、涂片制作、染色技巧、閱片水平等因素影響，導(dǎo)致巴氏細(xì)胞學(xué)方法假陰性率達(dá)15%40%。巴氏方法的另一不足是與其它常規(guī)細(xì)胞病理學(xué)診斷方法一樣，對(duì)子宮頸癌前病變的發(fā)展趨向無(wú)法進(jìn)行預(yù)測(cè)評(píng)估。自從1924年Feulgen(福爾根)等人建立了DNA-Feulgen染色方法以來(lái)，至今這種方法仍是DNA定量測(cè)定的主要染色方法之一。Feulgen染色是經(jīng)典顯示去氧核糖核酸的方法，其具體反應(yīng)原理是，標(biāo)本經(jīng)稀鹽酸水解后，DNA分子中的嘌呤堿基被解離，從而在核糖的一端出現(xiàn)了醛基，醛基具有還原作用，可與無(wú)色品紅結(jié)合形成紫紅色化合物，從而顯示出DNA的分布。近30年來(lái)，隨著數(shù)碼顯微鏡的發(fā)展，現(xiàn)在已經(jīng)可以捕捉細(xì)胞圖像到計(jì)算機(jī)內(nèi)存，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行非常精確的測(cè)量。特別有用的是利用DNA特異和化學(xué)計(jì)量的染色方法(即染色與細(xì)胞核DNA和含量成正比)對(duì)細(xì)胞核的DNA進(jìn)行染色，可以測(cè)量細(xì)胞核的特征。例如福爾根染色在定量細(xì)胞學(xué)中得到了廣泛的應(yīng)用。利用這種方法就可以計(jì)算細(xì)胞核的DNA含量，從而計(jì)算出處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞數(shù)目比例，對(duì)不同的細(xì)胞類型進(jìn)行檢測(cè)和分類，以及對(duì)非整倍體細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)等等。DNA含量的變化可作為直接反映腫瘤增殖能力的重要生物學(xué)指標(biāo)。細(xì)胞增殖取決于細(xì)胞核的DNA復(fù)制與細(xì)胞分裂。細(xì)胞癌變的本質(zhì)是細(xì)胞迅速無(wú)限增殖和轉(zhuǎn)移，測(cè)定細(xì)胞核DNA含量，可作為惡性腫瘤的客觀指標(biāo)。然而這種方法受制于DNA固定的好壞、染色的深淺及測(cè)定系統(tǒng)(掃描顯微鏡、數(shù)碼相機(jī)、應(yīng)用軟件等)的品質(zhì)，并且這種方法沒(méi)有利用細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面的信息，而這方面的信息對(duì)很多病例的診斷和預(yù)測(cè)有很大的作用。因此，一般來(lái)說(shuō)，這兩種分析方法(定性和定量)有以下問(wèn)題1、細(xì)胞形態(tài)學(xué)定性分析的方法只基于細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，依賴細(xì)胞學(xué)家的經(jīng)驗(yàn)和技巧，誤診率非常高。2、DNA定量分析方法基于DNA特異的染色方法，依賴于細(xì)胞核的特征，不能提供任何關(guān)于細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面的信息。到目前為止，還沒(méi)有一種方法可以同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征定性分析和DNA定量分析，然而，在許多疾病診斷過(guò)程中，為了提高準(zhǔn)確率，需要同時(shí)進(jìn)行定性和定量?jī)煞矫鏅z測(cè)，因此需要分別進(jìn)行兩次切片和染色，不僅十分麻煩，還增加病患的費(fèi)用負(fù)擔(dān)，而且，定性和定量檢測(cè)的結(jié)果不能一一對(duì)應(yīng)，比如說(shuō)醫(yī)生在觀測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征是發(fā)現(xiàn)某個(gè)具有特異性的細(xì)胞，想得到該細(xì)胞的DNA定量分析數(shù)據(jù)以便進(jìn)行對(duì)照確認(rèn)時(shí)，卻無(wú)法實(shí)現(xiàn)，因?yàn)闊o(wú)法在進(jìn)行DNA定量分析的切片中找到對(duì)應(yīng)的細(xì)胞以進(jìn)行分析。因此，為了同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析和DNA的定量檢測(cè)，亟需一種能同時(shí)將細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜染上不同顏色的細(xì)胞染色試劑及染色方法，本案油然而生。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種能同時(shí)將細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜染上不同顏色的細(xì)胞染色試劑，以便于同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析和DNA的本發(fā)明的再一目的是提供上述細(xì)胞染色試劑的配制方法。本發(fā)明的目的還在于提供一種使用上述細(xì)胞染色試劑同時(shí)將細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜染上不同顏色的染色方法。為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的解決方案是細(xì)胞染色試劑,包括B.S液、染色液、漂洗液、EA50染液，其中5每400毫升B.S液是由甲醇320.0毫升，甲醛60.0毫升，冰乙酸20.0毫升配制而成；每210毫升染色液包括Thionin(硫肼)100.00毫克，叔丁醇液(分析純)87.0毫升，5mol/L鹽酸(分析純)5.2毫升，1800毫克亞硫酸氫鈉(分析純)，余量為蒸餾水；每200毫升漂洗液包括偏重亞硫酸鈉(分析純)l.0克，5mol/L鹽酸(分析純)2.0毫升，蒸餾水198.0毫升；每600毫升EA50染液包括15毫升純凈水，亮綠0.3克，水溶性曙紅Y2克，95%乙醇450毫升，純甲醇125毫升，冰醋酸10毫升，磷鉤酸1克。上述細(xì)胞染色試劑的配制方法如下-B.S液的配制甲醇320.0毫升，甲醛60.0毫升，冰乙酸20.0毫升，混合均勻；染色液的配制精確稱取Thionin(硫肼)IOO.OO毫克，加入蒸餾水100.0毫升加熱煮沸812分鐘后冷卻至45°C55°C(夏季45°C50°C)，加入叔丁醇液(分析純)87.0毫升，混勻后再加入5mol/L鹽酸(分析純)5.2毫升，加入1800毫克亞硫酸氫鈉(分析純)，混合，加蒸餾水至210毫升后置磁力加熱攪拌器上避光攪拌60分鐘后，(攪拌環(huán)境溫度在33。C38。C)過(guò)濾后調(diào)PH至l.31,5(25°C)即可；5mol/L鹽酸的配制取420毫升鹽酸(分析純)原液加蒸餾水至1000.00毫升；漂洗液的配制稱取偏重亞硫酸鈉(分析純)1.0克，加入5mol/L鹽酸(分析純)2.0毫升，加蒸餾水至200.0毫升，混合均勻，漂洗液應(yīng)在使用前現(xiàn)配現(xiàn)用；EA50染液的配制a.用吸管吸取10毫升純凈水置于一只干凈標(biāo)本管中，用記號(hào)筆標(biāo)記伊紅，吸取5毫升純凈水置于另一只干凈標(biāo)本管中，用記號(hào)筆標(biāo)記亮綠；b.稱取亮綠0.3克倒入標(biāo)記亮綠的標(biāo)本管中，蓋上蓋子，用手搖晃直到亮綠完全溶解；c.稱取水溶性曙紅Y2克倒入標(biāo)記伊紅的標(biāo)本管中，蓋上蓋子，用手搖晃直到伊紅完全溶解；d.量取95%乙醇450毫升倒入洗凈的染色缸中，再量取純甲醇125毫升倒入缸中；e.將溶解完全的亮綠液倒入缸中，將溶解完全的伊紅液倒入缸中，吸取冰醋酸10毫升加入缸中，稱取磷鎢酸1克加入缸中，用攪棒攪動(dòng)至混合均勻即可使用。以上描述的細(xì)胞染色試劑各組分的體積和質(zhì)量只是提供一種比例關(guān)系，并不表示本產(chǎn)品發(fā)明的各組分只能使用上述的體積和質(zhì)量。上述細(xì)胞染色試劑在細(xì)胞染色方法中的應(yīng)用，包括以下步驟第1步，將制好的標(biāo)本片自然干燥。第2步，將干燥的標(biāo)本片置入無(wú)水乙醇液內(nèi)固定30分鐘后，直接放入B.S液中固定60分鐘，取出后用蒸餾水洗滌二次，再放入5mol/L的鹽酸內(nèi)酸化60分鐘(酸化溫度在22-C25-C)，取出后用蒸餾水洗滌2次。第3步，將經(jīng)上述處理過(guò)的標(biāo)本片放入染色缸內(nèi)，加滿染色液染色67分鐘(染色溫度在22°C25°C)，傾出染液，用蒸餾水沖洗56次。第4步，用漂洗液洗滌三次(第一次12分鐘，第二次12分鐘，第三次12分鐘)，再用水洗滌2至3次。第5步，進(jìn)入復(fù)染，放入95%乙醇液內(nèi)浸泡23分鐘。第6步，在巴氏染色液III(EA50染液)中染胞槳58分鐘。第7步，放入95%乙醇內(nèi)浸泡23分鐘。第8步，在無(wú)水乙醇中浸泡兩次每次23分鐘。第9步，將干燥的脫水片放入二甲苯原液缸內(nèi)透明3060秒。第10步，將透明過(guò)的標(biāo)本片用中性樹(shù)膠加蓋玻片封固。采用上述方案后，本發(fā)明提供的細(xì)胞染色試劑，能使細(xì)胞核染上較深的顏色，而細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜染上較淺的顏色，使得細(xì)胞被染色后，在顯微鏡捕捉到的圖像中，深色的細(xì)胞核和淺色的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜都能清晰的呈現(xiàn)。這樣，通過(guò)顯微鏡觀察，在定量測(cè)定細(xì)胞核DNA的同時(shí)還能檢測(cè)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征用以定性分析，可以提高細(xì)胞檢測(cè)及分類的準(zhǔn)確性。圖1是經(jīng)染色處理后的細(xì)胞在顯微鏡下觀測(cè)到的圖像；圖2是條形碼為145731的甩片在顯微鏡下觀察的圖像；圖3是條形碼為145732的甩片在顯微鏡下觀察的圖像；圖4是條形碼為145733的甩片在顯微鏡下觀察的圖像；具體實(shí)施例方式以下提供一個(gè)具體實(shí)施例以詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明提供的細(xì)胞染色試劑的配制及使用方法，但并不用于限定本發(fā)明的權(quán)利范圍。染色試劑的配制B.S液的配制甲醇320.0毫升，甲醛60.0毫升，冰乙酸20.0毫升，混合均勻；染色液的配制精確稱取Thionin(硫肼)IOO.OO毫克，加蒸餾水100.0毫升加熱煮沸10分鐘后冷卻至45°C55°C(夏季45°C50°C)，加入叔丁醇液(分析純)87.0毫升，混勻后再加入5mol/L鹽7酸(分析純)5.2毫升，加入1800毫克亞硫酸氫鈉(分析純)，混合，加蒸餾水至210毫升后置磁力加熱攪拌器上避光攪拌60分鐘后，(攪拌環(huán)境溫度在33。C38-C)過(guò)濾后調(diào)PH至1.31.5(25°C)即可；5mol/L鹽酸的配制取420毫升鹽酸(分析純)原液加蒸餾水至1000.00毫升；漂洗液的配制稱取偏重亞硫酸鈉(分析純)1.0克，加入5mol/L鹽酸(分析純)2.0毫升，加蒸餾水至200.0毫升，混合均勻，漂洗液應(yīng)在使用前現(xiàn)配現(xiàn)用；EA50染液的配制(1)用吸管吸取10毫升純凈水置于一只干凈標(biāo)本管中，用記號(hào)筆標(biāo)記伊紅，吸取5毫升純凈水置于另一只干凈標(biāo)本管中，用記號(hào)筆標(biāo)記亮綠；(2)稱取亮綠0.3克倒入標(biāo)記亮綠的標(biāo)本管中，蓋上蓋子，用手搖晃直到亮綠完全溶解；(3)稱取水溶性曙紅Y2克倒入標(biāo)記伊紅的標(biāo)本管中，蓋上蓋子，用手搖晃直到伊紅完全溶解；(4)量取95%乙醇450毫升倒入洗凈的染色缸中，再量取純甲醇125毫升倒入缸中；(5)將溶解完全的亮綠液倒入缸中，將溶解完全的伊紅液倒入缸中，吸取冰醋酸IO毫升加入缸中，稱取磷鎢酸l克加入缸中，用攪棒攪動(dòng)至混合均勻即可使用。使用本發(fā)明提供的細(xì)胞染色試劑對(duì)細(xì)胞切片進(jìn)行染色處理的具體步驟是第1步，將制好的標(biāo)本片自然干燥。第2步，將干燥的標(biāo)本片置入無(wú)水乙醇液內(nèi)固定30分鐘后，直接放入B.S液中固定60分鐘，取出后用蒸餾水洗滌二次，再放入5mol/L的鹽酸內(nèi)酸化60分鐘(酸化溫度在22。C25。C)，取出后用蒸餾水洗滌二次。第3步，將經(jīng)上述處理過(guò)的標(biāo)本片放入染色缸內(nèi)，加滿染色液染色67分鐘(染色溫度在22°C25°C)，傾出染液，用蒸餾水沖洗6次。第4步，用漂洗液洗滌三次(第一次12分鐘，第二次12分鐘，第三次12分鐘)，再用水洗滌2至3次。第5步，進(jìn)入復(fù)染，放入95%乙醇液內(nèi)浸泡23分鐘。第6步，在巴氏染色液III(EA50染液)中染胞漿58分鐘。第7步，放入95%乙醇內(nèi)浸泡23分鐘。第8步，在無(wú)水乙醇中浸泡兩次每次23分鐘。第9步，將干燥的脫水片放入二甲苯原液缸內(nèi)透明3060秒。第10步，將透明過(guò)的標(biāo)本片用中性樹(shù)膠加蓋玻片封固。本發(fā)明提供的染色方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了復(fù)染，以使細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜與細(xì)胞核分別被染上不同深淺的顏色以便觀測(cè)(如圖l所示)。為保證本發(fā)明提供的染色試劑不會(huì)對(duì)細(xì)胞核的DNA定量測(cè)試造成影響，還進(jìn)行了以下兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)81、選取3例標(biāo)本，編號(hào)分別為標(biāo)本l，標(biāo)本2和標(biāo)本3，每例標(biāo)本各做2張甩片，其中一張使用本發(fā)明提供的染色試劑進(jìn)行復(fù)染，將細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)都染上顏色，另一張不經(jīng)過(guò)復(fù)染，只對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行常規(guī)染色，得出細(xì)胞數(shù)Nomal/abnomal(正常/異常)與積分光密度值(IOD)的對(duì)照。參見(jiàn)附表1是經(jīng)過(guò)復(fù)染與沒(méi)有經(jīng)過(guò)復(fù)染的掃描結(jié)果對(duì)比。附表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>參見(jiàn)圖2至圖4，采用本發(fā)明提供的染色方法對(duì)細(xì)胞切片進(jìn)行染色后，在顯微鏡下觀察，背景清楚，胞核染深藍(lán)色，并且一個(gè)個(gè)清晰可見(jiàn)，胞漿多數(shù)呈紅色，少量綠色。從附表1中的DNA檢測(cè)數(shù)據(jù)來(lái)看，經(jīng)過(guò)復(fù)染與沒(méi)有經(jīng)過(guò)復(fù)染的檢測(cè)結(jié)果相近，說(shuō)明此種染色試劑不會(huì)對(duì)細(xì)胞核的DNA定量檢測(cè)產(chǎn)生影響。2.選取5例標(biāo)本，每例標(biāo)本做l張甩片，先用常規(guī)方法對(duì)每例細(xì)胞切片進(jìn)行細(xì)胞核染色，通過(guò)掃描得出DI值(DNA指數(shù))；然后對(duì)細(xì)胞切片進(jìn)行退染，退染后采用本發(fā)明提供的染色方法對(duì)每例細(xì)胞切片進(jìn)行染色，通過(guò)掃描得出DI值(復(fù)染)。附表2是經(jīng)掃描得出的41組細(xì)胞核DI值的對(duì)照。附表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>15<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>以上每組細(xì)胞核的DI值是同一細(xì)胞核經(jīng)常規(guī)方法染色(染色)及采用本發(fā)明提供的染色試劑染色(復(fù)染)后的細(xì)胞核DNA含量(DI值)的對(duì)比，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明，第一組與第二組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。綜上所述，本發(fā)明提供的細(xì)胞染色試劑能使細(xì)胞核染上較深的顏色，而細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜染上較淺的顏色，使得細(xì)胞被染色后，在顯微鏡捕捉到的圖像中，深色的細(xì)胞核和淺色的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜都能清晰的呈現(xiàn)。且采用本發(fā)明提供的染色方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色后，在顯微鏡下觀察，細(xì)胞核呈現(xiàn)較深的顏色，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜呈現(xiàn)較淺的顏色，都能清晰呈現(xiàn)，且不會(huì)對(duì)細(xì)胞核的DNA定量測(cè)定造成影響。這樣，通過(guò)顯微鏡觀察，在定量測(cè)定細(xì)胞核DNA的同時(shí)還能檢測(cè)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征用以定性分析，可以提高細(xì)胞檢測(cè)及分類的準(zhǔn)確性。權(quán)利要求1、細(xì)胞染色試劑，其特征在于包括B.S液、染色液、漂洗液、EA50染液，其中每400毫升B.S液是由甲醇320.0毫升，甲醛60.0毫升，冰乙酸20.0毫升配制而成；每210毫升染色液包括硫肼100.00毫克，叔丁醇液87.0毫升，5mol/L鹽酸5.2毫升，1800毫克亞硫酸氫鈉，余量為蒸餾水；每200毫升漂洗液包括偏重亞硫酸鈉1.0克，5mol/L鹽酸2.0毫升，蒸餾水198.0毫升；每600毫升EA50染液包括15毫升純凈水，亮綠0.3克，水溶性曙紅Y2克，95％乙醇450毫升，純甲醇125毫升，冰醋酸10毫升，磷鎢酸1克。2、如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞染色試劑的配制方法，其特征在于:B.S液的配制甲醇320.0毫升，甲醛60.0毫升，冰乙酸20.0毫升，混合均勻；染色液的配制精確稱取硫肼100.00毫克，加入蒸餾水100.0毫升加熱煮沸812分鐘后冷卻至4555°C，加入叔丁醇液87.0毫升，混勻后再加入5mol/L鹽酸5.2毫升，加入1800毫克亞硫酸氫鈉，混合，加蒸餾水至210毫升后置磁力加熱攪拌器上避光攪拌6070分鐘，攪拌環(huán)境溫度在33-C38。C，過(guò)濾后在25。C調(diào)ffl至1.31.5;漂洗液的配制稱取偏重亞硫酸鈉1.0克，加入5mol/L鹽酸2.0毫升，加蒸餾水至200.0毫升，混合均勻；EA50染液的配制a.用吸管吸取10毫升純凈水置于一只干凈標(biāo)本管中，用記號(hào)筆標(biāo)記伊紅，吸取5毫升純凈水置于另一只干凈標(biāo)本管中，用記號(hào)筆標(biāo)記亮綠；b.稱取亮綠0.3克倒入標(biāo)記亮綠的標(biāo)本管中，蓋上蓋子，用手搖晃直到亮綠完全溶解；c.稱取水溶性曙紅Y2克倒入標(biāo)記伊紅的標(biāo)本管中，蓋上蓋子，用手搖晃直到伊紅完全溶解；d.量取95%乙醇450毫升倒入洗凈的染色缸中，再量取純甲醇125毫升倒入缸中；e.將溶解完全的亮綠液倒入缸中，將溶解完全的伊紅液倒入缸中，吸取冰醋酸10毫升加入缸中，稱取磷鎢酸l克加入缸中，用攪棒攪動(dòng)至混合均勻。3、如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞染色試劑在細(xì)胞染色中的應(yīng)用，其特征在于包括以下步驟第l步，將制好的標(biāo)本片自然干燥；第2步，將干燥的標(biāo)本片置入無(wú)水乙醇液內(nèi)固定30分鐘后，直接放入B.S液中固定60分鐘，取出后用蒸餾水洗滌二次，再放入5mol/L的鹽酸內(nèi)酸化60分鐘，酸化溫度在2225"C，取出后用蒸餾水洗滌2次；第3步，將經(jīng)上述處理過(guò)的標(biāo)本片放入染色缸內(nèi)，加滿染色液染色67分鐘，染色溫度在2225°C，傾出染液，用蒸餾水沖洗56次；第4步，用漂洗液洗滌三次，第一次12分鐘，第二次12分鐘，第三次12分鐘，再用水洗滌2至3次；第5步，進(jìn)入復(fù)染，放入95c/。乙醇液內(nèi)浸泡23分鐘；第6步，在EA50染液中染胞漿58分鐘；第7步，放入95c/。乙醇內(nèi)浸泡23分鐘；第8步，在無(wú)水乙醇中浸泡兩次，每次23分鐘；第9步，將干燥的脫水片放入二甲苯原液缸內(nèi)透明3060秒；第10步，將透明過(guò)的標(biāo)本片用中性樹(shù)膠加蓋玻片封固。全文摘要本發(fā)明提供的細(xì)胞染色試劑，包括B.S液、染色液、漂洗液、EA50染液，其中每400毫升B.S液是由甲醇320.0毫升，甲醛60.0毫升，冰乙酸20.0毫升配制而成；每210毫升染色液包括硫肼100.00毫克，叔丁醇液87.0毫升，5mol/L鹽酸5.2毫升，1800毫克亞硫酸氫鈉，余量為蒸餾水；每200毫升漂洗液包括偏重亞硫酸鈉1.0克，5mol/L鹽酸2.0毫升，蒸餾水198.0毫升；每600毫升EA50染液包括15毫升純凈水，亮綠0.3克，水溶性曙紅Y2克，95％乙醇450毫升，純甲醇125毫升，冰醋酸10毫升，磷鎢酸1克。本發(fā)明還提供了上述細(xì)胞染色試劑的配制方法及其在細(xì)胞染色中的應(yīng)用。文檔編號(hào)C12Q1/04GK101560543SQ200810070939公開(kāi)日2009年10月21日申請(qǐng)日期2008年4月18日優(yōu)先權(quán)日2008年4月18日發(fā)明者布蘭科·帕爾切克申請(qǐng)人:麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司