專利名稱：基于農(nóng)用復(fù)合肥的用于微藻培養(yǎng)的工業(yè)培養(yǎng)基的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用以農(nóng)用復(fù)合肥的可循環(huán)使用的用于微藻培養(yǎng)的工業(yè)培養(yǎng)基 的制備。
背景技術(shù)：
海藻養(yǎng)殖受地域影響較為顯著， 一般局限于沿海等地。在培養(yǎng)過程中如果不 考慮所用培養(yǎng)基的復(fù)雜程度和有效性，生產(chǎn)費用通常是限制海藻培養(yǎng)商業(yè)化的 主要制約因素。海水和無機鹽是培養(yǎng)基的基本組成。為了實現(xiàn)商業(yè)化海藻培養(yǎng)， 使海藻培養(yǎng)引入到最需要的地域，就必須尋找到廉價而又可行的培養(yǎng)基替代海 水進行規(guī)?；B(yǎng)殖。目前，世界各國正在研究海藻的廉價培養(yǎng)。利用好氧消化 后的奶牛糞便和硝酸銨、硫酸銨等農(nóng)業(yè)肥料兩種培養(yǎng)基替代分析純氮源養(yǎng)殖
C/70"drac朋A船c"""/Zcm/"^s，實驗結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)基結(jié)果均沒有顯著差異，表 明處理后的糞便或者農(nóng)業(yè)肥料均可作為該藻的良好營養(yǎng)來源，具備有效、廉價 等優(yōu)點(Pacheco-Ruiz et al" Cienc. 1987; Pacheco-Ruiz et al" Aquaculture. 2004)。 采用養(yǎng)魚廢水以及化肥培養(yǎng)食用型紅藻Gra"7w/"/ "n^;3ora (Rhodophyta)，通 過每天添加一定量銨鹽促進紅藻的生長，可以獲得最高產(chǎn)率達細胞干重40 g/m2.d (Nagler et al., Aquaculture. 2003)。利用曝氣啤酒廢水進行螺旋藻生長研究， 相比分析純組成的CFTRI培養(yǎng)基，螺旋藻相對生長率相同，而蛋白質(zhì)含量相對 低于后者，但這也說明啤酒廢水養(yǎng)殖螺旋藻的可行性(鄭愛榕等，海洋科學(xué). 2004)。選用N:P:K[20:20:20]等農(nóng)業(yè)肥料養(yǎng)殖雨生紅球藻能夠獲得最大的細胞密 度，而且細胞密度比分析純組成的BG11改良培養(yǎng)基高9.8% (Dalay et al.， Journal of Microbiology and Biotechnology. 2007)。在對照培養(yǎng)基中添加一定量 豬糞發(fā)酵液培養(yǎng)綠藻5^w^fesww spp.，添加發(fā)酵液使Sce"^fesww細胞生長速率增加到三倍，且細胞葉綠素a、蝦青素、葉黃素等次生代謝產(chǎn)物都有成倍的提
高，表明添加的物質(zhì)能夠提高綠藻細胞的生理和生化活性；通過充分利用動物 廢水養(yǎng)殖的方法不僅可以獲得更多的營養(yǎng)物質(zhì)，而且能夠減少廢水排放所造成
的環(huán)境污染(Kim et al., Bioresource Technology. 2007)。利用氮源豐富的肥料取代 f/2培養(yǎng)基中的氮源培養(yǎng)三角褐指藻以獲得胞外多糖、可溶性蛋白和S0D等產(chǎn)物， 結(jié)果表明在富含尿素的化肥培養(yǎng)基中三角褐指藻的SOD活性是對照組的三倍 (Guzmdn-Murillo et al.， J Appl Phycol. 2007)。上述實驗研究體現(xiàn)了利用廉價肥料
培養(yǎng)基實現(xiàn)微藻生物量和生物活性物質(zhì)顯著提高已成為可能。
紫球藻(尸o^/^W^wwcn^"/w傷)屬紅藻門的單細胞藻，富含多種生物活性 物質(zhì)，其蛋白質(zhì)含量為32. 1%，氨基酸含量為29. 54%;碳水化合物39.4%，總膳 食纖維21.7%;灰份17.6%，水分7.8%，每千克干藻粉鈣、鎂、鉀和鋅含量分別 為20000mg、 4100mg、 9500mg和92mg;每千克干藻粉P -胡蘿卜素240mg、維生 素B618mg;有毒重金屬鉛、砷和汞含量符合有關(guān)規(guī)定(黃鍵等，食品與發(fā)酵工 業(yè)，2005)。近年來的研究表明紫球藻及其胞外多糖具有(l)抗病毒作用；(2) 調(diào)血脂作用(陳必鏈等，應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2004); (3)抗炎作用或抗腫瘤 細胞作用；(5)抗輻射作用；(6)降血糖作用(劉麗平等，中國海洋藥物，2005; 黃鍵等，福建師范大學(xué)學(xué)報,2006)。開展不同類型的封閉式光生物反應(yīng)器培養(yǎng) 紫球藻，如平板式光生物反應(yīng)器(游文朗等，植物資源與環(huán)境學(xué)報，2006)、攪 拌式光生物反應(yīng)器(陳必鏈等，應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2004)等。研究了超聲 波輻射對紫球藻細胞抗氧化防御體系的影響(BUian Chen et al" Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2008)。由于紫球藻及其胞外多糖藥效學(xué)的研究已取得 明顯進展，因此開展紫球藻的工業(yè)化培養(yǎng)，降低生產(chǎn)成本成為當(dāng)今研究開發(fā)的 熱點和難點。
薔薇藻(i^0^//^e"cMtoa)是與紫球藻同屬紅藻門的單細胞藻，細胞外包 被著一層粘質(zhì)鞘，由細胞生長進入穩(wěn)定期后產(chǎn)生胞外水溶性粘多糖形成。薔薇藻含豐富的藻膽蛋白、胞外多糖和不飽和脂肪酸等天然產(chǎn)物。尤其胞外多糖的
物化性質(zhì)與紫球藻極為相似(Geresh et al., J Biochem Biophys Methods. 2002)， 因此，可能具有類似紫球藻及其胞外多糖的抗病毒、降血糖以及降血脂等功能， 國外許多學(xué)者圍繞薔薇藻的胞外多糖、藻膽蛋白、光合系統(tǒng)等方面進行了研究， 用X射線衍射的方法分析發(fā)現(xiàn)薔薇藻/ . 的葡聚糖為B型(Shimonaga
etal., Plant Cell Physiol. 2008)，純化了薔薇藻的藻膽蛋白，得到B—藻紅蛋白， C一藻藍蛋白和別藻藍蛋白(Mihovaetal.，JBiotechnol. 1996);國內(nèi)張艷燕等研 究氮源對薔薇藻生長代謝的影響(張艷燕等，武漢植物學(xué)研究.2008)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種基于農(nóng)用復(fù)合肥的可循環(huán)使用的用于紫球藻、
薔薇藻培養(yǎng)的工業(yè)培養(yǎng)基的制備方法。
為實現(xiàn)本發(fā)明的目的而采用的技術(shù)方案是采用N、 P、 K含量不同的農(nóng)用
復(fù)合肥作為培養(yǎng)基的組成成分，制備出適用于微藻工業(yè)化初始培養(yǎng)的初始液體
培養(yǎng)基，同時，回收經(jīng)過初始培養(yǎng)后的培養(yǎng)基殘液，經(jīng)與新配制的初始液體培
養(yǎng)基參合，制成可循環(huán)使用的再生液體培養(yǎng)基，上述培養(yǎng)基在保證微藻生物量
和代謝產(chǎn)物產(chǎn)量有所提高的前提下，實現(xiàn)利用農(nóng)用復(fù)合肥取代傳統(tǒng)培養(yǎng)基配方
中的大量化學(xué)純或分析純原料，達到既降低生產(chǎn)成本又提高目標(biāo)產(chǎn)物的目的。
以液體培養(yǎng)基的總體積(L)計，初始液體培養(yǎng)基的配方為檸檬酸鐵0. 025g
/L、工業(yè)鹽12. 5 g /L、農(nóng)用尿素0. 2g /L、碳酸氫鈉0. 5 g /L、混合的農(nóng)用復(fù)
合肥O. 1-1.5g/L。
本發(fā)明所述的農(nóng)用復(fù)合肥指N、P、K比分別是N:P:K[27:6:6]的農(nóng)用復(fù)合肥、 N:P:K[16:0:9]的農(nóng)用復(fù)合肥、N:P:K[16:16:16]的農(nóng)用復(fù)合肥或N:P:K [20:20:20]的農(nóng)用復(fù)合肥。所述的混合的農(nóng)用復(fù)合肥是指上述農(nóng)用復(fù)合肥一種 或多種以任意比例的混合。
以液體培養(yǎng)基的總體積(L)計，可循環(huán)使用的再生液體培養(yǎng)基的配方為培養(yǎng)基殘液與初始液體培養(yǎng)基比為10%-50%: 50%-90%。
本發(fā)明所述的微藻是指紅藻門的單細胞類群的紫球藻、薔薇藻。 根據(jù)配方制備微藻培養(yǎng)液，將配好的培養(yǎng)液分裝于250 mL三角瓶中，每個 三角瓶裝100 mL培養(yǎng)液，接入對數(shù)期藻種，置往復(fù)式搖床培養(yǎng)，往復(fù)頻率為 90r/min，光照強度4500kix，溫度25 。C。于培養(yǎng)周期結(jié)束收集并測定藻細胞 干重、藻紅蛋白含量和胞外多糖含量。
本發(fā)明采用農(nóng)用復(fù)合肥替代微藻培養(yǎng)配方中的化學(xué)純或分析純成分，具有 方法易行、操作安全，可大幅度降低生產(chǎn)成本，與采用化學(xué)純或分析純培養(yǎng)基 配方相比，采用農(nóng)用化肥培養(yǎng)基配方可降低培養(yǎng)基成本30%-70%，同時微藻的生 物量、胞外多糖、藻膽蛋白等生理活性產(chǎn)物產(chǎn)量有不同程度的提高，有較大的 推廣應(yīng)用價值。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的說明。 實施例1
按照以下配方制備紫球藻培養(yǎng)基在塑料桶中預(yù)先加入970 L的清水，在 攪拌的同時，逐步加入28g的檸檬酸鐵、12500g的工業(yè)鹽、200g的農(nóng)用尿素、 500g的碳酸氫鈉、按300g的N:P:K[16:0:9]的農(nóng)用復(fù)合肥，500g的 N'.P:K[16:16:16]的農(nóng)用復(fù)合肥和400g的N:P:K[27:6:6]的農(nóng)用復(fù)合肥混合而 成的混合農(nóng)用復(fù)合肥并使其完全溶解，即配制成初始液體培養(yǎng)基998 L。
取初始液體培養(yǎng)基250mL于三角瓶中，接入對數(shù)期紫球藻藻種，置往復(fù)式 搖床培養(yǎng)，光照強度45001lix，溫度25 °C。培養(yǎng)周期結(jié)束后，以收獲時的生物 量與采用KOCH配方相比，提高了12.5%。同時，胞外多糖、藻膽蛋白的含量也 相應(yīng)有所提高。經(jīng)測算培養(yǎng)基配方成本降低40%。
實施例2按照以下配方制備紫球藻培養(yǎng)基在塑料桶中預(yù)先加入975 L的清水，在 攪拌的同時，逐步加入43g的檸檬酸鐵、10500g的工業(yè)鹽、200g的農(nóng)用尿素、 500g的碳酸氫鈉、按300g的N:P:K[16:0:9]的農(nóng)用復(fù)合肥，600g的 N:P:K[27:6:6]的農(nóng)用復(fù)合肥，即配制成初始液體培養(yǎng)基996 L。
取初始液體培養(yǎng)基500mL于三角瓶中，接入對數(shù)期紫球藻藻種，置往復(fù)式 搖床培養(yǎng)，光照強度45001ux，溫度24。C。培養(yǎng)周期結(jié)束后，以收獲時的生物 量與采用KOCH配方相比，提高了11.8%。同時，胞外多糖、藻膽蛋白的含量也 相應(yīng)有所提高。經(jīng)測算培養(yǎng)基配方成本降低38%。
實施例3
按照以下配方制備紫球藻培養(yǎng)基在塑料桶中預(yù)先加入980 L的清水，在 攪拌的同時，逐步加入35g的檸檬酸鐵、11450g的工業(yè)鹽、450g的農(nóng)用尿素、 600g的碳酸氫鈉、700g的N:P:K[27:6:6]的農(nóng)用復(fù)合肥，即配制成初始液體培養(yǎng)基。
取初始液體培養(yǎng)基500L分裝于大燒瓶中，接入對數(shù)期紫球藻藻種，置往復(fù) 式搖床培養(yǎng)，光照強度45001ux，溫度25i:。培養(yǎng)周期結(jié)束后，以收獲時的生 物量與采用KOCH配方相比，提高了 10.5%。同時，胞外多糖、藻膽蛋白的含量 也相應(yīng)有所提高。經(jīng)測算培養(yǎng)基配方成本降低43%。
紫球藻收獲后，對培養(yǎng)基殘液進行粗慮，取其清液200L，加入300 L初始
液體培養(yǎng)基，混勻，分裝于大燒瓶中，接入對數(shù)期紫球藻藻種，置往復(fù)式搖床
培養(yǎng)，光照強度45001ux，溫度25 'C。培養(yǎng)周期結(jié)束后，以收獲時的生物量與
采用KOCH配方相比，提高了9.5%。同時，胞外多糖、藻膽蛋白的含量也相應(yīng)有
所提高。經(jīng)測算培養(yǎng)基配方成本降低56%。 實施例4
按照以下配方制備薔薇藻培養(yǎng)基在塑料桶中預(yù)先加入983 L的清水，在攪拌的同時，逐步加入40g的檸檬酸鐵、10000g的工業(yè)鹽、150g的農(nóng)用尿素、 400g的碳酸氫鈉、1300g的N:P:K[16:0:9]的農(nóng)用復(fù)合肥，并使其完全溶解， 即配制成初始液體培養(yǎng)基。
取初始液體培養(yǎng)基500L分裝于大燒瓶中，接入對數(shù)期薔薇藻藻種，置往復(fù) 式搖床培養(yǎng)，光照強度45001ux，溫度25 。C。培養(yǎng)周期結(jié)束后，以收獲時的生 物量與采用KOCH配方相比，提高了11.5%。同時，胞外多糖、藻膽蛋白的含量 也相應(yīng)有所提高。經(jīng)測算培養(yǎng)基配方成本降低46%。
薔薇藻收獲后，對培養(yǎng)基殘液進行粗慮，取清液450L，加入450 L初始液 體培養(yǎng)基，混勻，分裝于大燒瓶中，接入對數(shù)期薔薇藻藻種，置往復(fù)式搖床培 養(yǎng)，光照強度45001ux，溫度25 °C。培養(yǎng)周期結(jié)束后，以收獲時的生物量與采 用KOCH配方相比，提高了8.5%。同時，胞外多糖、藻膽蛋白的含量也相應(yīng)有所 提高。經(jīng)測算培養(yǎng)基配方成本降低45%。
權(quán)利要求
1、一種基于農(nóng)用復(fù)合肥的可循環(huán)使用的用于微藻培養(yǎng)的工業(yè)培養(yǎng)基的配制，其特征是以液體培養(yǎng)基的總體積L計，初始液體培養(yǎng)基的配方為檸檬酸鐵0.025g～0.045g/L、工業(yè)鹽10.5g～12.45g/L、農(nóng)用尿素0.1g～0.45g/L、碳酸氫鈉0.5g/L、混合的農(nóng)用復(fù)合肥0.1-1.5g/L；以液體培養(yǎng)基的總體積L計，可循環(huán)使用的再生培養(yǎng)基的配方為培養(yǎng)基殘液與初始液體培養(yǎng)基比為10％-50％∶50％-90％。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于農(nóng)用復(fù)合肥的可循環(huán)使用的用于微藻培養(yǎng)的工業(yè) 培養(yǎng)基的配制，其特征是所述的農(nóng)用復(fù)合肥是指N、 P、 K比分別是N : P : K[27:6 : 6]的農(nóng)用復(fù)合肥、N : P : K[16 : 0 : 9]的農(nóng)用復(fù)合肥、N:P:K[16 : 16 : 16] 的農(nóng)用復(fù)合肥或N:P:K [20:20:20]的農(nóng)用復(fù)合肥。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于農(nóng)用復(fù)合肥的可循環(huán)使用的用于微藻培養(yǎng)的工業(yè) 培養(yǎng)基的配制，其特征是所述的混合的農(nóng)用復(fù)合肥是指上述農(nóng)用復(fù)合肥一種或 多種任意比例的混合。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于農(nóng)用復(fù)合肥的可循環(huán)使用的用于微藻培養(yǎng)的工業(yè) 培養(yǎng)基的配制，其特征是所述的微藻是指紅藻門的單細胞類群的紫球藻、薔薇藻。
全文摘要
本發(fā)明涉及采用以農(nóng)用復(fù)合肥的可循環(huán)使用的用于微藻培養(yǎng)的工業(yè)培養(yǎng)基的配制。本發(fā)明采用技術(shù)方案是采用N、P、K含量不同的農(nóng)用復(fù)合肥作為培養(yǎng)基的組成成分，在添加檸檬酸鐵、工業(yè)鹽、農(nóng)用尿素、碳酸氫鈉、混合的農(nóng)用復(fù)合肥后，配制出適用于微藻工業(yè)化培養(yǎng)的初始液體培養(yǎng)基，同時，將回收培養(yǎng)基殘液，經(jīng)與新配制的初始液體培養(yǎng)基參合，制成可循環(huán)使用的再生培養(yǎng)基。使用本發(fā)明所述的培養(yǎng)基，所收獲的微藻生物量和代謝產(chǎn)物產(chǎn)量有不同程度的提高，所采用的農(nóng)用復(fù)合肥替代微藻培養(yǎng)配方中的化學(xué)純或分析純成分，具有方法易行、操作安全，可大幅度降低生產(chǎn)成本30％-60％。
文檔編號C12N1/12GK101451106SQ20081007252
公開日2009年6月10日 申請日期2008年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日
發(fā)明者莊惠如, 楊春康, 陳偉平, 陳必鏈, 鍵 黃 申請人:福建師范大學(xué)