專利名稱：兩種抑制“肌肉生長(zhǎng)抑制素基因”表達(dá)的合成小干擾rna分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠?qū)∪庖种扑鼗虍a(chǎn)生顯著抑制作用的小干擾RNA分子的 設(shè)計(jì)、合成和抑制作用在肌肉細(xì)胞上的評(píng)價(jià)方法。
背景技術(shù)：
肌肉的生長(zhǎng)性狀(包括產(chǎn)量和質(zhì)量)決定著肉用家畜的生產(chǎn)性能。產(chǎn)肉性 能的好壞，除與家畜的營(yíng)養(yǎng)和飼養(yǎng)管理因素有關(guān)外，主要決定于遺傳因素，即主 要受與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的調(diào)控。肌肉抑制素基因(myostatin，簡(jiǎn)稱MSTN) 是一種抑制肌肉細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控基因，該基因表達(dá)的抑制或突變失活， 能阻斷MSTN對(duì)肌細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的抑制作用，引起廣泛的肌肉增殖并顯著降低體 表脂肪的沉積，產(chǎn)生以肌纖維數(shù)量顯著增加為特征的肌肥大現(xiàn)象，即所謂的"雙 肌性狀"。根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道，目前在牛、羊、豬、人和鼠上都發(fā)現(xiàn)了與雙 肌性狀相關(guān)的突變基因型。除突變基因型外，通過(guò)生物技術(shù)手段阻斷MSTN基因 表達(dá)和功能，同樣能夠復(fù)制出類似MSTN突變產(chǎn)生的雙肌性狀。根據(jù)MSTN基因結(jié) 構(gòu)和作用機(jī)制，通過(guò)生物技術(shù)手段阻斷MSTN對(duì)肌肉生長(zhǎng)的抑制作用來(lái)促進(jìn)肌肉 生長(zhǎng)發(fā)育的研究已經(jīng)成為MSTN研究的熱點(diǎn)。siRNA干擾技術(shù)是最近兩年來(lái)發(fā)展起 來(lái)的阻斷基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的新技術(shù)，其阻斷基因轉(zhuǎn)錄的功能已在各種不同基因上 得到了充分的證明，并被廣泛應(yīng)用。針對(duì)MSTN的基因結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)合成能夠有效 抑制MSTN基因表達(dá)的干擾RNA分子，對(duì)深入研究家畜肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制和研制促進(jìn)家畜肌肉生長(zhǎng)的生物制劑具有重要意義和廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)GeneBank中MSTN從啟始密碼(ATG)至終止密碼(TGA)共1128bp 編碼區(qū)序列，用siRNA設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)干擾MSTN基因轉(zhuǎn)錄的siRNA分子群，從設(shè) 計(jì)的87條siRNA分子中，根據(jù)結(jié)構(gòu)和位置選出8條針對(duì)不同位點(diǎn)的siRNA序列 進(jìn)行合成。將合成的兩條單鏈互補(bǔ)的siRNA分子經(jīng)退火形成雙鏈后，分別連接 到pSilence4. 1 siRNA專一性表達(dá)載體上，構(gòu)建了 8個(gè)干擾RNA質(zhì)粒(pSi-MSTN)。 干擾RNA質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染C2d2小鼠成肌細(xì)胞，建立了最佳外源基因轉(zhuǎn) 染條件。48小時(shí)后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，通過(guò)實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)肌 肉細(xì)胞MSTNmRNA表達(dá)水平，分析了 siRNA對(duì)MSTN的干擾抑制作用。通過(guò)分析 比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞MSTN表達(dá)水平與肌細(xì)胞生長(zhǎng)的相關(guān)性，評(píng)價(jià)了 siRNA 對(duì)MSTN基因表達(dá)的阻斷作用和促進(jìn)肌肉細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的作用。最終獲得 PSi-717和pSi-986兩種能夠有效抑制MSTN基因表達(dá)的siRNA分子。
具體實(shí)施例方式
1、 siRNA表達(dá)載體構(gòu)建
各取10ul lOuM的兩條siRNA寡核苷酸(正鏈和互補(bǔ)鏈)，加入8iU 10X annealing buffer和12ul滅菌超純水，煮沸10分鐘后自然冷卻至室溫。同 時(shí)pSilencer4. l質(zhì)粒載體經(jīng)Bam HI和Hind III雙酶切后回收線性化質(zhì)粒，與 退火產(chǎn)物4'C過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，LB平板氨芐青霉素 (lOOug/ul)篩選。用載體檢測(cè)引物及siRNA寡核苷酸引物篩選陽(yáng)性克隆并送 上海生工測(cè)序鑒定序列正確后，提取純化重組質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染。
2、 siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CA2細(xì)胞轉(zhuǎn)染前一天按每孔2. 5X 1()5個(gè)/mL的密度將C2C,2細(xì)胞接種于六孔板，用2ml 含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。24h后細(xì)胞達(dá)到60% 70%匯合度時(shí)， 將4ug的siRNA表達(dá)載體(包括無(wú)關(guān)基因?qū)φ召|(zhì)粒)和10ul (l"g/ul)的 Lipo-fectamine 2000加入50 y 1無(wú)血清的OPTI-MEM I ，混勻后室溫下放置20 分鐘。將質(zhì)粒DNA和脂質(zhì)體復(fù)合物加入含2毫升無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液的細(xì)胞中， 輕輕混勻，37°C、 5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時(shí)后，更換為含有10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)液。培養(yǎng)48小時(shí)后收獲細(xì)胞，用Trizol法提取總RNA。 3、 siRNA抑制效果在肌肉細(xì)胞上的評(píng)價(jià)
上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，通過(guò)實(shí)時(shí)定量熒光PCR對(duì)MSTN 基因表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析，評(píng)價(jià)對(duì)MSTN基因表達(dá)的抑制效果。定量分析方法 如下Q腦tiTect SYBR Green I試劑進(jìn)行Real time PCR， PCR反應(yīng)體系為: 2xmaster mix 10P 1,上下游引物(10 pm)各0. 5ul; cDNA 2wl。 PCR反應(yīng)條 件為95°C 15min預(yù)變性后進(jìn)行如下循環(huán)95°C 10s, 58°C 20s，72。C 20s， 55 個(gè)循環(huán)后進(jìn)入融解曲線分析程序40°C-99°C (0. rc/s)。通過(guò)相對(duì)定量分析， PSi-717能夠有效抑制61%的MSTN的轉(zhuǎn)錄，pSi-986能夠有效抑制53%的轉(zhuǎn)錄。本專利所設(shè)計(jì)的核苷酸弓I物序列如下
MSTN-Si-986:
(正鏈)5， GATCCGCAAACCCCAGAGGTTCAGTTCAAGAGACTGAACCTCTGGGGTTTGCTTA3 (負(fù)鏈)5， AGCTTAAGCAAACCCCAGAGGTTCAGTCTCTTGAACTGAACCTCTGGGGTTTGCG3 MSTN-Si-717:
(正鏈)5， GATCCCCTTCCCAGAACCAGGAGATTCAAGAGATCTCCTGGTTCTGGGAAGGTTA3 (負(fù)鏈)5， AGCTTAACCTTCCCAGAACCAGGAGATCTCTTGAATCTCCTGGTTCTGGGAAGGG權(quán)利要求
1 兩個(gè)針對(duì)肌肉生長(zhǎng)抑制素基因編碼區(qū)的干擾RNA序列。
2 構(gòu)建的兩個(gè)干擾RNA真核表達(dá)載體。
3 兩個(gè)干擾RNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染肌肉細(xì)胞的方法。
全文摘要
本發(fā)明公布了兩種抑制“肌肉生長(zhǎng)抑制素基因”的合成小干擾RNA分子。發(fā)明涉及對(duì)肌肉抑制素基因產(chǎn)生顯著抑制作用的體外合成小干擾RNA分子的設(shè)計(jì)、合成和抑制效果的評(píng)價(jià)。根據(jù)GeneBank中MSTN序列設(shè)計(jì)siRNA分子群，選擇針對(duì)不同位點(diǎn)的8條siRNA序列進(jìn)行合成，siRNA單鏈分子經(jīng)退火、連接到pSilence4.1專一表達(dá)載體上，構(gòu)建pSi-MSTN表達(dá)質(zhì)粒。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染小鼠成肌細(xì)胞C₂C₁₂，建立最佳外源基因轉(zhuǎn)染條件。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集C₂C₁₂細(xì)胞，提取總RNA，通過(guò)實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)肌肉細(xì)胞MSTN mRNA表達(dá)水平，分析siRNA對(duì)MSTN的干擾抑制作用。分析比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞MSTN表達(dá)水平與肌細(xì)胞生長(zhǎng)的相關(guān)性，評(píng)價(jià)siRNA對(duì)MSTN基因表達(dá)的阻斷作用和促進(jìn)肌肉細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的作用，獲得pSi-717和pSi-986兩種有效抑制MSTN基因表達(dá)的siRNA分子載體。
文檔編號(hào)C12N15/79GK101591652SQ20081007288
公開(kāi)日2009年12月2日 申請(qǐng)日期2008年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月26日
發(fā)明者劉明軍, 劉晨曦, 森 唐, 馬曉林 申請(qǐng)人:新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院中國(guó)-澳大利亞綿羊育種研究中心