專利名稱：使用基因工程菌生產(chǎn)d(-)-酒石酸或其鹽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列、編碼所述酶的核
苦酸序列、表達(dá)所述酶的重組孩i生物，以及使用所述的酶和/或重組纟鼓生物由 順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽生產(chǎn)D(-)-酒石酸或其鹽的方法。
背景技術(shù)：
D(-)-酒石酸，又名(2S，3S)-2,3-二羥丁烷-l，4-二羧酸，是天然L(+)-酒石酸 的同型異構(gòu)體，在自然界中極少存在，在制藥行業(yè)它主要被用作手性合成的 手性源及拆分劑。目前D(-)-酒石酸的需求量正在逐年遞增，迫切需要提高產(chǎn) 量，以滿足國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的需求。
到目前為止，D(-)-酒石酸的生產(chǎn)方法主要有三種(1)利用化學(xué)拆分劑 將DL-酒石酸拆分為L(zhǎng)(+)-酒石酸和D(-)-酒石酸的化學(xué)拆分法。如Lola等 (Chinese J Chem Eng 2002, 10(2):244-248)以 L(-)隱a-曱千基胺 (L(-)-a-methylbenzyl amine)為拆分劑實(shí)現(xiàn)了將DL-酒石酸分離制得L(+)-酒石 酸和D(-)-酒石酸。不過(guò)這類手性拆分劑往往價(jià)格昂貴， 一次拆分后對(duì)映體的 光學(xué)純度和得率均較低，且后續(xù)分離純化工藝復(fù)雜，導(dǎo)致其生產(chǎn)成本居高不 下；(2)利用特殊微生物將DL-酒石酸中的L(+)-酒石酸耗竭而得到D(-)-酒石 酸的生物拆分法。如日本未經(jīng)審查的專利申請(qǐng)(JP申請(qǐng)?zhí)?4490， 1975)報(bào)道的 利用氣桿菌屬的菌種04era6acfer平)，Sato等(US Patent 4904589, 1990; EP 0311835B1, 1993)利用假單胞菌屬的菌種CPsewfifomowo^/7.)、隱球菌屬的菌種 (Oj^ptococciw平)、絲孑包酵母屬的菌種(7Hc/zospora" s/ . )和克雷伯氏菌屬的菌 種(K/eZmW/a平)，JP-63245693 (1988)利用假單胞菌屬的菌種等微生物對(duì)DL-酒石酸中的L(+)-酒石酸進(jìn)行選擇性同化。不過(guò)該方法的原理決定了從原料 DL-酒石酸到產(chǎn)物D(-)-酒石酸的理論得率最高只有50%,從而使該方法的制 備成本較高；(3)利用微生物所分泌表達(dá)的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶 (c紅-epoxysuccinate hydrolase, ESH)將順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽催化水解為D(-)-酒石酸或其鹽的生物轉(zhuǎn)化法。如Yamagishi等(JP-08245497, 1996; Ann N Y
4Acad Sci 1996, 799: 784-785)利用惡臭假單胞菌(尸化^fowo"似/ w"&) MCI3037， Asai等(JP-2000-295992， 2000)利用產(chǎn)堿桿菌屬菌種(^/￡^//^"^平) MCI3611, Li等(FEMS Microbiol Lett, 2007, 267: 214-220)利用博德特氏菌屬 的菌種(SoWefe〃a 1-3將順式環(huán)氧琥珀酸轉(zhuǎn)化為D(-)-酒石酸。 一般認(rèn)為， 生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)D(-)-酒石酸具有酶立體專一性好、酶促反應(yīng)快、產(chǎn)品光學(xué)純 度和產(chǎn)品得率高、產(chǎn)品分離純化簡(jiǎn)單易行等特點(diǎn)，不僅克服了前述兩種方法 存在的缺陷，且大幅降低了生產(chǎn)成本，因此釆用ESH酶的生物轉(zhuǎn)化法制備 D(-)-酒石酸將成為D(-)-酒石酸生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展方向。然而，由于微生物體內(nèi) 固有的酶系統(tǒng)非常復(fù)雜，ESH酶的表達(dá)量不高，其活性亦受到多種胞內(nèi)外因 素的多重制約，導(dǎo)致D(-)-酒石酸生產(chǎn)效率低下。利用基因工程技術(shù)構(gòu)建具有 ESH酶編碼基因的基因工程菌，實(shí)現(xiàn)ESH酶的高效表達(dá)將成為生物轉(zhuǎn)化法工 業(yè)生產(chǎn)D(-)-酒石酸的關(guān)^:。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及如下方面
(1) 一種順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多肽，其由來(lái)源于博德特氏菌(SoWefe〃a sp.)的多核苷酸編碼，其分子量約為32kDa;
(2) (1)的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多肽，其在pH6.5、 M。C的條件下具有 最高的酶活力，在pH 6.5-8.5、 30-50 。C條件下酶活力達(dá)到最高酶活力的70% 以上；
(3) (l)的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多肽，其通過(guò)一種重組;微生物菌抹的胞內(nèi) 表達(dá)而獲得；
(4) (l)的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多肽，其中所述的重組微生物菌抹為一種 細(xì)菌或真菌；
(5) (1)的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序 列與SEQ ID NO:7所示氨基酸序列具有50%以上的同源性；
(6) (5)的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序 列與SEQ ID NO:7所示氨基酸序列具有70%以上的同源性；
(7) (6)的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序 列與SEQIDNO:7所示氨基酸序列具有90%以上的同源性；
(8) (l)的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多肽，其特征在于所述多肽包含全部或部
5分SEQ ID NO:7所示氨基酸序列，并且具有順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活性；
(9) (1H8)的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多肽的多核苷酸；
(10) (9)的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:6所示的核香酸序列；
(11) (10)的多核苷酸，其由SEQIDNO:6所示的核苷酸序列組成；
(12) —種載體，其包含(9)-(ll)的核苷酸序列，和任選的一個(gè)或多個(gè)來(lái)源 于同源或異源微生物的調(diào)控序列；
(13) —種重組微生物菌抹，其表達(dá)(l)-(8)的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多肽；
(14) (13)的重組微生物菌抹，其表達(dá)的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多肽是由 (9)-( 11)的多核香酸編碼的；
(15) (13)-(14)的重組微生物菌抹，其用(12)的載體轉(zhuǎn)化；
(16) —種生產(chǎn)D(-)-酒石酸或其鹽的方法，其包括使用(l)-(8)的順式環(huán)氧 琥珀酸水解酶多肽或由(9)-(1 l)的多核苷酸編碼的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多肽 與順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽反應(yīng)；
(17) —種生產(chǎn)D(-)-酒石酸或其鹽的方法，其包括如下步驟
(a) 在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)(13)-(15)的重組微生物菌抹；
(b) 將步驟(a)中得到的重組微生物菌抹的細(xì)胞、細(xì)胞抽提物或無(wú)細(xì)胞抽 提物或由所述微生物菌抹純化的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶固定在固體支持物上 或包埋在固定載體中；
(c) 將步驟(b)中得到的制備物與順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽在適于水解的條 件下反應(yīng)以生產(chǎn)D(-)-酒石酸或其鹽；和
(d) 任選地重復(fù)利用上述固定或包埋的酶和/或細(xì)胞。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及一種用于編碼一種順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的核苷酸序列，其 來(lái)源于分離純化的博德特氏菌(5oWete〃a sp.)，優(yōu)選為具有中國(guó)微生物菌種保 藏管理委員會(huì)普通微生物保藏中心館藏號(hào)CGMCCNo. 2075的微生物。
本發(fā)明涉及的編碼順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多肽的核苷酸序列(基因組 DNA、 cDNA或RNA)，與SEQ ID NO:6所示核香酸序列具有50%以上，優(yōu) 選為70%以上，更優(yōu)選為90%以上的同源性。
本發(fā)明涉及的編碼順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多肽的核苷酸序列含有全部 SEQ ID NO:6所示序列的核苷酸序列或含有部分SEQ ID NO:6所示序列的核香酸序列。
本發(fā)明涉及的"含有部分SEQIDNO:6所示序列的核苷酸序列"是指該 序列含有超過(guò)100個(gè)與SEQIDNO:6所示序列中的核苷酸相同的核苷酸，亦 指其編碼的蛋白具有與由全部SEQ ID NO:6所示序列編碼的蛋白(即SEQ ID NO:7的完整氨基酸序列)相似的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力。
本發(fā)明的"含有部分SEQIDNO:6所示序列的核苷酸序列"編碼的蛋白 具有與由全部SEQ ID NO:6所示序列編碼的蛋白(即SEQ ID NO:7)相似的順 式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力，優(yōu)選具有SEQ ID NO:7 80%以上的順式環(huán)氧琥珀 酸水解酶活力，優(yōu)選具有SEQ ID NO:7 100%的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力。
本發(fā)明提供一種重組核苷酸序列，其含有前述編碼順式環(huán)氧琥珀酸水解 酶多肽的核苷酸序列，且鄰接有一個(gè)或多個(gè)、來(lái)源于同源或異源微生物的調(diào) 控序列。
本發(fā)明所述調(diào)控序列，其包括選自啟動(dòng)子序列、分泌信號(hào)序列、終止信 號(hào)序列等調(diào)控序列中的 一種或多種。
本發(fā)明涉及一種含有前述編碼順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多肽的核苷酸序列 的載體，其任選地還包含一個(gè)或多個(gè)來(lái)源于同源或異源微生物的調(diào)控序列。
本發(fā)明所述"載體"系指所有可用于將核苷酸序列轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主 細(xì)胞的生物化學(xué)構(gòu)架。本發(fā)明涉及的載體可為質(zhì)粒、病毒、噬菌粒、脂質(zhì)體、 陽(yáng)離子嚢泡中的一種或幾種。上述載體中可以包含一個(gè)或多個(gè)前述的調(diào)控序 列。本發(fā)明的載體優(yōu)選為質(zhì)粒，如pET系列、pGEX系列、pQE系列、pPR0EX 系列等。
本發(fā)明涉及的宿主細(xì)胞，優(yōu)選為一種重組宿主細(xì)胞，其由本發(fā)明所述核 苷酸序列或載體經(jīng)轉(zhuǎn)化(如氯化鈣法、硫酸鎂法、高壓電穿孔法等)而來(lái)。
"本發(fā)明所述核苷酸序列或載體經(jīng)轉(zhuǎn)化而來(lái)的宿主細(xì)胞"，系指該宿主本 身沒(méi)有前述的編碼順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多肽的核苷S吏序列或載體，而是經(jīng) 過(guò)轉(zhuǎn)化后，使得宿主帶有該核苷酸序列或載體。
上述宿主菌能表達(dá)前述編碼順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多肽的核苷酸序列或 載體，并且產(chǎn)生前述核普酸序列或載體編碼的氨基酸序列。本發(fā)明涉及的前 述核普酸序列能整合到所選宿主的基因組中，或以游離型載體的形式存在于 前述宿主細(xì)^<中。
為了便利起見(jiàn)，本發(fā)明涉及的重組宿主細(xì)胞包括微生物，優(yōu)選為細(xì)菌和
7真菌，包括酵母。上述重組宿主細(xì)胞經(jīng)改造優(yōu)選后，能高水平表達(dá)順式環(huán)氧 琥珀酸水解酶。
上述"高水平表達(dá)"是在前述重組宿主細(xì)胞中，通過(guò)相鄰調(diào)控序列控制 前述核苷酸序列來(lái)實(shí)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)。
本發(fā)明還涉及分離純化后得到的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列， 其由前述分離純化后的核苷酸編碼，并(或)由前述重組宿主細(xì)胞表達(dá)。
本發(fā)明的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶具有較強(qiáng)的溫度穩(wěn)定性，50 。C保溫30 分鐘后仍剩有70°/。以上的活力，其在30-50 。C，優(yōu)選為35-45 。C有較高的活 力(最高酶活的75%以上)。
本發(fā)明的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶具有較強(qiáng)的pH穩(wěn)定性，在pH4.6-9.0， 優(yōu)選為pH 5.0-8.0，更優(yōu)選為pH 6.0-7.0之間放置30分鐘后仍剩有90%以上 的活力，其在pH 6.0-8.5，優(yōu)選為pH 6.0-7.0之間有較高的活力(最高酶活的 70%以上)。
本發(fā)明的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶，其分子量在25-35 kDa，優(yōu)選為約32 kDa (理論值為32.4779 kDa)。
本發(fā)明的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶氨基酸序列或其多肽由前述重組宿主細(xì) 胞胞外或胞內(nèi)表達(dá)和(或)分泌表達(dá)。
本發(fā)明的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶氨基酸序列與SEQ ID NO:7所示氨基酸 序列具有50%以上，優(yōu)選為70%以上，更優(yōu)選為90%以上的同源性。
本發(fā)明的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶氨基酸序列具有SEQ ID NO:7所示氨基 酸序列的全部或部分(50個(gè)以上，優(yōu)選100個(gè)以上的氨基酸)，其順式環(huán)氧琥 珀酸水解酶活力至少為完整氨基酸序列SEQ ID NO:7的80%以上，優(yōu)選為 95%以上。即，可將本發(fā)明的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列部分缺失 或?qū)⒉糠中蛄胁迦肫渲校钥删S持其活力。本發(fā)明的順式環(huán)氧琥珀酸水解 酶或其部分序列的分子量約32kDa或更低或更高。
本發(fā)明涉及的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶可通過(guò)無(wú)爭(zhēng)議的酶實(shí)-驗(yàn)鑒定，比如 將順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽水解成D(-)-酒石酸或其鹽。在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 孩吏生物并產(chǎn)酶。用該培養(yǎng)物或分離該培養(yǎng)物中的孩i生物細(xì)胞，并測(cè)其酶活力。
在合適的培養(yǎng)中誘導(dǎo)野生型微生物或本發(fā)明所述的重組細(xì)胞產(chǎn)順式環(huán)氧 琥珀酸水解酶，通過(guò)熟知的方法如柱層析，分離出目的順式環(huán)氧琥珀酸水解 酶，檢測(cè)酶氨基S臾序列的"活性部位，，，并從上述野生型微生物或重組細(xì)胞中獲得編碼順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的DNA序列。
編碼順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的DNA序列，通過(guò)從《效生物中純化出的順式 環(huán)氧琥珀酸水解酶的N-末端序列和GenBank中登錄號(hào)為E50984的序列獲得。
本發(fā)明中，通過(guò)純化出的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的N-末端序列和 GenBank中登錄號(hào)為E50984的序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過(guò)PCR技術(shù)，將約0.9 kb 含順式環(huán)氧琥珀酸水解酶編碼序列的PCR產(chǎn)物插入pUCm-T載體，并將該質(zhì) 粒命名為pUCm-T-ESH。整個(gè)插入片段的DNA序列通過(guò)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員 熟知的測(cè)序技術(shù)檢測(cè)。
設(shè)計(jì)含AWeI和5am//1限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物，通過(guò)PCR技術(shù)，得 到含順式環(huán)氧琥珀酸水解酶編碼序列的PCR產(chǎn)物，并用7V&I和限 制性內(nèi)切酶消化該P(yáng)CR產(chǎn)物，并將該酶切后的片4爻插入pET22b(+)載體相應(yīng) 的限制性酶切位點(diǎn)處，將該質(zhì)粒命名為pET22b-ESH。整個(gè)插入片l殳的DNA 序列通過(guò)術(shù)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的測(cè)序技術(shù)檢測(cè)。
上述構(gòu)建好的表達(dá)載體在大腸桿菌宿主中表達(dá)。含pET22b-ESH質(zhì)粒的 上述大腸桿菌宿主培養(yǎng)在含相應(yīng)抗生素的合適培養(yǎng)基(比如LB培養(yǎng)基)中，使 pET22b-ESH質(zhì)粒能持續(xù)的存在于宿主細(xì)胞中，然后收集上述細(xì)胞并測(cè)定順式 環(huán)氧琥珀酸水解酶活力。本發(fā)明中順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因并不僅限于在 大腸桿菌中表達(dá)。本發(fā)明中編碼順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的DNA片段能很便利 地在細(xì)菌或真菌，包括酵母中表達(dá)。為了使上述基因能在細(xì)菌、真菌以及酵 母中表達(dá)，編碼順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的DNA序列可以通過(guò)控制與其相鄰的 DNA序列(如啟動(dòng)子、終止子、上游激活序列等)使得該基因在所選宿主中最 終得以(過(guò)量)表達(dá)。
編碼順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的DNA序列通過(guò)恰當(dāng)?shù)男揎?，可以使順式環(huán) 氧琥珀酸水解酶分泌(胞外表達(dá))在宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中。這種修飾通?？赏ㄟ^(guò)插 入編碼？ 1導(dǎo)序列的DNA序列來(lái)實(shí)現(xiàn)。該引導(dǎo)序列在所選宿主中通過(guò)分泌機(jī)制 使得順式環(huán)氧琥珀酸水解酶得以分泌表達(dá)并在，在宿主培養(yǎng)基中得以復(fù)性。
本發(fā)明提供了表達(dá)順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的宿主的培養(yǎng)條件(比如培養(yǎng) 基、溫度等)。
本發(fā)明提供一種利用本發(fā)明涉及的重組宿主細(xì)胞或本發(fā)明涉及的順式環(huán) 氧琥珀酸水解酶氨基酸序列來(lái)水解一種順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽。本發(fā)明所涉 及的順式環(huán)氧琥珀酸鹽為順式環(huán)氧琥珀酸與各種陽(yáng)離子形成的鹽，陽(yáng)離子包括且不僅限于銨離子、鉀離子、鈉離子、鎂離子和4丐離子等。
本發(fā)明涉及的酶可以下列形式應(yīng)用可直接利用透析或未透析培養(yǎng)的細(xì) 胞；該酶可作為純化的蛋白或細(xì)胞抽提物(即經(jīng)過(guò)一次或多次離心提取步驟后 得到的宿主細(xì)胞的部分物質(zhì))。本發(fā)明涉及的酶能以上述任何形式與其它酶以 上述任何形式聯(lián)合應(yīng)用。除此之外，順式環(huán)氧琥珀酸水解酶在宿主細(xì)胞表達(dá) 后分泌到其胞外的培養(yǎng)基中，并在培養(yǎng)基中復(fù)性。亦即，該酶制劑可與(或不 與)一種或多種其它酶聯(lián)合并以粗酶制劑或部分(或完全)純酶制劑的形式應(yīng) 用。
上述細(xì)胞、細(xì)胞抽提物、無(wú)細(xì)胞抽提物或純化的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶 能通過(guò)任何簡(jiǎn)便的方法固定在固體支持物上(比如層析柱等)或包埋在固定 載體中(如采用卡拉膠包埋等)，使其能持續(xù)水解具有環(huán)氧基的底物，并使得 上述酶制劑(細(xì)胞、細(xì)胞抽提物、無(wú)細(xì)胞抽提物或純化的順式環(huán)氧琥珀酸水 解酶)能重復(fù)利用。
本發(fā)明提供了 一種利用本發(fā)明所述的基因工程菌生產(chǎn)D(-)-酒石酸或其鹽 的方法。在順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽溶液中加入本發(fā)明所述的基因工程菌細(xì)胞， 在適當(dāng)?shù)臏囟认逻M(jìn)行酶促反應(yīng)，獲得D(-)-酒石酸或其鹽。其中，順式環(huán)氧琥 珀酸或其鹽的摩爾濃度為0.1~2 mol/L,優(yōu)選為0.5~1.5 mol/L,更優(yōu)選為0.8 1.2 mol/L;反應(yīng)溫度為10 50 。C,優(yōu)選為25~40 。C，更優(yōu)選為32~40 。C;順式 環(huán)氧琥珀酸或其鹽溶液的pH值為4.5~9.5，優(yōu)選為6.0~8.5，更優(yōu)選為6.0 7.0。
本發(fā)明提供了 一種利用細(xì)胞固定化技術(shù)制備本發(fā)明所述的基因工程菌固 定化細(xì)胞，并用于生產(chǎn)D(-)-酒石酸或其鹽的方法。其中，順式環(huán)氧琥珀酸或 其鹽的摩爾濃度為0.1-2 mol/L，優(yōu)選為0.5~1.5 mol/L，更優(yōu)選為0.8~1.2 mol/L;反應(yīng)溫度為10-50 。C，優(yōu)選為25~40 。C,更優(yōu)選為32-40 。C;順式 環(huán)氧琥珀酸或其鹽溶液的pH值為4.5~9.5,優(yōu)選為6.0-8.5，更優(yōu)選為6.0 7.0。
下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一 步說(shuō)明本發(fā)明。下面的實(shí)施例僅僅是為了說(shuō) 明的目的，而并非限制本發(fā)明的范圍。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的分離純化 1.順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活性的分離純化
博德特氏菌BK-52 (5wr/efe〃a sp. BK-52)保存于BK-1斜面培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基配方為0.5°/。葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.5%氯化鈉，0.25%酵母膏，2%瓊 脂，pH7.0。從斜面培養(yǎng)基上接種博德特氏菌BK-52至BK-2種子培養(yǎng)基中， 30。C振蕩培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)接于BK-3發(fā)酵培養(yǎng)基中，用順式環(huán)氧琥珀酸鹽30 。C振蕩誘導(dǎo)36 h,使其產(chǎn)順式環(huán)氧琥珀酸水解酶。該BK-2種子培養(yǎng)基配方 為0.2%酵母提取物，1%葡萄糖，0.2%硫酸銨，0.1。/。三7jc磷酸氬二鐘，0.05% 七水硫S吏鎂，0.001。/。七水硫酸亞鐵，pH7.0。該BK-3發(fā)酵培養(yǎng)基配方為1% 順式環(huán)氧琥珀S吏鈉，0.2%酵母提取物，1°/。葡萄糖，0.2%硫酸銨，0.1%三水磷 酸氫二鉀，0.05。/。七水硫酸鎂，0.001。/。七水硫酸亞鐵，pH7.0。離心收集細(xì)胞 并于-20 。C保存?zhèn)溆谩?br> 將上述冷凍的細(xì)胞用0.01 mol/L磷酸鉀緩沖液懸浮，于冰浴中超聲20 min, 8000 rpm離心30 min, q欠集上'J青液1。 )7Jc浴中力口石克酉臾4妄于上'J青液1中至 50%飽和度，10000 rpm離心20min，收集上清液2。然后在上清液2中加石克 酸銨至80%飽和度后，4 。C靜置過(guò)夜，10000 rpm離心20 min，收集沉淀。 沉淀用預(yù)冷的0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液溶解，4 。C于0.01 mol/L磷酸鉀緩沖 液中透析48 h,期間更換3-4次透析液。透析后的酶液用PEG20000濃縮， 濃縮液過(guò)Phenyl-Sepharose柱(2.6 cm i.d. x 50 cm),并用0.01 mol/L磷酸鉀緩 沖液(pH8.0)洗脫。先用500mL的洗脫液洗去非結(jié)合的蛋白，接著用1000 mL含0-0.35 mol/L氯化鈉的磷酸鉀緩沖液梯度洗脫結(jié)合的蛋白，流速為1 mL/min。收集具酶活性的流出液，PEG20000濃縮，將濃縮液過(guò)Q-Sepharose 柱(2.6 cm i.d. x 50 cm),用0.01 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH8.0 )洗脫，流速為1 mL/min。收集具酶活性的流出液，并用PEG20000濃縮，將濃縮液過(guò)MonoQ HR 5/5柱，并用0.01 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH8.0 )洗脫，流速為0.2 mL/min。 收集具酶活性的流出液，并用PEG20000濃縮。該過(guò)程重復(fù)三次，耳又部分重 復(fù)三次后的收集液，跑12%的十二烷基;5克酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，并用考 馬斯亮藍(lán)R250染色，觀察蛋白條帶的單一性及其分子量。
結(jié)果顯示，純化后的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶在十二烷基-危酸鈉聚丙烯酰 胺凝膠電泳膠中條帶單一，并且其分子量約為32kDa。
2.順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活性的4僉測(cè)
取約1.0 g濕細(xì)胞，生理鹽水洗兩次，用10 ml 1 mol/L的順式環(huán)氧琥珀 酸鈉(pH8.0)為底物懸浮，37。C反應(yīng)lh后，測(cè)定反應(yīng)液中酒石酸的含量。
ii酶活單位定義為在上述反應(yīng)條件下，1.0 g濕細(xì)胞1 h產(chǎn)生1 pmol酒石酸
所需的酶量。
反應(yīng)液中酒石酸含量的檢測(cè)方法如下取2.5 ml 1%的偏釩酸銨于一25 ml 的容量瓶中，加適量的上述反應(yīng)液后，再加1 ml lmol/L的硫酸，用蒸餾水定 容至25ml，混勻后測(cè)480nm處的吸光值，并根據(jù)制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算反應(yīng) 液中酒石酸的含量。
為了快速定量檢測(cè)可溶性酵液中順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的活力，其檢測(cè) 方法如下在3.9 ml 0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH8.0)中加入1.0 ml 1 mol/L的 順式環(huán)氧琥珀酸鈉底物，37。C保溫5min后，加入0.1 ml酶液并在37 。C反 應(yīng)20min,取適量上述反應(yīng)液，測(cè)定其中酒石酸的含量。
實(shí)施例2順式環(huán)氧琥珀酸水解酶N末端氨基酸序列的檢測(cè) 順式環(huán)氧琥珀酸水解酶N末端氨基酸序列通過(guò)常用的方法檢測(cè)，其方法 如下將上述分離純化后得到的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶跑十二烷基硫酸鈉聚 丙烯酰胺凝膠電泳后，通過(guò)Western雜交后轉(zhuǎn)移PVDF膜上。該膜用考馬斯 亮藍(lán)染色，切割順式環(huán)氧琥珀酸水解酶對(duì)應(yīng)的條帶并回收，然后用蛋白測(cè)序 儀(Applied Biosystems Procise 492 cLC)測(cè)其N末端序列。測(cè)序結(jié)果顯示，其 N末端氨基酸序列為MTRTKLILEARI (SEQ ID NO:l)。
實(shí)施例3順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的獲得
才艮據(jù)上述順式環(huán)氧琥珀酸水解酶N末端序列(SEQ ID NO:l)和GenBank 中登錄號(hào)為E50984的序列設(shè)計(jì)如下引物5，-ATGACNYGNACNAARXTN-3， (SEQ ID NO:2)和5，-CTAGTTGCTAATACCCAG-3， (SEQ ID NO:3)，其中Y代 表A或C， R代表A或G, X代表T或C， N代表A、 C、 G、 T四種堿基的 任何一個(gè)。
博德特氏菌BK-52 30 。C培養(yǎng)過(guò)夜，離心收集細(xì)胞，用EZ-10柱式基因 組DNA抽提試劑盒(Bio Basic Inc.)抽取博德特氏菌BK-52的基因組DNA。以 基因組DNA為模板，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3為引物，通過(guò)常用的PCR 技術(shù)獲得一段約0.9 kb的片段。其PCR程序?yàn)?4 °C預(yù)熱5 min后，94 °C 50 s, 40。C30s, 72。Clmin， 30個(gè)循環(huán)，最后72 °C延伸10min。 PCR產(chǎn) 物用Wizard PCR片段回收試劑盒(Promega)回收純化后，與pUCm-T (Sangon)
12載體連接，并按照Chung (Proc Natl Acad Sci USA 1989, 86: 2172-2175)等人 的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選陽(yáng)性克隆，并測(cè)序(TakaraBiotech),克隆質(zhì) 粒命名為pUCm-T。
實(shí)施例4順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的克隆
根據(jù)上述測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物，分別為 5 ，-GCCATATGATGACTCGAACCAAGTTGATACT-3 ， (SEQ ID NO:4)和 5，-CCGGATCCTTAGTTGCTAATACCCAGAATTT-3， (SEQ ID NO:5)，下劃線 部分分別為限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)7Vtfe I和5aw/ZI。以博德特氏菌BK-52基因組 DNA為模板，以SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5為引物，PCR擴(kuò)增順式環(huán)氧 琥珀酸水解酶基因的開(kāi);^文閱讀框。其PCR程序?yàn)?4 。C預(yù)熱5 min后，94 。C 50 s, 57。C30s, 72。Clmin， 30個(gè)循環(huán)，最后72 。C延伸10min。 PCR產(chǎn) 物用Wizard PCR片l史回收試劑盒(Promega)回收純化后，用AWe I和S^w// I 酶切，并與pET22b(+)的合適位點(diǎn)處連接，按照實(shí)施例3中的方法轉(zhuǎn)化到大腸 桿菌BL21中，篩選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定。
鑒定結(jié)果顯示，順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因以成功克隆到pET22b(+)載體 中，并將該表達(dá)載體命名為pET22b-ESH，該基因工程菌命名為五.co// BL21-pET22b-ESH。
實(shí)施例5順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的特征
DNAMEN軟件(Lynnon Biosoft)分析顯示，插入pET22b(+)載體的片段有 一個(gè)長(zhǎng)度為885 bp的開(kāi)放閱讀框，是順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的編碼DNA 序列(SEQIDNO:6)。順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因共編碼294個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè) 的分子量為32.4779 kDa，其氨基酸序列見(jiàn)SEQ ID NO:7。實(shí)施例子2中的序 列對(duì)應(yīng)SEQIDNO:7中1-12的氨基酸序列。
實(shí)施例6順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因在大腸桿菌中的表達(dá) 含pET22b-ESH質(zhì)粒的^桿菌BL21在含100嗎/ml氨千青霉素的LB培養(yǎng)基
中37。C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。以只含pET22b(+)載體而無(wú)任何外源核苷酸插入片段
的;U^桿菌BL21為對(duì)照。
:換照實(shí)施例1中順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活性的測(cè)定方法，對(duì)照菌沒(méi)有順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力，而上述含順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的工程菌酶
活力為25800 U/g。
實(shí)施例7利用本發(fā)明所述的五.co// BL21-pET22b-ESH工程菌制備D(-)-
酒石酸
BL21-pET22b-ESH工程菌在100 ml實(shí)施例6中的LB培養(yǎng)&(含100 ng/ml 氨卡青霉素)中37。C振蕩培養(yǎng)8h后，接入1LLB培養(yǎng)基中，37 。C下通氣培養(yǎng) 10 h。然后向培養(yǎng)液中加入10g順式環(huán)氧琥珀酸二鈉，經(jīng)12h振蕩培養(yǎng)和反 應(yīng)后，加入CaCl2水溶液，過(guò)濾并水洗沉淀，獲得13.5 g四水酒石酸鉤，再 經(jīng)硫酸酸解、陰陽(yáng)離子交換柱精制、濃縮、結(jié)晶和烘干得到D(-)-酒石酸6.3 g。 經(jīng)分析該D(-)-酒石酸的比旋光度為[a]2。。 =-12.1。，含量為99.7%。
實(shí)施例8利用K-卡拉月交包埋本發(fā)明所述的co// BL21-PET15b/ESH工 程菌細(xì)胞制備D(-)-酒石酸
將實(shí)施例7的培養(yǎng)液離心并收集工程菌細(xì)胞，用K-卡拉膠包埋得到固定 化細(xì)胞。耳又上述固定化細(xì)胞10 g》文入30 ml 1.0 M順式環(huán)氧琥珀S吏二鈉溶液中， 37。C反應(yīng)24h后，過(guò)濾回收固定化細(xì)胞。過(guò)濾液中加入CaCl2水溶液，經(jīng)充 分?jǐn)嚢韬筮^(guò)濾，洗滌沉淀，得4.6 g四水D(-)-酒石酸4丐。將該酒石酸鈣加硫 酸酸解、陰陽(yáng)離子交換柱精制、濃縮、結(jié)晶和烘干得到D(-)-酒石酸2.1g。
將回收的固定化細(xì)胞再放入30 ml 1.0 M順式環(huán)氧琥珀酸二鈉溶液中，37 °C反應(yīng)24 h后，過(guò)濾回收固定化細(xì)胞。過(guò)濾液中加入CaCl2水溶液，經(jīng)充分 攪拌后過(guò)濾，洗滌沉淀，得4.9 g四水D(-)-酒石酸鉤。將該酒石酸鈣加硫酸 酸解、陰陽(yáng)離子交換柱精制、濃縮、結(jié)晶和烘干得到D(-)-酒石酸2.4g。
該固定化細(xì)胞可以反復(fù)使用。
綜上可知，本發(fā)明構(gòu)建的基因工程菌具有將順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽水解 為D(-)-酒石酸或其鹽的特性。
實(shí)施例9順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的特征 1.溫度對(duì)順式環(huán)氧琥珀酸水解酶穩(wěn)定和活性的影響 將實(shí)施例1中分離純化后的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶，在不同溫度下，按 照實(shí)施例1中快速酶活測(cè)定法，檢測(cè)溫度對(duì)該酶活性的影響。結(jié)果顯示，順式環(huán)氧琥珀酸水解酶在30-50 °C,優(yōu)選為35-45 °C有較高的活力(最高酶活的 75%以上)。
將實(shí)施例1中分離純化后的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶，在不同溫度下保溫 30min后，按照實(shí)施例1中快速酶活測(cè)定法，檢測(cè)溫度對(duì)該酶穩(wěn)定性的影響。 結(jié)果顯示，順式環(huán)氧琥珀酸水解酶具有較強(qiáng)的溫度穩(wěn)定性，50。C保溫30min 后仍剩70%以上的活力。
2. pH對(duì)順式環(huán)氧琥珀酸水解酶穩(wěn)定和活性的影響
將實(shí)施例1中分離純化后的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶，在不同pH下，按 照實(shí)施例1中快速酶活測(cè)定法，；險(xiǎn)測(cè)pH對(duì)該酶活性的影響。結(jié)果顯示，順 式環(huán)氧琥珀酸水解酶在pH6-8.5，優(yōu)選為pH6-7之間有較高的活力(最高酶活 的70%以上)。
將實(shí)施例1中分離純化后的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶，在不同pH下室溫 靜置30min后，按照實(shí)施例1中快速酶活測(cè)定法，檢測(cè)pH對(duì)該酶穩(wěn)定性的 影響。結(jié)果顯示，順式環(huán)氧琥珀酸水解酶在pH4.6-9.0,優(yōu)選為pH5-8，更優(yōu) 選為pH 6-7之間放置30 min后仍剩90%以上的活力。
3. 順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的動(dòng)力學(xué)特征
取適量實(shí)施例1中純化的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶，通過(guò)不斷增加底物(順 式環(huán)氧琥珀酸鈉)濃度(12 mmol/LJOO mmol/L)，在0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.5) 37°C反應(yīng)20 min，通過(guò)Lineweaver-Burk圖計(jì)算順式環(huán)氧琥珀酸水解酶
的Km值和Vmax值。結(jié)果顯示，順式環(huán)氧琥珀酸水解酶具有米氏酶的典型特
征，并且Km值和Vmax值分別為18.67 mmol/L和94.34 mM/min/mg。
盡管已參照本發(fā)明的確定優(yōu)選實(shí)例表示和描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域內(nèi)的 普通技術(shù)人員將理解的是，可在不背離由所附權(quán)利要求書(shū)限定的本發(fā)明宗旨 和范圍的前提下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種形式和細(xì)節(jié)上的修改。
15序列表
< 110〉杭州寶晶生物化工有限公司
<120>使用基閃i:程菌生產(chǎn)D(-)-酒石酸或其鹽
<130> C08P0276 <160〉 7
<170〉 Patentln version 3. 1
<210〉 1
〈211〉 12
<212>順式環(huán)氧琥珀酸水解酶N末端
<213〉 博德特氏菌菌種CMGCC No. 2075
〈400〉 1
MTRTKL1LEA RI 12
<210> 2
<211〉 18
<212〉 DNA
〈213〉 引物
<400〉 2
atgacnygna cnaarxtn 18
其中，y代表a或c， r代表a或g, x代表t或c， n代表a、 c、 g、 t四種堿基的任何一個(gè)。
<40()> 3
ctagttgcta atacccag 18
<210〉 4
<211〉 31
<212〉 DNA
<213〉 引物
<400〉 4
gccatatgat gactcgaacc aagttgatac t 31
〈210〉 5
<211〉 31
<212> DNA
<213〉 引物
<400〉 5
ccggatcctt agttgctaat acccagaatt t 31
〈210〉 6 〈211〉 885
<210〉 <211〉 <212> 〈213〉
1<212〉 DN八 <213〉 引物
<400〉 6 atgactcgaa
aatccccatg
gcgggtgcat
tatgaaactt
ccgacactgg
ctgtgccttg
3tCg3tCgtt
tttatcgctt gtcg'acgacc ccggg已a(bǔ)cga caatggaxcg g卿g兆gac accaatgggg gca^cgcc兆
tgccstggac cgattgtcca atgcagaatc gccagatcac acccagcact stgaxgatgt cgctgcagca ggacggtccc cggcatatct t已cgggggct
acgtcgcaat aagtcgttca C3g兆ac3aa
scttgaagt cgtat3aatg aatacatgcc gcgtcgcggt
tttccatgcc gatccgt眺 gcttgg兆gg 犯aaccggsc gg卿兆cgc cttcagcaag cttcacccga gctgtttgag g'cgtgcacat gatcggcaac tggcctaggc gaccgtagcg gg肌attctg
StCggtg3gg
cgtca^gctg attcgcgcac
tttgcaccgg
acacttgacg ctcaccgact accgacttcc ctatttggcc gattacctct aMatggcax
ctgcggcaca acggttctcc gcagtgacgt
t卿cctggg gcgaccgcgt 咖tcggggt cctttatgga gcggcatccg tgccacccgg ctgctgctgc atccggaatt gtgcgatggg
<210> 7
<211〉 294
<212〉順式環(huán)氧琥珀酸水解酶
<213〉 博德特氏菌菌種CMGCC No. 2075
<400〉 7
MTRTKLILEA RINEYMPRRG NPHVPWTPKE IGEAAAQARE YETYAESIRE IRARSDVLVH PTLGQITLGG RESRLAHIER IDRYDDVEKR YETGDRVYLN NIDTLQHFSK RLRELGVKPA VDDPAYLLFE LTDCGIRGGH PGTIRGLRAH TDFLPPGRQI EGGHVAIGLG DYLYPELGTP TNGEWQTVA NMARAMGREI
ggcacggg肪 cagccatgac tctagtacat
C3ttg3gCg3
tagc3cg肌c gtacttgaac taagcctgcg tatgggtttg cggtggacat acgacagatc ggccattgag gggtacaccc tcgtgagatt
AGASIVHFHA LCLDPALKPD FIAWTVPFTR QWTVCNKIGN ATPAETKEIL
RQADGSPSHD FAPVDLGSTN TLDAFMDMGL LFGPAAAAIE GISN
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 885
60 120 180 240 294
1權(quán)利要求
1. 一種順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多肽，其由來(lái)源于博德特氏菌(Bordetellasp.)的多核苷酸編碼，其分子量約為32kDa。
2. 權(quán)利要求1的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多肽，其在pH 6.5、 40 。C的條 件下具有最高的酶活力，在pH 6.5-8.5、 30-50 。C條件下酶活力達(dá)到最高酶活 力的70%以上。
3. 權(quán)利要求1的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多肽，其通過(guò)一種重組微生物菌 抹的胞內(nèi)表達(dá)而獲得。
4. 權(quán)利要求1的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多肽，其中所述的重組微生物菌 才朱為一種細(xì)菌或真菌。
5. 權(quán)利要求1的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多肽，其特征在于，所述多肽的 氨基酸序列與SEQIDNO:7所示氨基酸序列具有50%以上的同源性。
6. 權(quán)利要求5的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多肽，其特征在于，所述多肽的 氨基酸序列與SEQ ID NO:7所示氨基酸序列具有70%以上的同源性。
7. 權(quán)利要求6的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多肽，其特征在于，所述多肽的 氨基酸序列與SEQIDNO:7所示氨基酸序列具有90%以上的同源性。
8. 權(quán)利要求1的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多肽，其特征在于所述多肽包含 全部或部分SEQ ID NO:7所示氨基酸序列，并且具有順式環(huán)氧琥珀酸水解酶 活性。
9. 編碼權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多肽的多核芬酸。
10. 權(quán)利要求9的多核香酸，其包含SEQIDNO:6所示的核苷酸序列。
11. 權(quán)利要求10的多核苷酸，其由SEQIDNO:6所示的核苷酸序列組成。
12. —種載體，其包含權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)的核苷酸序列，和任選的 一個(gè)或多個(gè)來(lái)源于同源或異源微生物的調(diào)控序列。
13. —種重組微生物菌林，其表達(dá)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的順式環(huán)氧琥珀 酸水解酶多肽。
14. 權(quán)利要求13的重組微生物菌林，其表達(dá)的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多 肽是由權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)的多核苷酸編碼的。
15. 權(quán)利要求13-14中任一項(xiàng)的重組微生物菌株，其用權(quán)利要求12的載體轉(zhuǎn)化。
16. —種生產(chǎn)D(-)-酒石酸或其鹽的方法，其包括使用權(quán)利要求1-8任一 項(xiàng)所述的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多肽或由權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)的多核香酸編碼的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶多肽與順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽反應(yīng)。
17. —種生產(chǎn)D(-)-酒石酸或其鹽的方法，其包括如下步驟(a) 在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求13-15任一項(xiàng)的重組微生物菌林；(b) 將步驟(a)中得到的重組微生物菌林的細(xì)胞、細(xì)胞抽提物或無(wú)細(xì)胞抽 提物或由所述微生物菌抹純化的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶固定在固體支持物上 或包埋在固定載體中；(c) 將步驟(b)中得到的制備物與順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽在適于水解的條 件下反應(yīng)以生產(chǎn)D(-)-酒石酸或其鹽；和(d) 任選地重復(fù)利用上述固定或包埋的酶和/或細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種來(lái)源于微生物的、用于編碼一種順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的核苷酸序列，一種包含所述核苷酸序列的克隆載體，一種由所述核苷酸序列轉(zhuǎn)化而得的重組宿主菌，由所述核苷酸序列編碼并由所述重組宿主菌表達(dá)的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶氨基酸序列。進(jìn)一步的，本發(fā)明還涉及一種利用所述順式環(huán)氧琥珀酸水解酶水解順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽制備D(-)-酒石酸或其鹽的方法。
文檔編號(hào)C12N9/14GK101481681SQ20081007416
公開(kāi)日2009年7月15日 申請(qǐng)日期2008年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月27日
發(fā)明者張建國(guó), 潘海峰, 謝志鵬, 鮑文娜 申請(qǐng)人:杭州寶晶生物化工有限公司