專利名稱：：一種酒紅土褐鏈霉菌、篩選方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于微生物菌種的篩選方法及應(yīng)用，特別是指一種鏈霉菌屬酒紅土褐鏈霉菌、篩選方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：設(shè)施栽培是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)最重要的生產(chǎn)方式之一，在豐富人們菜籃子的同吋，還提高了農(nóng)民收入。目前，設(shè)施蔬菜生產(chǎn)已經(jīng)成為我國種植業(yè)的第二大支柱產(chǎn)業(yè)，設(shè)施蔬菜產(chǎn)值占蔬菜總產(chǎn)值的50%以上。由于設(shè)施栽培具有設(shè)施固定，倒茬困難，設(shè)施土壤缺乏雨水溶淋等特點，再加上栽培技術(shù)的滯后，隨著種植年限的延長，會普遍發(fā)生病蟲害加劇、產(chǎn)量和品質(zhì)下降等連作障礙現(xiàn)象。一般連茬種植5年后，減產(chǎn)損失在20%以上，嚴(yán)重地塊達到經(jīng)濟閾值以下，甚至?xí)^收。連作障礙已經(jīng)成為制約設(shè)施栽培可持續(xù)發(fā)展的瓶頸。研究表明，土壤次生鹽漬化、土壤病原物和自毒物質(zhì)積累是發(fā)生連作障礙的主要成因，由于連作障礙的構(gòu)成多樣，防治非常困難，是一國際性難題。以有益微生物為核心的生物防治是國內(nèi)外研究的熱點，設(shè)施栽培是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)最重要的生產(chǎn)方式之一，在豐富人們菜籃子的同吋，還提高了農(nóng)民收入。目前，設(shè)施蔬菜生產(chǎn)已經(jīng)成為我國種植業(yè)的第二大支柱產(chǎn)業(yè)，設(shè)施蔬菜產(chǎn)值占蔬菜總產(chǎn)值的50%以上。由于設(shè)施栽培具有設(shè)施固定，倒茬困難，設(shè)施土壤缺乏雨水溶淋等特點，再加上栽培技術(shù)的滯后，隨著種植年限的延長，會普遍發(fā)生病蟲害加劇、產(chǎn)量和品質(zhì)下降等連作障礙現(xiàn)象。一般連茬種植5年后，7減產(chǎn)損失在20%以上，嚴(yán)重地塊達到經(jīng)濟閾值以下，甚至?xí)^收，連作障礙已經(jīng)成為制約設(shè)施栽培可持續(xù)發(fā)展的瓶頸。研究表明，土壤次生鹽漬化、土壤病原物和自毒物質(zhì)積累是發(fā)生連作障礙的主要成因，由于連作障礙的構(gòu)成多樣，防治非常困難，是一國際性難題。以有益微生物為核心的生物防治是國內(nèi)外研究的熱點，鏈霉菌是目前研究和應(yīng)用最廣泛的生防因子之一，開發(fā)應(yīng)用的產(chǎn)品涉及殺菌、殺蟲、除草、生長調(diào)節(jié)、抗病毒等多種制劑。但目前應(yīng)用的菌株及其產(chǎn)品功能單一，且防效低，效果不穩(wěn)定，缺乏針對連作障礙成因的優(yōu)勢菌株和高效應(yīng)用技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對上述問題，以北方設(shè)施蔬菜生產(chǎn)現(xiàn)狀為背景，在進一步探明連作障礙的現(xiàn)狀、構(gòu)成和成因的基礎(chǔ)上，提出了通過對根際微生態(tài)和根系的綜合調(diào)控，實現(xiàn)高效穩(wěn)定防治的研究思路，采用獨創(chuàng)的分離篩選技術(shù)，提供一種具有防病、促生和解毒等多種功能的根際益生菌菌株一酒紅土褐鏈霉菌，并給出其應(yīng)用方向。本發(fā)明提供的菌種是鏈霉菌屬酒紅土褐鏈霉菌(5Xr6^:o/7y/C6\s1//，C6^^^ms)，暫定名為S506，已于2008年9月11日提交中國普通微生物保藏中心保藏，保藏編號為CGMCCNo.2664。該菌種是從河北省欒城縣番茄根際土壤分離獲得的。所述的酒紅土褐鏈霉菌DNA序列測定結(jié)果為TCAGCTAGTTGGTGAGGTAACG選用河北省欒城縣境內(nèi)栽培的番茄植株，去掉植株根部土壤，隨機剪取新生主根和毛細根，置于含玻璃珠的無菌水中，充分搖動，將根取出，得土壤懸浮液；取出的根系先用無菌水沖洗，然后作表面消毒處理，用無菌水沖)爭殘余乙醇，于無菌研缽中研成糊狀，制作根系懸液；將上述懸液搖勻后，進行稀釋，取0.05-0.15ml涂布于高氏一號培養(yǎng)基上，24-26。C培養(yǎng)71-73小時，分離長勢良好的鏈霉菌菌株，純化后，進行平板純培養(yǎng)；制取鏈霉菌菌塊，分別以立枯絲核菌(/力7》<%7^7&sp.)、鐮刀菌(^/wr/^7sp.)或腐霉菌(?！读/77S。.)病原菌為靶標(biāo)，在PDA平板上進行對峙培養(yǎng)，病原菌與目的菌相距3cm,每處理3次重復(fù)，同吋于PDA平板上單獨接種病原菌作對照；一周后檢查對峙培養(yǎng)結(jié)果，根據(jù)病原菌在對峙方向的菌落半徑、對照菌落半徑廿算抑菌率；抑菌率％=(對照菌落半徑對峙菌落半徑)/對照菌落半徑xlOOX,選擇抑菌率高且對多種病原同時具有防效的菌株參與下步篩選試驗；(2)防病促生菌株的篩選采用育苗缽異步生測法，分別對步驟(1)獲得的菌株進行防病和促生功能比較試驗，栽培基質(zhì)按大田壤土農(nóng)家肥蛭石=6-8:1-3:0.5-1.5比例配制，參試目的菌株和病原菌都制成固體培養(yǎng)物，按1%比例與上述培養(yǎng)基質(zhì)混合；病原菌和生防菌混合接種的栽培基質(zhì)用于抗病性檢測，目的菌單獨接種的用于促生效果檢測，目的菌和病原菌均按栽培基質(zhì)1%的質(zhì)量比接種，基質(zhì)混合均勻后，填裝于育苗缽中；挑選兩葉一心長勢均勻一致的番茄幼苗移栽于上述培養(yǎng)缽中，每處理50棵，各分2組，隨機排列，置于日光溫室中培養(yǎng)；侵染率調(diào)查30天后將根挖出，調(diào)查病情指數(shù)；促生結(jié)果調(diào)查待番茄長到45片真葉時，將番茄苗整株挖出，檢測整株鮮重、地上部干重、葉面積、主根長、根干重指標(biāo)；綜合比較抗病和促生效果，確定優(yōu)勢菌株；(3)防根結(jié)線蟲菌株的篩選二S令幼蟲的培養(yǎng)在黃瓜生長后期，挖取根結(jié)線蟲發(fā)病重、根結(jié)多的黃瓜根，用清水洗去根部泥土，剪成長lcm的根段，放入500mL三角瓶中，倒入200mL0.5%NaC10溶液，用力搖3分鐘，混合溶液過100目篩，用無菌水沖洗篩上碎片5次，溶液再過500目篩，用無菌水沖洗篩上物，液體收集到容器中，獲得卵懸浮液，將收集到的卵塊或卵粒置于中性濾紙上，置于200目網(wǎng)篩上，網(wǎng)篩置于盛有清水的盆中，水位高度為不低于浸濕濾紙，然后置于28T恒溫箱中孵化，每24小時將盆中水過500網(wǎng)篩，將孵化的二齡幼蟲收集于三角瓶中，置4。C冰箱中備用；防根結(jié)線蟲功能菌株篩選吸取3mL線蟲液于培養(yǎng)皿中，然后加入步驟(2)獲得的目的菌株的培養(yǎng)液各lmL,對照加無菌水，每處理三次重復(fù)，混合液放入28。C恒溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)13小時后，每皿中加2滴0.05%亞甲基藍水溶液，510分鐘鏡檢線蟲死亡率，比較不同菌株培養(yǎng)液對二齡幼蟲的致死效果；防根結(jié)線蟲功能菌株盆栽復(fù)篩分別取連茬4年、8年和11年線蟲危害較重的黃瓜大棚土壤，裝入高14cm,直徑16cin的花盆中。設(shè)置功能菌、阿維菌素和空白對照三組處理，每處理20盆，添加物用量為功能菌麩皮培養(yǎng)物5g/盆，0.2%阿維菌素乳油稀釋1000倍，于定植后澆灌200mL/盆，用黃瓜做試驗植物，將兩片真葉的津綠3號黃瓜幼苗按每盆一棵移入，定植后，除阿維菌素處理外，每盆澆清水200mL,之后用稱重法澆水，三個月后調(diào)查病情指數(shù)，分級并記錄結(jié)果，分析嚴(yán)重度；采用的分級標(biāo)準(zhǔn)為0級，無根結(jié)；1級，有少數(shù)根結(jié)，占全根系的1%25%;2級，根系根結(jié)數(shù)量中等，占全根系的26%50%;3級，根系根結(jié)數(shù)量很多，占全根系的51%75%;4級，根系根結(jié)數(shù)量很多，占全根系的76%100%,病情指數(shù)(%)=2(級數(shù)x同級株數(shù))/(總株數(shù)x4)X100,嚴(yán)重度是指有根瘤根的長度之和占總根系長度的百分比；比較上述結(jié)果，確定更優(yōu)菌株；(4)降解根系自毒物質(zhì)菌株篩選取大田壤土，風(fēng)干后粉碎，過篩，215。C干熱滅菌8小吋。以苯甲酸或/和香豆素為酚酸類自毒物質(zhì)試驗材料，按酚酸自毒物質(zhì)的最終濃度50、100、150、200、250ug/kg移取已配置好的濃度為1000mg/L的苯甲酸或香豆素的母液于滅菌土中，加入步驟(3)所確定菌株的麩皮培養(yǎng)物，混合均勻，分裝入花盆中，每盆裝土1.5kg。將育好的有兩片復(fù)葉的番茄苗按3棵/盆移栽到上述花盆中，定植后，澆水至飽和，之后按稱重法澆水；設(shè)空白對照，每處理五次重復(fù)；觀察幼苗緩苗、長勢情況，30天后檢測成活率、株高、復(fù)葉長度、根系干重生理指標(biāo)；檢測葉片丙二醛和PAL酶活性；比較上述結(jié)果，確定本步驟選出的優(yōu)努菌株；(5)田間小區(qū)試驗，最終確定優(yōu)勢菌株將經(jīng)過上述四步確定的優(yōu)勢菌株分別制成固體培養(yǎng)物，選擇連荏五年以上，根部病害以及根結(jié)線蟲發(fā)生較為嚴(yán)重的溫室大棚進行應(yīng)用比較試驗；采用定苗期穴施方法，將菌劑與細田土混合，定量施入定苗穴中，之后的定苗、澆水等管理采用同常規(guī)措施，每處理30m2，三次隨機重復(fù)；在生長中期和后期檢測植株長勢、防病、防線蟲效果，以及對產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，綜合比較以上指標(biāo)，確定最優(yōu)菌株。所述的酒紅土褐鏈霉菌的篩選方法，所述的步驟(1)中采用75%乙醇對無菌水沖洗后的植株根系做表面消毒處理。所述的酒紅土褐鏈霉菌的篩選方法，所述的步驟(4)降解根系自毒物質(zhì)菌株篩選中選擇苯甲酸、香豆素混合處理，兩種藥劑按l:l混合，每種藥劑的用量比單一處理減倍。上述酒紅土褐鏈霉菌的應(yīng)用，其特征在于其活菌培養(yǎng)物用于制備防治栽培連作障礙、防病促生和解毒功能的土壤生物修復(fù)剤或調(diào)理剤的有效成分。本發(fā)明所取得的實質(zhì)性特點和顯著的技術(shù)進步在于以北方設(shè)施蔬菜生產(chǎn)現(xiàn)狀為背景，在進一步探明連作障礙的現(xiàn)狀、構(gòu)成和成因的基礎(chǔ)上，提出了通過對根際微生態(tài)和根系的綜合調(diào)控，實現(xiàn)高效穩(wěn)定防治的研究思路，采用獨創(chuàng)的分離篩選技術(shù)，獲得了具有防病、促生和解毒等多種功能的根際益生菌菌株酒紅土褐鏈霉菌S506,酒紅土褐鏈霉菌S506是從蔬菜根際分離獲得一株多功能根際優(yōu)勢菌株，將該菌的活菌體施入蔬菜根際，可有效防治枯萎病、根腐病、根結(jié)線蟲病等多種蔬菜根部病害，并具有顯著的促迸根系發(fā)育和降解根系自毒物質(zhì)功能，在有效防治蔬菜、果樹、藥材等普遍發(fā)生的連作障礙難題具有廣闊應(yīng)用前景。圖1是本發(fā)明中菌種的菌落形態(tài)圖片。圖2是本發(fā)明中的菌絲形態(tài)圖片。圖3是本發(fā)明中的分生孢子圖片。具體實施例方式本發(fā)明提供的菌種是鏈霉菌屬酒紅土褐鏈霉菌("r0^^7j/C6^t/7>M:a/5^r^^/)，暫定名為S506，已于2008年9月11日提交中國普通微生物保藏中心保藏，保藏編號為CGMCCNo.2664。該菌種是從河北省欒城縣番茄根際土壤分離獲得的。(1)拮抗菌株的分離篩選選用河北省欒城縣境內(nèi)栽培的番茄植株，去掉植株根部土壤，隨機剪取新生主根和毛細根，置于含玻璃珠的無菌水中，充分搖動，將根取出，獲得土壤懸浮液；取出的根系先用無菌水沖洗，然后作表面消毒處理，優(yōu)選采用75%乙醇。用無菌水沖)爭殘余乙醇，于無菌研缽中研成糊狀，制作根系懸液；將上述懸液搖勻后，進行稀釋，取0.05-0.15ml涂布于高氏一號培養(yǎng)基上，24-26。C培養(yǎng)71-73小時，分離長勢良好的鏈霉菌菌株；純化后，進行平板純培養(yǎng)；制取鏈霉菌菌塊，分別以立枯絲核菌(/力7》(X^/7/5SP.)、鐮刀菌(^/^r/^7/sp.)或腐霉菌(/^MW/T/sp.)病原菌為靶標(biāo)，在PDA平板上迸行對峙培養(yǎng)，病原菌與目的菌相距3cm,每處理3次重復(fù)，同吋于PDA平板上單獨接種病原菌作對照；一周后檢查對峙培養(yǎng)結(jié)果，根據(jù)病原菌在對峙方向的菌落半徑、對照菌落半徑廿算抑菌率；抑菌率％=(對照菌落半徑對峙菌落半徑)/對照菌落半徑xl00X,選擇抑菌率高且對多種病原同吋具有防效的菌株參與下步篩選試驗；(2)防病促生菌株的篩選采用育苗缽異步生測法，分別對步驟(1)獲得的菌株進行防病和促生功能比較試驗，栽培基質(zhì)按大田壤土農(nóng)家肥:蛭石=6-8:1-3:0.5-1.5比例配制，參試目的菌株和病原菌都制成固體培養(yǎng)物，按1%比例與上述培養(yǎng)基質(zhì)混合；病原菌和生防菌混合接種的栽培基質(zhì)用于抗病性檢測，目的菌單獨接種的用于促生效果檢測，目的菌和病原菌均按栽培基質(zhì)1%的質(zhì)量比接種，基質(zhì)混合均勻后，填裝于育苗缽中；挑選兩葉一心長勢均勻一致的番茄幼苗移栽于上述培養(yǎng)缽中，每處理50棵，各分2組，隨機排列，置于日光溫室中培養(yǎng)；侵染率調(diào)査30天后將根挖出，調(diào)查病情指數(shù)；促生結(jié)果調(diào)查待番茄長到45片真葉時，將番茄苗整株挖出，檢測整株鮮重、地上部干重、葉面積、主根長、根干重指標(biāo)。綜合比較抗病和促生效果，確定優(yōu)勢菌株；(3)防根結(jié)線蟲菌株的篩選二齡幼蟲的培養(yǎng)在黃瓜生長后期，挖取根結(jié)線蟲發(fā)病重、根結(jié)多的黃瓜根，用清水洗去根部泥土，剪成長lcm的根段，放入500mL三角瓶中，倒入200mL0.5%NaC10溶液，甩力搖3分鐘，混合溶液過100目篩，用無菌水沖洗篩上碎片5次，溶液再過500目篩，用無菌水沖洗篩上物，液體收集到容器中，獲得卵懸浮液。將收集到的卵塊或卵粒置于中性濾紙上，置于200目網(wǎng)篩上，網(wǎng)篩置于盛有清水的盆中，水位高度為浸濕濾紙，然后置于28。C恒溫箱中孵化，每24小吋將盆中水過500網(wǎng)篩，將孵化的二齡幼蟲收集于三角瓶中；置4。c冰箱中備用；防根結(jié)線蟲功能菌株篩選吸取3nl線蟲液于培養(yǎng)皿中，然后加入步驟(2)獲得的目的菌株的培養(yǎng)液各lmL，對照加無菌水，每處理三次重復(fù)，混合液放入28。C恒溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)13小時后，每皿中加2滴0.050《亞甲基藍水溶液，510分鐘鏡檢線蟲死亡率，比較不同菌株培養(yǎng)液對二齡幼蟲的致死效果；防根結(jié)線蟲功能菌株盆栽復(fù)篩分別取連茬4年、8年和11年線蟲危害較重的黃瓜大棚土壤，裝入高14cm，直徑16cm的花盆中。設(shè)置功能菌、阿維菌素和空白對照三組處理，每處理20盆，添加物用量為功能菌麩皮培養(yǎng)物5g/盆，0.2%阿維菌素乳油稀釋1000倍，于定植后澆灌200mL/盆，用黃瓜做試驗植物，將兩片真葉的津綠3號黃瓜幼苗按每盆一棵移入，定植后，除阿維菌素處理外，每盆澆清水200mL,之后用稱重法澆水，三個月后調(diào)查病情指數(shù)，分級并記錄結(jié)果，分析嚴(yán)重度；采用的分級標(biāo)準(zhǔn)為0級，無根結(jié)；1級，有少數(shù)根結(jié)，占全根系的1%25%;2級，根系根結(jié)數(shù)量中等，占全根系的26%50%;3級，根系根結(jié)數(shù)量很多，占全根系的51%75%;4級，根系根結(jié)數(shù)量很多，占全根系的76Q/。1(F/。，病情指數(shù)(%)=2(級數(shù)x同級株數(shù))/(總株數(shù)X4)xlOO,嚴(yán)重度是指有根瘤根的長度之和占總根系長度的百分比；比較上述結(jié)果，確定更優(yōu)菌株；(4)降解根系自毒物質(zhì)菌株篩選取大田壤土，風(fēng)干后粉碎，過篩，215。C干熱滅菌8小時。以苯甲酸、香豆素為酚酸類自毒物質(zhì)試驗材料，按酚酸自毒物質(zhì)的最終濃度50、100、150、200、250ug/kg移取已配置好的濃度為1000mg/L的苯甲酸或香豆素的母液于滅菌土中，加入步驟(3)所確定菌株的麩皮培養(yǎng)物，混合均勻，分裝入花盆中，每盆裝土1.5kg。苯甲酸、香豆素的混合處理中，兩種藥剤按l:l混合，每種藥剤的用量比單一處理減倍。將育好的有兩片復(fù)葉的番茄苗按3棵/盆移栽到上述花盆中，定植后，澆水至飽和，之后按稱重法澆水；設(shè)空白對照，每處理五次重復(fù)；觀察幼苗緩苗、長勢情況，30天后檢測成活率、株高、復(fù)葉長度、根系干重生理指標(biāo)；檢測葉片丙二醛和PAL酶活性；比較上述結(jié)果，確定本步驟選出的優(yōu)勢菌株；(5)田間小區(qū)試驗，最終確定優(yōu)勢菌株將經(jīng)過上述四步確定的優(yōu)勢菌株分別制成固體培養(yǎng)物，選擇連茬五年以上，根部病害以及根結(jié)線蟲發(fā)生較為嚴(yán)重的溫室大棚進行應(yīng)用比較試驗；采用定苗期穴施方法，將菌剤與細田土混合，定量施入定苗穴中，之后的定苗、澆水等管理采用同常規(guī)措施，每處理30M2,三次隨機重復(fù)；在生長中期和后期檢測植株長勢、防病、防線蟲效果，以及對產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，綜合比較以上指標(biāo)，確定具有如下形態(tài)特征和培養(yǎng)特征的最優(yōu)菌株。1、形態(tài)特征酒紅土褐鏈霉菌S506在大多數(shù)培養(yǎng)基上生長良好，革蘭氏染色陽性；在高氏合成1號瓊脂和G丫M瓊脂等培養(yǎng)基上生長14天后，菌落呈圓形，基內(nèi)菌絲發(fā)育良好，無橫隔，不斷裂；氣生菌絲豐茂，多分枝；孢子絲螺旋形，孢子卵圓形，表面光滑。2、培養(yǎng)特征在不同培養(yǎng)基上進行了菌體培養(yǎng)試驗，觀察了氣生菌絲、基內(nèi)菌絲顏色和產(chǎn)色無情況，結(jié)果見表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>3、細胞型化學(xué)組分分析菌株S506的全細胞水解液含有L丄-DAP(L丄-二氨基庚二酸D涵no。加e，1cacid),無特征性糖；細胞壁屬于I型，糖型C。4生理生化特征菌株S605的生理生化特征試驗結(jié)果見表2。表2菌株S506的生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表2中+代表陽性；一代表陰性W代表弱陽性。菌株S506的16SrDNA序列與GenBank中相關(guān)序列Blast比對的結(jié)果表明，該菌株屬于鏈霉菌屬，與酒紅土褐鏈霉菌6^r6^^7/77J/C6^1/77^CH/5^r^P75"同源性很高，為99.8%。根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特征和16SrDNA序列分析，將該菌種S506定為酒紅土褐鏈霉菌(5L^p^77j/ca[/777^:a/^/r^^/5")。本發(fā)明所述的酒紅土褐鏈霉菌(v5^廠6^^/7ZKC6^^7力^H/^/A^^/S)S506的應(yīng)用，主要是利用其活菌培養(yǎng)物作為有效成分，生產(chǎn)具有防病促生和解毒功能的土壤生物修復(fù)剤或調(diào)理剤，用于連作障礙的防治?；罹囵B(yǎng)物的制備即可液體深層發(fā)酵也可固體發(fā)酵，對培養(yǎng)基物料無特殊要求，'滿足菌株生長的碳源、氮源、磷源和無機鹽即可，麩皮、米糠、淀粉、各類渣油餅粕以及磷酸鹽、食鹽等均可用作培養(yǎng)物料，對PH值無特殊要求，培養(yǎng)過程適當(dāng)通氣或攪拌。實施例1酒紅土褐鏈霉菌S506液體發(fā)酵菌剤A、菌種活化將酒紅土褐鏈霉菌接種至高氏合成培養(yǎng)基平板上，28-35°C培養(yǎng)，反復(fù)轉(zhuǎn)接2-3次，培養(yǎng)1周，使菌種活化；取出觀察菌體的生長狀態(tài)，以電子顯微鏡掃描，菌絲和分生孢子照片如圖1所示。由圖1可見，本發(fā)明的酒紅土褐鏈霉菌S506的菌落呈圓形，基內(nèi)菌絲無橫隔，不斷裂；氣生菌絲豐茂，多分枝；孢子絲螺旋形，孢子卵圓形，表面光滑。B、酒紅土褐鏈霉菌的液體種子制備種子培養(yǎng)物料由質(zhì)量比為8o《的鼓皮或米糠粉、戰(zhàn)玉米粉、2%豆餅粉、2。^甘油、0.1%硝酸鈉、O.戰(zhàn)氯化鈉、0.3貌炭酸鈣、0磷酸氫二鉀、0.05%硫酸鎂、0.05%硫酸亞鐵和其余的水組成，自然PH,分裝于三角瓶121-130。C高壓滅菌30-60分鐘，冷卻至25-35°C，接種步驟A得到的酒紅土褐鏈霉菌菌種，在25-30。C下，搖瓶培養(yǎng)48-72小時；C、酒紅土褐鏈霉菌的液體深層發(fā)酵以步驟B的培養(yǎng)物為種子，以3-10^的比例接種于液體發(fā)酵罐的液體培養(yǎng)物料中，液體培養(yǎng)物料和培養(yǎng)條件與步驟B相同，通氣攪拌培養(yǎng)72小吋，加入兩倍體積的草炭粉吸附制得鏈霉菌菌剤。實施例2酒紅土褐鏈霉菌S506液體發(fā)酵菌剤A、步驟A同實施例1;B、C、酒紅土褐鏈霉菌S506的種子培養(yǎng)物料由質(zhì)量比為2^的麩皮粉、2%玉米粉、1%豆餅粉、0.5%甘油、O.l貌肖酸鈉、O.戰(zhàn)氯化鈉、CU碳酸鈣、0.3%磷酸氳二鉀、0.050^兗酸鎂、0.05°^兗酸亞鐵和其余的水組成，發(fā)酵及制剤條件同實施例1。實施例3酒紅土褐鏈霉菌S506的液體發(fā)酵菌劑A、步驟A同實施例1;B、C、酒紅土褐鏈霉菌的液體種子培養(yǎng)物料由質(zhì)量比為4%的麩皮粉、4%玉米粉、2%豆餅粉、0.5%甘油、O.l貌肖酸鉀、0,4%氯化鈉、0.3%碳酸鈣、0.3%磷酸氳二鉀、0.05o儀fb酸鎂、0.05%硫酸亞鐵和其余的水組成。種子培養(yǎng)物料由質(zhì)量比為4%的麩皮粉、4%玉米粉、2%豆餅粉、0.5%甘油、0.1%硝酸鉀、0.4%氯化鈉、0.3%碳酸鈣、0.3%磷酸氳二鉀、0.05%硫酸鎂、0.05%硫酸亞鐵和其余的水組成，發(fā)酵及制剤條件同實施例1。實施例4酒紅土褐鏈霉菌S506的固體發(fā)酵菌剤A、步驟A同實施例1;B、酒紅土褐鏈霉菌的液體種子制備種子培養(yǎng)物料由質(zhì)量比為戰(zhàn)的麩皮或米糠粉、2%玉米粉、0.5%豆餅粉、0.5%甘油、O.l站肖酸鈉、O.戦氯化鈉、0.3貌炭酸鈣、0.3%磷酸氯二鉀、0.05%硫酸鎂、0.05%硫酸亞鐵和其余的水組成,自然PH，分裝于三角瓶121-130。C高壓滅菌30-60分鐘，冷卻至25-35°C,接種步驟A得到的酒紅土褐鏈霉菌菌種，在25-30。C下，搖瓶培養(yǎng)犯-72小時；C、酒紅土褐鏈霉菌的固體發(fā)酵固體發(fā)酵物料由質(zhì)量比為45o《的麩皮或米糠，85^的麥飯石粉，1.5%的豆餅粉，O.(FZ的硝酸鉀、0.15幼勺磷酸氳二鉀、0.15站勺氯化鈉、O.戰(zhàn)的碳酸鈣和其余的水組成，121-130。C高壓滅菌，冷卻至25-35°C,按3-10%的比例接入步驟B的液體菌種，攪拌均勻，分裝于無菌曲盤，在30土5。C條件下，間斷通氣培養(yǎng)72小吋，35-5CTC低溫風(fēng)干至物料含水量在12%以下，制得鏈霉菌菌剤活菌含量2xl09cfu-g—1。實施例5酒紅土褐鏈霉菌S506的固體發(fā)酵菌剤A、步驟A同實施例4;B、液體種子培養(yǎng)基由質(zhì)量比為鄉(xiāng)的麩皮粉、戰(zhàn)玉米粉、2%豆餅粉、0.5%甘油、0.1°/。硝酸鈉、0.戦氯化鈉、0.戰(zhàn)碳酸鈣、0.戰(zhàn)磷酸氳二鉀、0.050/。硫酸鎂、005%硫酸亞鐵和其余的水組成，發(fā)酵條件同實施例4;C、酒紅土褐鏈霉菌的固體發(fā)酵物料由質(zhì)量比為35%的麩皮、10%的頁巖粉、1%的豆餅粉，0.W的硝酸鉀、0.15%的磷酸氯二鉀、0.15%的氯化鈉、0.戰(zhàn)的碳酸鈣和其余的水組成，發(fā)酵及制剤條件同實施例4。實施例6酒紅土褐鏈霉菌S506的固體發(fā)酵菌剤A、B、同實施例4;C、酒紅土褐鏈霉菌的固體發(fā)酵物料由質(zhì)量比為5Qo《的麩皮、5o義的沸石粉、1%的豆餅粉，O.，勺硝酸鉀、0.15Q《的磷酸氫二鉀、0.15幼勺氯化鈉、O.戰(zhàn)的碳酸鈣和其余的水組成，發(fā)酵及制剤條件同實力包例4。酒紅土褐鏈霉菌菌劑應(yīng)用示例1(在育苗期應(yīng)用)在蔬菜育苗基質(zhì)中，按1%質(zhì)量比加入酒紅土褐鏈霉菌菌剤，混合均勻后，撒酒紅土褐鏈霉菌菌劑應(yīng)用示例2(在定植期應(yīng)用)在蔬菜定植吋，將酒紅土褐鏈霉菌菌劑與5倍的細田土或充分腐熟的有機肥混合，攪拌均勻，然后將混合物均勻施入定植穴中。之后的定苗，培土，澆水同常規(guī)操作。以上應(yīng)用以及對根際微生物區(qū)系、對根系自毒物質(zhì)的解除和田間應(yīng)用等效果試驗結(jié)果表明，酒紅土褐鏈霉菌S506具有如下綜合功能(1)顯著促迸根系發(fā)育，提高植株對旱、鹽堿、土傳病等的抗逆性能，促進了植株對土壤養(yǎng)分的有效利用，為生長中后期的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)；(2)顯著提高根際活菌總量，并改善根際微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)，使細菌、放線菌數(shù)量提高，絲狀真菌、病原菌數(shù)量下降；(3)有效控制鐮刀菌、絲核菌、根結(jié)線蟲等病原物對根系的侵染，防效與常用的化學(xué)殺菌剤五氯硝基本相當(dāng)，對線蟲的防治超過了阿維菌素；(4)降解酚酸類根系自毒物質(zhì)，顯著緩解根系分泌和上荏根系腐爛釋放毒素對根系的傷害。在連茬多年的蔬菜老區(qū)應(yīng)用，可以顯著提高育成苗的質(zhì)量，病害少，根系發(fā)達，縮短移植后的緩苗時間，提高后期抗病能力。在生長中后期，可有效控制根部病害和地上部病害的發(fā)生，減少用藥奶50%，綜合產(chǎn)量增加25%以上。近幾年，在河北、山東、河南、福建、上海等地的多種蔬菜和果樹上進行了應(yīng)用，均表現(xiàn)出了同樣的抗病、增產(chǎn)和品質(zhì)改善效果，均超過了國內(nèi)外的同類技術(shù)和產(chǎn)品。詳細試驗數(shù)據(jù)見"應(yīng)用試驗報告"(附件)。上述關(guān)于酒紅土褐鏈霉菌、篩選方法及應(yīng)用的描述僅作為本發(fā)明幾種技術(shù)方案提出，不作為對其單一限制條件。權(quán)利要求1、一種酒紅土褐鏈霉菌，其保藏編號為CGMCCNo.2664。2、根據(jù)杈利要求l所述的酒紅土褐鏈霉菌，其特征在于該菌種DNA序列測定結(jié)果為GGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACTGATCCTCGCAGGCATCTGCGAGGTTCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTAG丌GGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTMCTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGMAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCMCATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGCTAACGCA丌AAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAACCCTGGAGACAGGGTCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCTTGTGGTGCTGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGTCACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCC丌ATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGA丌GGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACG丌CCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGGAGCTGTCG。3、根據(jù)杈利要求l所述的酒紅土褐鏈霉菌的篩選方法，其特征在于包括如下步驟(1)拮抗菌株的分離篩選選用河北省欒城縣境內(nèi)栽培的番茄植株，去掉植株根部土壤，隨機剪取新生主根和毛細根，置于含玻璃珠的無菌水中，充分搖動，將根取出，得土壤懸浮液；取出的根系先用無菌水沖洗，然后作表面消毒處理，用無菌水沖)爭殘余乙醇，于無菌研缽中研成糊狀，制作根系懸液；將上述懸液搖勻后，進行稀釋，取0.05-0.15ml涂布于高氏一號培養(yǎng)基上，24-26。C培養(yǎng)71-73小時，分離長勢良好的鏈霉菌菌株，純化后，進行平板純培養(yǎng)；制取鏈霉菌菌塊，分別以立枯絲核菌(//77》^:to/7"s口.)、鐮刀菌(f〃wr7》/77sp.)或腐霉菌(Pj^力/^7SP.)病原菌為靶標(biāo)，在PDA平板上進行對峙培養(yǎng)，病原菌與目的菌相距3cm,每處理3次重復(fù)，同吋于PDA平板上單獨接種病原菌作對照;一周后檢查對峙培養(yǎng)結(jié)果，根據(jù)病原菌在對峙方向的菌落半徑、對照菌落半徑廿算抑菌率；抑菌率％=(對照菌落半徑對峙菌落半徑)/對照菌落半徑xlOOX,選擇抑菌率高且對多種病原同吋具有防效的菌株參與下步篩選試驗；(2)防病促生菌株的篩選采用育苗缽異步生測法，分別對步驟(1)獲得的菌株進行防病和促生功能比較試驗，栽培基質(zhì)按大田壤土農(nóng)家肥:蛭石=6-8:1-3:0.5-1.5比例配制，參試目的菌株和病原菌都制成固體培養(yǎng)物，按1%比例與上述培養(yǎng)基質(zhì)混合；病原菌和生防菌混合接種的栽培基質(zhì)用于抗病性檢測，目的菌單獨接種的用于促生效果檢測，目的菌和病原菌均按栽培基質(zhì)1%的質(zhì)量比接種，基質(zhì)混合均勻后，填裝于育苗缽中；挑選兩葉一心長勢均勻一致的番茄幼苗移栽于上述培養(yǎng)缽中，每處理50棵，各分2組，隨機排列，置于日光溫室中培養(yǎng)；侵染率調(diào)查30天后將根挖出，調(diào)查病情指數(shù)；促生結(jié)果調(diào)查待番茄長到45片真葉時，將番茄苗整株挖出，檢測整株鮮重、地上部干重、葉面積、主根長、根干重指標(biāo)；綜合比較抗病和促生效果，確定優(yōu)勢菌株；(3)防根結(jié)線蟲菌株的篩選二齡幼蟲的培養(yǎng)在黃瓜生長后期，挖取根結(jié)線蟲發(fā)病重、根結(jié)多的黃瓜根，用清水洗去根部泥土，剪成長lcm的根段，放入500mL三角瓶中，倒入200mL0.5%NaC10溶液，用力搖3分鐘，混合溶液過100目篩，用無菌水沖洗篩上碎片5次，溶液再過500目篩，用無菌水沖洗篩上物，液體收集到容器中，獲得卵懸浮液，將收集到的卵塊或卵粒置于中性濾紙上，置于200目網(wǎng)篩上，網(wǎng)篩置于盛有清水的盆中，水位高度為不低于浸濕濾紙，然后置于28。C恒溫箱中孵化，每24小時將盆中水過500網(wǎng)篩，將孵化的二齡幼蟲收集于三角瓶中，置4。C冰箱中備用；防根結(jié)線蟲功能菌株篩選吸取3mL線蟲液于培養(yǎng)皿中，然后加入步驟(2)獲得的目的菌株的培養(yǎng)液各lmL，對照加無菌水，每處理三次重復(fù)，混合液放入28。C恒溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)13小時后，每皿中加2滴0.05%亞甲基藍水溶液，510分鐘鏡檢線蟲死亡率，比較不同菌株培養(yǎng)液對二齡幼蟲的致死效果；防根結(jié)線蟲功能菌株盆栽復(fù)篩分別取連茬4年、8年和11年線蟲危害較重的黃瓜大棚土壤，裝入高Wcm,直徑16cm的花盆中。設(shè)置功能菌、阿維菌素和空白對照三組處理，每處理20盆，添加物用量為功能菌麩皮培養(yǎng)物5g/盆，0.2%阿維菌素乳油稀釋1000倍，于定植后澆灌200mL/盆，用黃瓜做試驗植物，將兩片真葉的津綠3號黃瓜幼苗按每盆一棵移入，定植后，除阿維菌素處理外，每盆澆清水200mL,之后用稱重法澆水，三個月后調(diào)查病情指數(shù)，分級并記錄結(jié)果，分析嚴(yán)重度；采用的分級標(biāo)準(zhǔn)為0級，無根結(jié)；1級，有少數(shù)根結(jié)，占全根系的^25%;2級，根系根結(jié)數(shù)量中等，占全根系的26%50o《；3級，根系根結(jié)數(shù)量很多，占全根系的5^75%;4級，根系根結(jié)數(shù)量很多，占全根系的76%100%,病情指數(shù)(%)=2(級數(shù)x同級株數(shù))/(總株數(shù)X4)xlOO,嚴(yán)重度是指有根瘤根的長度之和占總根系長度的百分比；比較上述結(jié)果，確定更優(yōu)菌株；(4)降解根系自毒物質(zhì)菌株篩選取大田壤土，風(fēng)干后粉碎，過篩，215。C干熱滅菌8小吋。以苯甲酸或/和香豆素為酚酸類自毒物質(zhì)試驗材料，按酌酸自毒物質(zhì)的最終濃度50、100、150、200、250ug/kg移取已配置好的濃度為1000mg/L的苯甲酸或香豆素的母液于滅菌土中，加入步驟(3)所確定菌株的麩皮培養(yǎng)物，混合均勻，分裝入花盆中，每盆裝土1.5kg。將育好的有兩片復(fù)葉的番茄苗按3棵/盆移栽到上述花盆中，定植后，澆水至飽和，之后按稱重法澆水；設(shè)空白對照，每處理五次重復(fù)；觀察幼苗緩苗、長勢情況，30天后檢測成活率、株高、復(fù)葉長度、根系干重生理指標(biāo)；檢測葉片丙二醛和PAL酶活性；比較上述結(jié)果，確定本步驟選出的優(yōu)勢菌株；(5)田間小區(qū)試驗，最終確定優(yōu)勢菌株將經(jīng)過上述四步確定的優(yōu)勢菌株分別制成固體培養(yǎng)物，選擇連茬五年以上，根部病害以及根結(jié)線蟲發(fā)生較為嚴(yán)重的溫室大棚進行應(yīng)用比較試驗；采用定苗期穴施方法，將菌劑與細田土混合，定量施入定苗穴中，之后的定苗、澆水等管理采用同常規(guī)措施，每處理30m2,三次隨機重復(fù)；在生長中期和后期檢測植株長勢、防病、防線蟲效果，以及對產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，綜合比較以上指標(biāo)，確定最優(yōu)菌株。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的酒紅土褐鏈霉菌的篩選方法，其特征在于所述的步驟(1)中采用75%乙醇對無菌水沖洗后的植株根系做表面消毒處理。5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的酒紅土褐鏈霉菌的篩選方法，其特征在于所述的步驟(4)降解根系自毒物質(zhì)菌株篩選中選擇苯甲酸、香豆素混合處理，兩種藥剤按l:l混合，每種藥剤的用量比單一處理減倍。6、根據(jù)杈利要求1所述的酒紅土褐鏈霉菌的應(yīng)用，其特征在于其活菌培養(yǎng)物用于制備防治栽培連作障礙、防病促生和解毒功能的土壤生物修復(fù)剤或調(diào)理剤的有效成分。全文摘要本發(fā)明提供一種鏈霉菌屬酒紅土褐鏈霉菌(Streptomycesvinaceusdrappus)，暫定名為S506，已于2008年9月11日提交中國普通微生物保藏中心保藏，保藏編號為CGMCCNo.2664。本發(fā)明中菌種的分離篩選方法包括如下步驟(1)拮抗菌株的分離篩選；(2)防病促生菌株的篩選；(3)防根結(jié)線蟲菌株的篩選；(4)降解根系自毒物質(zhì)菌株篩選；(5)田間小區(qū)試驗，最終確定優(yōu)勢菌株。本發(fā)明酒紅土褐鏈霉菌S506的應(yīng)用包括通過液體深層發(fā)酵或固體發(fā)酵制備活菌培養(yǎng)物，其活菌培養(yǎng)物用于制備防治栽培連作障礙、防病促生和解毒功能的土壤生物修復(fù)劑或調(diào)理劑的有效成分。文檔編號C12N1/20GK101619293SQ200810079468公開日2010年1月6日申請日期2008年9月27日優(yōu)先權(quán)日2008年9月27日發(fā)明者張翠綿,李曉芝,李洪濤,王占武申請人:河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所