專(zhuān)利名稱：：一種重組人血清白蛋白的純化方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明闡述了一種畢氏酵母表達(dá)的重組人血清白蛋白(rHSA)的純化方法及在細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)人用病毒疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：牛血清白蛋白或人血清白蛋白是細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)病毒疫苗中不可缺少的穩(wěn)定劑，但牛血清白蛋白由于來(lái)源于動(dòng)物并且有潛在的瘋牛病等污染而逐漸被人血液來(lái)源的人血白蛋白所替代。然而同樣，血源人血白蛋白不可避免地含有潛在的病原體感染的危險(xiǎn)，同時(shí)血源人血白蛋白來(lái)源于人血槳而限制了其產(chǎn)量和批間穩(wěn)定性，質(zhì)量不穩(wěn)定。W098/068221998年2月19日公開(kāi)了重組人血清白蛋白(rHSA)用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，其中重組人血清白蛋白是用于促進(jìn)細(xì)胞的增長(zhǎng)。W099/125681999年3月18日公開(kāi)了重組人血清白蛋白與糖、無(wú)機(jī)鹽等組合物用于水痘、帶狀皰疹及麻疹、風(fēng)疹、腮腺炎活病毒的穩(wěn)定劑。rHSA的制備方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，EP0612761、EP0570916和EP0699687中均揭示了一個(gè)用基因操作技術(shù)重組人血清白蛋白的方法。然而，這些方法均因步驟多、周期長(zhǎng)、成本高而變得復(fù)雜，因而難于滿足工業(yè)放大的經(jīng)濟(jì)要求。申請(qǐng)人自有專(zhuān)利申請(qǐng)CN1496993A和CN1854155A公開(kāi)了制備疫苗生產(chǎn)用rHSA的方法。與其他方法相比，該方法所純化的重組HSA特征的顯色物質(zhì)及多糖等雜質(zhì)水平大幅度降低，但內(nèi)毒素水平難以控制，需要進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化處理，控制內(nèi)毒素、提高收率以得到可工業(yè)化的純化工藝。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種高效的適合工業(yè)化的rHSA的純化方法以及rHSA在制備病毒疫苗培養(yǎng)基，特別是狂犬病疫苗培養(yǎng)基和狂犬病疫苗制劑中的用途。本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的首先通過(guò)申請(qǐng)人自有專(zhuān)利申請(qǐng)技術(shù)(CN1854301和CN1854306)構(gòu)建的基因工程酵母菌及生產(chǎn)方法獲得重組人血清白蛋白發(fā)酵液，利用0.5um孔徑的陶瓷膜進(jìn)行過(guò)濾，加熱后的上清液經(jīng)過(guò)高鹽陽(yáng)離子交換層析，收獲的溶液進(jìn)行硼酸鹽處理，經(jīng)過(guò)中空纖維處理的溶液按照CN1854155A中的工藝進(jìn)行疏水交換層析和弱陰離子交換層析。最后，弱陰離子層析的洗脫組分用已知方法，如超濾濃縮方法、冷凍干燥方法等制成各種成品。硼酸鹽沉淀的去除方式在專(zhuān)利CN1854155A中描述為離心去除，但實(shí)際操作中離心后料液澄清度低，在生產(chǎn)上動(dòng)力消耗較大，與專(zhuān)利CN1854155A不同的是，通過(guò)引入中空纖維處理操作，使得發(fā)酵上清液在加熱時(shí)不用加入活性炭，并且對(duì)硼酸鹽處理的溶液不用離心操作，從而使操作更加簡(jiǎn)便。引入中空纖維的優(yōu)點(diǎn)合適孔徑的中空纖維可以大幅度降低內(nèi)毒素含量、濾后料液澄清度好，并且省去活性炭及離心沉淀對(duì)蛋白的吸附，收率提高2-10%。其中中空纖維孔徑為截留分子量100K-0.5um，優(yōu)選為500K-0.2um。內(nèi)毒素水平得到穩(wěn)定控制，以鱟試劑檢測(cè)低于0.5EU/mL(產(chǎn)品濃度為100mg/mL)。除非特別說(shuō)明，本申請(qǐng)中rHSA的濃度(％)的含義為g/100mL，即每100mL溶液中rHSA的含量(g)，如rHSA10X的含義為每lOOmL溶液中rHSA的含量為10g。具體地，本發(fā)明涉及1)—種可工業(yè)化的純化rHSA的方法，包括將含rHSA的發(fā)酵液經(jīng)過(guò)陶瓷膜處理，上清依次經(jīng)過(guò)高鹽陽(yáng)離子交換層析、疏水交換層析和弱陰離子交換層析，得到純化rHSA，其特征是所述經(jīng)高鹽陽(yáng)離子交換層析的溶液在經(jīng)硼酸鹽處理后，利用中空纖維柱進(jìn)行過(guò)濾。2)根據(jù)項(xiàng)1)所述的方法，其中中空纖維的孔徑為截留分子量100K-0.5um，優(yōu)選為500K-0.2咖。3)根據(jù)項(xiàng)1)所述的方法，其中弱陰離子交換層析使用的緩沖液包括醋酸鈉、磷酸鈉、氯化鈉及辛酸鈉等，優(yōu)選為磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉和辛酸鈉，濃度為10mM-200mM，優(yōu)選50-100mM。4)項(xiàng)1)所述方法制備的rHSA，其具備下述特征蛋白純度為99%_100%單體和二聚體，優(yōu)選基本上100%單體和二聚體；宿主蛋白殘留低于100ppm總蛋白，優(yōu)選為10ppm總蛋白；多糖殘留低于10ug/mgrHSA，優(yōu)選為低于lug/mgrHSA;內(nèi)毒素含量低于0.85EU/mL(10%rHSA)，優(yōu)選為0.5EU/mL(10%rHSA)。5)項(xiàng)4)所述的rHSA在病毒疫苗生產(chǎn)細(xì)胞VERO、MDCK或MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)基中的用途。6)根據(jù)項(xiàng)5)所述的用途，其中rHSA的濃度為O.1%_10%，優(yōu)選為0.1%_0.5%。7)根據(jù)項(xiàng)5)_6)所述的用途，其中病毒的培養(yǎng)方法是轉(zhuǎn)瓶工藝，微載體懸浮工藝或多聚酯片吸附的灌注工藝。8)根據(jù)項(xiàng)5)_6)任一所述的用途，其中病毒疫苗為人用狂犬病疫苗。9)項(xiàng)4)所述的rHSA在制備人用狂犬病疫苗制劑中的用途，其中rHSA的濃度為0.1%_10%，優(yōu)選0.5%-5%。10)根據(jù)項(xiàng)9)所述的用途，其中所述的狂犬病疫苗是水針或凍干劑。本發(fā)明獲得的疫苗生產(chǎn)用rHSA具有以下特征l)蛋白濃度為99%_100%單體和二聚體，優(yōu)選基本上100%單體和二聚體。2)宿主蛋白殘留低于100ppm總蛋白，優(yōu)選為10卯m總蛋白。3)多糖殘留低于10ug/mgrHSA，優(yōu)選為低于lug/mgrHSA。4)內(nèi)毒素含量低于0.85EU/mL(10%rHSA)，優(yōu)選為0.5EU/mL(10%rHSA)。本發(fā)明方法制備的rHSA可用于VERO、MDCK和MRC-5細(xì)胞進(jìn)行病毒疫苗的生產(chǎn)，特別是狂犬病疫苗的生產(chǎn)。具體地，在DMEM培養(yǎng)基中添加O.1%_10%，優(yōu)選為0.l%-0.5%的重組人白蛋白做為病毒收液過(guò)程的維持培養(yǎng)基進(jìn)行病毒收液。病毒培養(yǎng)方法可以是轉(zhuǎn)瓶工藝，微載體懸浮工藝或多聚酯片吸附的灌注工藝。同時(shí)，該方法制備的rHSA還可以用作病毒疫苗終產(chǎn)品的穩(wěn)定劑，可以是凍干劑，也可以是水劑。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例僅為本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，不應(yīng)解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1重組人血清白蛋白(rHSA)的純化在純化過(guò)程中所用的各種緩沖液見(jiàn)下表4<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>a)發(fā)酵液的澄清和加熱處理利用孔徑0.5um的陶瓷膜對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行澄清處理，取發(fā)酵上清液80L，加入5mM辛酸鈉、5mMEDTA，在70。C下加熱20分鐘，冷卻。b)高鹽陽(yáng)離子層析分離和濃縮將上述經(jīng)過(guò)處理的樣品以150cm/h流速上樣高鹽陽(yáng)離子CST-IIFF柱(XK50/60,Vt二300ml，GE公司制造，預(yù)先用溶液A平衡)，用溶液B洗脫，得CST-I1BD組分。用截留分子量300K的濃縮膜包(MILLIPORE公司生產(chǎn))進(jìn)行濃縮至100mg/ml左右。c)硼酸鹽處理和中空纖維處理向濃縮組分中加入四硼酸鈉和氯化鈣，使最終濃度為50-100mM，過(guò)夜。用截留分子量500K的中空纖維超濾柱(GE公司)分離。d)加熱處理向中空纖維處理后溶液中加入辛酸鈉和半胱氨酸，至最終濃度各5mM和10mM，在6(TC加熱60分鐘，迅速冷卻。e)疏水層析分離和濃縮加熱后樣品經(jīng)0.45和0.22um的膜過(guò)濾，進(jìn)入PhenylSFF柱(XK50/60，Vt=500ml，GE公司，用溶液C平衡)。收集流穿部分。f)弱陰離子層析分離將上述流穿組分進(jìn)入AminobutylSFF柱(XK50/60,Vt=500ml，GE公司制造，用溶液C平衡)，用溶液D進(jìn)行洗脫，得Amino-BD組分。g)濃縮換液用截留分子量30K的超濾膜濃縮，然后用含辛酸鈉的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉溶液換液，得到最終含rHSA10%的終產(chǎn)品517g。h)產(chǎn)品的鑒定本發(fā)明各步rHSA濃度、產(chǎn)率、糖含量以及純度見(jiàn)下表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>其中，用Bradford方法測(cè)定蛋白濃度，計(jì)算總蛋白量，從而計(jì)算各步收率；糖含量用苯酚-硫酸法測(cè)定；純度利用SDS-PAGE電泳法結(jié)合HPLC法進(jìn)行分析；內(nèi)毒素水平利用鱟試劑法檢測(cè)。實(shí)施例2rHSA在狂犬病疫苗轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝中的應(yīng)用a)細(xì)胞制備將Vero細(xì)胞(來(lái)源于美國(guó)ATCCCRL-1586)進(jìn)行復(fù)蘇、轉(zhuǎn)瓶擴(kuò)增培養(yǎng)，傳代到3.5L雙層轉(zhuǎn)瓶。培養(yǎng)條件37t:，(A5%(v/v)。b)病毒接種當(dāng)Vero細(xì)胞培養(yǎng)成單層時(shí)，以MOI為0.0250.125接種CTN株毒種(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。接種后，換用添加疫苗生產(chǎn)用rHSA0.35X的DMEM培養(yǎng)基維持液。培養(yǎng)溫度34°C。c)病毒收液換用維持液之后每三天收換液一次，收液后繼續(xù)換新鮮維持液，連續(xù)收液三次。分別采用單克隆抗體制備雙抗體夾心ELISA法和小鼠滴定實(shí)驗(yàn)測(cè)定三次收液的G蛋白含量與病毒滴度，測(cè)定數(shù)據(jù)見(jiàn)下表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>d)狂犬病疫苗病毒收獲液的純化病毒收獲液澄清過(guò)濾后進(jìn)行超濾濃縮使用截留分子量750K的中空纖維柱，對(duì)病毒收獲液進(jìn)行超濾濃縮。超濾過(guò)程中，病毒顆粒得到高度濃縮，而培養(yǎng)液中的小分子物質(zhì)如白蛋白、酚紅等大部分在透過(guò)液中被除去。e-丙內(nèi)酯(l:4000)4。C滅活24小時(shí)，37。C水解2小時(shí)；柱層析純化使用S印harose4FastFlow層析柱，按柱體積10%上樣，收集第1峰。經(jīng)層析純化后，病毒液中的低分子量蛋白質(zhì)分子(主要是培養(yǎng)液中的白蛋白)被去除，病毒峰中蛋白質(zhì)含量大大降低。從層析柱收集峰抽取測(cè)定蛋白含量樣品后，立即加入人血白蛋白(湖南衡陽(yáng)南岳制藥廠)作為保護(hù)劑，其終濃度為1%，同時(shí)加入硫柳汞做防腐劑，硫柳汞終濃度《0.08mg/ml。根據(jù)蛋白質(zhì)含量及抗原含量進(jìn)行配制，分裝，成為液體制劑。制劑成品經(jīng)檢驗(yàn)，各項(xiàng)指標(biāo)均符合中華人民共和國(guó)2005版藥典要求，主要是NIH法測(cè)定疫苗效力為4.6IU/劑量，特別是，利用Elisa試劑盒法檢測(cè)到酵母細(xì)胞宿主蛋白殘留小于5ng/劑量。實(shí)施例3rHSA在狂犬病疫苗NBS反應(yīng)器培養(yǎng)工藝中的應(yīng)用a)細(xì)胞制備將Vero細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、轉(zhuǎn)瓶擴(kuò)增培養(yǎng)，以4X105cellS/ml的密度接種于NBS5L生物反應(yīng)器中，反應(yīng)器酯片籃中裝置160g聚酯片，工作容積2.5L，培養(yǎng)條件37°C，溶氧45%，攪拌速度70rpm，pH值7.4。b)病毒接種Vero細(xì)胞培養(yǎng)45天時(shí)，換用添加疫苗生產(chǎn)用rHSA0.35%的DMEM培養(yǎng)基，以MOI為0.0250.125接種CTN株毒種。培養(yǎng)溫度34。C，溶氧45%，攪拌速度70rpm，pH值7.4。c)病毒收液連續(xù)灌注收液20天，收液量24L，混合病毒收液病毒滴度均達(dá)到6.51gLD50。d)狂犬病疫苗病毒收獲液的純化純化操作按照實(shí)施例2中純化操作進(jìn)行。制劑成品經(jīng)檢驗(yàn)，各項(xiàng)指標(biāo)均符合中華人民共和國(guó)2005版藥典要求。主要是NIH法測(cè)定疫苗效力為4.6IU/劑量，特別是，利用Elisa試劑盒法檢測(cè)到酵母細(xì)胞宿主蛋白殘留小于5ng/劑量。實(shí)施例4rHSA在狂犬病疫苗微載體反應(yīng)器培養(yǎng)工藝中的應(yīng)用a)細(xì)胞制備將Vero細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、轉(zhuǎn)瓶擴(kuò)增培養(yǎng)，以5X105cellS/ml的密度接種于工作體積5L的微載體反應(yīng)器，微載體用量125克。反應(yīng)罐在溫度371:，溶氧45%，pH值7.4條件下培養(yǎng)細(xì)胞5日，細(xì)胞濃度達(dá)到1.2X107cells/ml時(shí)接種病毒。b)病毒接種以MOI為0.0250.125接禾中CTN株毒種。用含rHSA0.35%的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度34°C，溶氧45%，pH值7.4，培養(yǎng)72小時(shí)。c)病毒收液病毒培養(yǎng)72小時(shí)后開(kāi)始灌注收液。病毒感染后于第5、9、13天，以及混合收獲液取樣。進(jìn)行鏡檢、病毒滴定和糖蛋白的檢測(cè)。糖蛋白含量小于lIU/ml或細(xì)胞匯合率低于20%，停止收液。共收液14天，收獲病毒液體積58L。第5、9、13天和混合收液檢測(cè)數(shù)據(jù)如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>d)狂犬病疫苗病毒收獲液的純化純化操作按照實(shí)施例2中純化操作進(jìn)行。制劑成品經(jīng)檢驗(yàn)，各項(xiàng)指標(biāo)均符合中華人民共和國(guó)2005版藥典要求。主要是NIH法測(cè)定疫苗效力為4.7IU/劑量，特別是，利用Elisa試劑盒法檢測(cè)到酵母細(xì)胞宿主蛋白殘留小于5ng/劑量。實(shí)施例5rHSA在人二倍體細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)狂犬病疫苗工藝中的應(yīng)用a)細(xì)胞制備人二倍體細(xì)胞系MRC-5，來(lái)自美國(guó)ATCCCCL_171。細(xì)胞系經(jīng)復(fù)蘇、轉(zhuǎn)瓶擴(kuò)增培養(yǎng)，傳代到雙層轉(zhuǎn)瓶。培養(yǎng)條件371:，0)25%。b)病毒接種接種后35天，當(dāng)MRC-5細(xì)胞生長(zhǎng)到培養(yǎng)成單層時(shí)，接種CTN株毒種，接種MOI為0.0250.125。接毒后，換用添加rHSA0.35%的DMEM培養(yǎng)基維持液。培養(yǎng)溫度34°C。c)病毒收液接毒后3天，開(kāi)始收液，收液后繼續(xù)換新鮮維持液，連續(xù)收液三次。分別采用單克隆抗體制備雙抗體夾心ELISA法和小鼠滴定實(shí)驗(yàn)測(cè)定三次收液的G蛋白含量與病毒滴度，測(cè)定數(shù)據(jù)見(jiàn)下表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>d)狂犬病疫苗病毒收獲液的純化純化操作按照實(shí)施例2中純化操作進(jìn)行。制劑成品經(jīng)檢驗(yàn)，各項(xiàng)指標(biāo)均符合中華人民共和國(guó)2005版藥典要求。主要是NIH法測(cè)定疫苗效力為4.5IU/劑量，特別是，利用Elisa試劑盒法檢測(cè)到酵母細(xì)胞宿主蛋白殘留小于5ng/劑量。實(shí)施例6rHSA在VERO、MDCK和MRC-5細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基中應(yīng)用根據(jù)VER0、MDCK(ATCCCCL-34)、MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)代謝情況，在DMEM(Hyclone公司生產(chǎn))培養(yǎng)基中分別添加氨基酸、植物蛋白水解物、重組人血清白蛋白、酯類(lèi)等添加劑，制成VER0、MDCK、MRC-5細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基。主要改進(jìn)如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>酯類(lèi)膽固醇5mg/l乙醇胺60ul/lLipidmixture(sigma，L5416)3ml/l采用上述配方配制成兩種無(wú)血清培養(yǎng)基SFMI:添力口lg/1rHSASFMII:添加lg/1人血白蛋白。實(shí)驗(yàn)方案1:上述兩種培養(yǎng)基用于VERO細(xì)胞傳代培養(yǎng)，用含10%(v/v)血清的匿EM培養(yǎng)基作對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果連續(xù)傳代50代，在上述三種培養(yǎng)基中細(xì)胞狀態(tài)無(wú)明顯差異，細(xì)胞活性均〉99%，細(xì)胞群體倍增時(shí)間為SFMI23小時(shí)、SFMI123.5小時(shí)，對(duì)照培養(yǎng)液為22小時(shí)，結(jié)果表明rHSA可替代血源白蛋白用于VERO細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，二者性能無(wú)明顯差異。實(shí)驗(yàn)方案2:采用上述SFMI、SFMII培養(yǎng)基進(jìn)行MDCK細(xì)胞維持平行對(duì)照試驗(yàn)，以含5%(v/v)血清的DMEM培養(yǎng)液作對(duì)照。[O1OS]a)MDCK細(xì)胞接種6個(gè)2L轉(zhuǎn)瓶。b)細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，換上述三種培養(yǎng)基，各2瓶，維持培養(yǎng)。[OWS]c)隔天換液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果共維持42天，維持結(jié)束時(shí)細(xì)胞貼壁率SFMI為72.7%、SFMII為70.5%、對(duì)照為78.6%。表明rHSA可替代人血清白蛋白用于MDCK無(wú)血清維持培養(yǎng)，二者與含5%血清培養(yǎng)基無(wú)明顯差別。實(shí)驗(yàn)方案3:采用上述SFMI、SFMII培養(yǎng)基進(jìn)行MRC-5細(xì)胞維持平行對(duì)照進(jìn)行試驗(yàn)。1)MRC-5細(xì)胞接種4個(gè)2L轉(zhuǎn)瓶。2)細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，換上述兩種培養(yǎng)基，各2瓶，維持培養(yǎng)。3)隔天換液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果共維持30天，維持結(jié)束時(shí)細(xì)胞貼壁率SFMI為83.5%、SFMII為85.0%。表明rHSA可替代人血清白蛋白用于MRC-5細(xì)胞無(wú)血清維持培養(yǎng)。實(shí)施例7用重組人血清白蛋白做狂犬病疫苗的穩(wěn)定劑水針劑層析純化后的狂犬病毒顆粒收液抽取測(cè)定蛋白濃度樣品后，立即加入終濃度為1%的rHSA作為保護(hù)劑，同時(shí)加入硫柳滎做防腐劑，終濃度<0.08mg/ml。根據(jù)蛋白質(zhì)含量及抗原含量配制半成品，加入rHSA(終濃度1%)作為穩(wěn)定劑，分裝，成為液體制劑。測(cè)定效價(jià)為4.8IU/ml。對(duì)樣品進(jìn)行熱穩(wěn)定性試驗(yàn)37'C放置4周后，測(cè)定效價(jià)，結(jié)果為3.8IU/ml。凍干劑層析純化后病毒顆粒收液根據(jù)蛋白質(zhì)含量及抗原含量配制半成品，加入rHSA(終濃度2%)、麥芽糖等穩(wěn)定劑，分裝，凍干，成為凍干制劑。測(cè)定效價(jià)為4.6IU/支。對(duì)樣品進(jìn)行熱穩(wěn)定性試驗(yàn)37。C放置4周后，測(cè)定效價(jià)，結(jié)果為3.7IU/支。10權(quán)利要求一種可工業(yè)化的純化rHSA的方法，包括將含rHSA的發(fā)酵液經(jīng)過(guò)陶瓷膜處理，上清依次經(jīng)過(guò)高鹽陽(yáng)離子交換層析、疏水交換層析和弱陰離子交換層析，得到純化rHSA，其特征是所述經(jīng)高鹽陽(yáng)離子交換層析的溶液在經(jīng)硼酸鹽處理后，利用中空纖維柱進(jìn)行過(guò)濾。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中中空纖維的孔徑為截留分子量100K-0.5um，優(yōu)選為500K-0.2um。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中弱陰離子交換層析使用的緩沖液包括醋酸鈉、磷酸鈉、氯化鈉及辛酸鈉等，優(yōu)選為磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉和辛酸鈉，濃度為10mM-200mM，優(yōu)選50-100mM。4.權(quán)利要求1所述方法制備的rHSA，其具備下述特征蛋白純度為99%_100%單體和二聚體，優(yōu)選基本上100%單體和二聚體；宿主蛋白殘留低于100ppm總蛋白，優(yōu)選為10ppm總蛋白；多糖殘留低于10ug/mgrHSA，優(yōu)選為低于lug/mgrHSA;內(nèi)毒素含量低于0.85EU/mL(10%rHSA)，優(yōu)選為0.5EU/mL(10%rHSA)。5.權(quán)利要求4所述的rHSA在病毒疫苗生產(chǎn)細(xì)胞VERO、MDCK或MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)基中的用途。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中rHSA的濃度為0.1%_10%，優(yōu)選為0.1%_0.5%。7.根據(jù)權(quán)利要求5-6任一所述的用途，其中病毒的培養(yǎng)方法是轉(zhuǎn)瓶工藝，微載體懸浮工藝或多聚酯片吸附的灌注工藝。8.根據(jù)權(quán)利要求5-6任一所述的用途，其中病毒疫苗為人用狂犬病疫苗。9.權(quán)利要求4所述的rHSA在制備人用狂犬病疫苗制劑中的用途，其中rHSA的濃度為0.1%_10%，優(yōu)選0.5%-5%。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其中所述的狂犬病疫苗是水針或凍干劑。全文摘要本發(fā)明涉及一種重組人血清白蛋白(rHSA)的純化方法，包括將含rHSA的發(fā)酵液經(jīng)過(guò)陶瓷膜處理，上清依次經(jīng)過(guò)高鹽陽(yáng)離子交換層析、疏水交換層析和弱陰離子交換層析，得到純化rHSA，其特征是，所述經(jīng)高鹽陽(yáng)離子交換層析的溶液在經(jīng)硼酸鹽處理后，利用中空纖維進(jìn)行過(guò)濾。本發(fā)明獲得的rHSA可用于細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)人用病毒疫苗，特別是狂犬病疫苗。文檔編號(hào)C12N7/00GK101768206SQ200810080278公開(kāi)日2010年7月7日申請(qǐng)日期2008年12月31日優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日發(fā)明者任樂(lè)民,劉文獻(xiàn),李梅彥,杜力,王志明,賀建功,賈茜,趙偉,高健,魏敬雙,黃順軍申請(qǐng)人:華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司