專利名稱：：H5型和h9型禽流感病毒及新城疫病毒多重檢測方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種用于對禽類及其產(chǎn)品是否感染傳染病進行檢測的方法，確切講是一種檢測禽類及其產(chǎn)品是否感染H5型或H9型禽流感病毒或新城疫病毒的方法。
背景技術：
：禽流感病毒(AIV)和新城疫病毒(NDV)—直是影響?zhàn)B禽業(yè)的最主要病原。雖然通過疫苗的廣泛使用，使得禽流感和新城疫的流行得以控制，但近年來，在我國流行的H5和H9型禽流感及新城疫在高免雞群中呈現(xiàn)流非典型癥狀，常以產(chǎn)蛋量大幅度下降，低死亡率，呼吸道癥狀及后期的神經(jīng)癥狀為特征，臨床很難區(qū)別禽流感病毒的亞型和新城疫病毒。因此，對禽流感病毒和新城疫病毒的檢驗與診斷方面的研究具有重要意義。流感和新城疫是呈全球分布的傳染病，各個國家都有不同程度的發(fā)生。流感對人類的危害眾所周知，它的發(fā)病率和造成的死亡人數(shù)至今仍列為傳染病之首。新城疫也有感染人的報道。在畜牧獸醫(yī)方面，它也威脅著多種家畜家禽甚至很多珍稀野生動物的繁衍和生存，從而對經(jīng)濟也造成極大的影響。由于流感病毒和新城疫的毒株眾多，毒力差別很大，所以臨床癥狀也千差萬別。尤其H5和H9型禽流感及新城疫很難與其他有類似癥狀的傳染病區(qū)分，而且臨床癥狀和病理變化因感染動物的種類、年齡、病程長短、并發(fā)感染情況及感染毒株毒力等不同而有所不同，可能缺乏特征性癥狀和剖檢變化，這給流感的診斷和防治帶來極大的困難。因此，單靠臨床診斷常常難以定性。實驗室診斷是確診流感的惟一有效途徑。特別是隨著血清學實驗技術和分子生物學技術的飛速發(fā)展，流感診斷技術的研究也不斷取得新的進展。同時，分子生物學的發(fā)展為流感病毒核酸序列分析創(chuàng)造了條件。為了確定流感和新城疫是否在某一地區(qū)存在，檢測動物血清抗體的方法并非完全可靠，還必須通過病原學檢査以確診病原的存在。流感病毒和新城疫病原學檢查，一般用生物學實驗、血清學診斷技術和分子生物學診斷技術。這些技術方法雖然得到承認、采納和應用，但是它們有的敏感性不高、有的特異性不強、有的檢出率較底、有的檢測周期太長、有的費用太大，而且這些方法大多都需動用活病毒，存在向周圍環(huán)境散毒的隱患。一般基層單位要開展此項工作，存在不少困難，特別是被檢材料污染，檢出更為困難。因此進行新城疫病毒的分離鑒定，不僅需要嚴格的無'菌取材，還需要低溫保存，迅速送檢，這往往也是一般工作現(xiàn)場難以辦到的。因而建立一種快速診斷該病的方法，已成為流感和新城疫防治技術研究的重要課題。
發(fā)明內容本發(fā)明提供一種快速、簡便、靈敏和經(jīng)濟的檢測的方法，且這種方法用于檢測臨床樣品時，可區(qū)分出病禽所感染的是H5、H9型禽流感病毒及新城疫病毒。本發(fā)明的方法從待檢禽的氣管或泄殖腔拭子或血液或糞便或者死禽的器官組織中提取其全基因組RNA，以RNA為模板，以H5A、H9A和F為靶基因的引物進行多重RT-PCR，對得到的產(chǎn)物進行電泳，根據(jù)電泳圖譜分析被檢禽是否感染有H5、H9型禽流感病毒及新城疫病毒。本發(fā)明中所用的引物分別是H5A為靶基因的引物為上游弓I物5'-ACGTATGACTATCCACAATACTCAG誦3'下游弓I物5'-AGACCAGCTACCATGATTGC-3';H9A為靶基因的引物為上游引物5'-CTACTGTTGGGAGGAAGAGAATGGT-3'下游弓i物5'-TGGGCGTCTTGAATAGGGT-3'F為靶基因的引物為上游引物5'-TCAATCATAGTCAAGTTGC-3'下游弓I物5'-ACCCTTGTATCCTGCGGAT隱3'在本發(fā)明中無菌取待檢禽的氣管或泄殖腔拭子或血液或糞便或者死禽的器官組織，用滅菌生理鹽水研磨成l:5稀釋的乳懸液，全基因組RNA提取方法采用Trizol法0本發(fā)明較經(jīng)典的病毒分離、單個RT-PCR方法和血清學分型方法快捷。本發(fā)明可以比較方便地一次性鑒定出屬于H5、H9型禽流感病毒和新城疫病毒中的那一種病毒感染，可以及時對禽染病情況及區(qū)域、環(huán)境作出及時快捷的反應，以在最短時間內作出正確的處置辦法。這對及時撲滅或治療禽類的傳染病有著積極的意義。另外，本發(fā)明較經(jīng)典方法的病毒分離、鑒定和血清學分型試驗方法快速、準確。本發(fā)明采取的提取全基因組的Trizol法快速、簡捷、低成本，所需試劑種類少，特別適于小樣品提取。因此，本發(fā)明具有廣泛的市場應用前景。圖1為本發(fā)明與標準樣進行的特異性檢測的電泳圖，附圖2為對臨床樣品評估的電泳圖。具體實施例方式以下是本發(fā)明的實施例及對比檢測情況。1.無菌取病禽血液、氣管和泄殖腔拭子或糞便以及死禽的器官組織，最好是禽的腦、脾和肺等器官組織，用滅菌生理鹽水研磨成乳懸液(i:5稀釋)，并每毫升加入青、鏈霉素各2000IU,分裝入小瓶貼好標簽-8(TC保存?zhèn)溆?；采用Trizol方法從血液、咽喉和泄殖腔拭子以及組織中提取包括病毒基因在內的全基因組RNA;同時，無菌提取健康禽血液，同樣用Trizol方法提取組織基因組RNA，以用作陰性對照。2.引物設計，共設計3對引物，各引物的耙基因為H5和H9型禽流感病毒及新城疫病毒相應病毒的高度保守區(qū)域基因，弓I物的退火溫度為50-58"C，弓|物均委托商家合成。各引物參見表2。表2.多重RT-PCR檢測方法所使用的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>3.多重RT-PCR優(yōu)化反應體系為20ml，各引物50pmo1，Taq酶0.5U和AIVA酶0.25U以及相應的緩沖液，模板分別為1步驟提取的病毒基因組RNA和健康禽血液中的基因組RNA，反應在PCR儀上進行，循環(huán)條件見表3。4.擴增程序結束后通過0.8%的瓊脂糖電泳檢測，電泳條件為0.8%的瓊脂糖凝膠，l.OTAE緩沖液，0.3溴化乙錠預染色，80V穩(wěn)壓電泳30分鐘，然后在紫外燈下觀察并對照記錄結果，見圖1所示，各陰性對照物不產(chǎn)生條帶。所有靶基因都得到相對應均勻擴增，而且沒有非特異性擴增帶的出現(xiàn)，應視為最佳的引物濃度組合條件。圖l中l(wèi)-3泳道及10泳道為陰性對照；4，5泳道為H9N2病毒；6，7泳道為H5N1;8，9泳道為NDV;M:DNAmarkerDL2000。表3.多重RT-PCR循環(huán)條件<image>imageseeoriginaldocumentpage6</image>5.多重RT-PCR優(yōu)化條件的驗證將上述RT-PCR條件應用于H5N1、H9N2型禽流感和新城疫病毒陽性樣品的檢測，同樣設定陰性對照物，結果見圖2，陰性對照物不產(chǎn)生條帶，而各病禽樣本的所有泳道的病毒靶基因擴增產(chǎn)物都清晰可見，沒有出現(xiàn)任何特異性擴增，證明無論所列3種病毒視混合感染還是單獨感染，均能在優(yōu)化的多重RT-PCR條件下檢測。圖2中1-3及10泳道為陰性對照；4泳道為H9N2;5泳道為H5N1;6泳道為NDV;7泳道為H5N1和NDV;8泳道為H9N2和NDV;9泳道為H5N1和H9N2;M,DNAmarkerDL2000。.本發(fā)明與現(xiàn)在技術比較，處具有單個RT-PCR技術的靈敏度、特異性和符合率外，主要是一次RT-PCR實現(xiàn)了臨床樣品中3種病毒(H5和H9型禽流感病毒及新城疫病毒)的檢測，成本更低，適合開發(fā)相應多重RT-PCR試劑盒，用于該病的臨床診斷和流行病控制。'權利要求1、H5和H9型禽流感病毒及新城疫病毒多重檢測方法，其特征是從待檢禽的氣管或泄殖腔拭子或血液或糞便或者器官組織中提取全基因組RNA，再以RNA為模板，以H5A、H9A和F為靶基因設計引物進行多重RT-PCR，對擴增產(chǎn)物進行電泳，從電泳圖譜得到被檢禽是否感染有禽流感H5、H9及新城疫病毒F。2、根據(jù)權利要求1所述的H5和H9型禽流感病毒及新城疫病毒多重檢測方法，其特征是所用的引物為H5A為靶基因的引物為上游引物5'-ACGTATGACTATCCACAATACTCAG-3'下游引物5'-AGACCAGCTACCATGATTGC畫3';H9A為靶基因的引物為'上游弓I物5'-CTACTGTTGGGAGGAAGAGAATGGT-3'下游引物5'-TGGGCGTCTTGAATAGGGT-3'F為靶基因的引物為上游弓l物5'畫TCAATCATAGTCAAGTTGC-3'下游弓l物5'-ACCCTTGTATCCTGCGGAT-3'3、根據(jù)權利要求2所述H5型和H9型禽流感病毒及新城疫病毒多重檢測方法，其特征是用滅菌生理鹽水將所提取的樣本研磨成l:5稀釋的乳懸液，再采用Trizol法提取全基因組RNA。全文摘要本發(fā)明公開一種檢測禽類及其產(chǎn)品是否感染H5型或H9型禽流感病毒或新城疫病毒的方法。本發(fā)明的方法是無菌取待檢禽的氣管或泄殖腔拭子或血液或糞便或者死禽的器官組織，用滅菌生理鹽水研磨成乳懸液，再提取其全基因組RNA，以RNA為模板，以H5A、H9A和F為靶基因的引物進行多重RT-PCR，對得到的產(chǎn)物進行電泳，根據(jù)電泳圖譜分析被檢禽是否感染有H5、H9型禽流感病毒及新城疫病毒。文檔編號C12Q1/70GK101230405SQ20081008149公開日2008年7月30日申請日期2008年2月20日優(yōu)先權日2008年2月20日發(fā)明者劉永生,孫德惠,杰張,陳豪泰,馬麗娜申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所