專利名稱：：利用單核苷酸多態(tài)性分析輔助確定中國(guó)漢族患者華發(fā)林使用劑量的方法和生物芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中國(guó)漢族患者華發(fā)林使用劑量的輔助確定方法。更具體地說，本發(fā)明涉及在與華發(fā)林代謝動(dòng)力學(xué)及藥效學(xué)相關(guān)的3個(gè)基因(VKORCl，CYP2C9和EPHX1)上的4個(gè)單核普酸多態(tài)性位點(diǎn)，以及這些單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在預(yù)測(cè)藥物華發(fā)林于中國(guó)漢族人種中不同個(gè)體之安全使用劑量方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：華發(fā)林(Warfarin,也稱為"華法林")是臨床上最常用的香豆素類口服型強(qiáng)抗凝藥物，廣泛用于心臟瓣膜置換、房顫、肺栓塞、再次腦卒中(中風(fēng))等深度動(dòng)靜脈血栓性疾病的預(yù)防和治療。該藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)為3-(a-苯基丙酮)-4-羥基香豆素，為兩種光學(xué)同分異構(gòu)體R型和S型的消旋體(racemic)混合物，其中S異構(gòu)體的抗凝作用比R異構(gòu)體更虧雖3~54#(參見RettieAE,KorzekwaKR,KunzeKL,LawrenceRF,EddyAC,AoyamaT,GelboinHV，GonzalezFJ,TragerWF.HydroxylationofwarfarinbyhumancDNA-expressedcytochromeP-450':aroleforP4502C9intheetiologyofS-warfarin-druginteractions.ChemResToxicol1992;5:54-59)。由于洽療窗窄、個(gè)體使用劑量差異較大及可能存在出血等嚴(yán)重的并發(fā)癥，使得該藥物的使用受到一定的限制。目前華發(fā)林安全使用劑量的調(diào)整主要依靠監(jiān)測(cè)凝血時(shí)間(Prothrombintime,PT)和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(Internationalnormalizedratio,INR)。盡管口服華發(fā)林的病人每天都嚴(yán)密的監(jiān)測(cè)凝血狀況，<旦在治療的開始階_度，仍然約有7.6~16.5%的患者發(fā)生抗凝過度導(dǎo)致的出血并發(fā)癥或抗凝不足引致的血栓栓塞事件(參見AithalGP,DayCP,KestevenPJ,DalyAK.AssociationofpolymorphismsinthecytochromeP450CYP2C9withwarfarindoserequirementsandriskofbleedingcomplications.Lancet1999;353:717-719)。華發(fā)林通過抑制肝臟環(huán)氧化還原酶，使無活性的氧化型(環(huán)氧化物型)維生素K無法還原為有活性的還原型(氫醌型)維生素K,阻止維生素K的循環(huán)應(yīng)用，干擾維生素K依賴性凝血因子II、VII、IX、X的羧化，使這些凝血因子無法活化，僅停留在前體階段(有抗原，無活性)，而達(dá)到抗凝的目的。華發(fā)林通過抑制凝血因子的活化抑制新的血栓形成，限制血栓的擴(kuò)大和延展，抑制在血栓的基礎(chǔ)上形成新的血栓，抑制血栓脫落和栓塞的發(fā)生，有利于已經(jīng)形成血栓的清除。華發(fā)林的劑量反應(yīng)關(guān)系變異很大，不但年齡、體重及性別等會(huì)部分影響不同患者之安全使用劑量，一些環(huán)境因素如藥物、食物和疾病狀態(tài)都可以影響華發(fā)林的藥代動(dòng)力學(xué)。此外，許多遺傳因素包括負(fù)責(zé)華發(fā)林S異構(gòu)體氧化代謝的肝臟微粒體酶細(xì)胞色素P4502C9、維生素K環(huán)氧化還原循環(huán)系統(tǒng)中的維生素K環(huán)氧化還原酶以及含有維生素K環(huán)氧化結(jié)合位點(diǎn)的微粒體環(huán)氧化物水解酶等多種酶活性的變化都會(huì)影響藥物華發(fā)林的安全使用劑量。細(xì)胞色素P4502C9基因(CytochromeP4502C9,CYP2C9)位于人類第IO號(hào)染色體的q24.1-24.3區(qū)，全長(zhǎng)50,707bp,含有8個(gè)外顯子。該基因具有顯著的臨床實(shí)用價(jià)值，它可以羥化大約16%目前臨床使用的藥物。相關(guān)研究顯示，華發(fā)林S異構(gòu)體在肝臟中的降解代謝主要就是通過CYP2C9基因所編碼的酶(參見KaminskyLS,ZhangZY.HumanP450metabolismsofwarfarin.PharmacolTher1997;73:67-74)。由于CYP2C9酶活性的狹窄化，使得一些藥物之安全使用劑量很難評(píng)估。尤其是類似于華發(fā)林之相關(guān)治療窗狹窄的藥物。維生素K環(huán)氧化還原酶基因(VitaminKepoxidereductasecomplexsubunit1,VKORCl)于2004年成功克隆和鑒定(參見LiT,ChangCY,JinDY，LinPJ,KhvorovaA,StaffordDW.IdentificationofthegeneforvitaminKepoxidereductase.Nature2004;427:541-45;RostS,FreginA,IvaskeviciusV,etal.MutationsinVKORClcausewarfarinresistanceandmultiplecoagulationfactordeficiencytype2.Nature2004;427:537-41.)。該基因位于人類第16號(hào)染色體的p11.2區(qū)，全長(zhǎng)4,101bp,含有3個(gè)外顯子。該基因編碼的酶在維生素K環(huán)氧化還原循環(huán)中作用于還原型的維生素K，對(duì)影響下游反應(yīng)中維生素K依賴性凝血因子n、vn、IX、X的羧化起到關(guān)鍵性作用。微粒體環(huán)氧化物水解酶基因(Epoxidehydrolase1,EPHX1)位于人類第1號(hào)染色體的q42.1區(qū)，全長(zhǎng)20,285bp,含有9個(gè)外顯子。該基因所編碼的酶含有一個(gè)維生素K環(huán)氧化結(jié)合位點(diǎn)，在維生素K環(huán)氧/f>;;r、；s》活乇7:由4巳一^M/f々胡人人品Ai+-法-點(diǎn)咖錄/i告y仿絲，W:》Jrfi因子II、VII、IX、x的羧化有一定的影響。—些最新的研究表明，以上3個(gè)基因上多個(gè)位點(diǎn)的單核普酸多態(tài)性(Singlenucleotidepolymorphism,SNP)對(duì)藥物華發(fā)林安全使用劑量有著明顯的影響，但當(dāng)前這些研究大多局限于白種人的范圍內(nèi)(參見WadeliusM,ChenLY,ErikssonN,BumpsteadS,GhoriJ,WadeliusC,BentleyD,McGinnisR,DeloukasP(2007)Associationofwarfarindosewithgenesinvolvedinitsactionandmetabolism.HumGenet121:23-34.)。目前，本領(lǐng)域還沒有關(guān)于中國(guó)漢族人種中這些基因上的單核普酸多態(tài)性位點(diǎn)與藥物華發(fā)林使用劑量的相關(guān)性的全面報(bào)道。鑒于通常單核苷酸多態(tài)性對(duì)應(yīng)于不同人種具有明顯不同的表現(xiàn)形式，與藥物之關(guān)聯(lián)更是需要準(zhǔn)確對(duì)應(yīng)，因此針對(duì)于中國(guó)漢族人種之單核普酸多態(tài)性位點(diǎn)與藥物華發(fā)林使用劑量的關(guān)聯(lián)性的發(fā)明顯得尤為重要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明研究了分布在與抗凝血藥物華發(fā)林代謝動(dòng)力學(xué)及藥效學(xué)相關(guān)的3個(gè)基因(VKORC1,CYP2C9和EPHX1)上的4個(gè)單核普酸多態(tài)性位點(diǎn)，以及這些單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在預(yù)測(cè)藥物華發(fā)林于中國(guó)漢族人種中不同個(gè)體之安全4吏用劑量方面的應(yīng)用。本發(fā)明一方面提供了一種獲取對(duì)確定中國(guó)漢族患者華發(fā)林使用劑量有用的分?jǐn)?shù)的方法，包括以下步驟(l)獲取來自該患者的核酸樣品；(2)針對(duì)選自下組的一個(gè)或多個(gè)單核苦酸多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)所述核酸樣品進(jìn)行檢測(cè)VKORC1基因的rs9934438位點(diǎn)、CYP2C9基因的rsl057910位點(diǎn)和rs9332127位點(diǎn)、EPHX1基因的rs4653436位點(diǎn)；(3)確定所述單核苦酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型；(4)對(duì)所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型進(jìn)行評(píng)分；其中步驟(4)中獲得的分?jǐn)?shù)對(duì)于確定該患者的華發(fā)林使用劑量有幫助。本發(fā)明另一方面提供了一種生物芯片，包括用于針對(duì)選自下組的一個(gè)或多個(gè)單核普酸多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)來自中國(guó)漢族患者的核酸樣品進(jìn)行檢測(cè)的探針VKORC1基因的rs9934438位點(diǎn)、CYP2C9基因的rsl057910位點(diǎn)和rs9332127位點(diǎn)、EPHX1基因的rs4653436位點(diǎn)。我們的研究表明，該藥物使用劑量不僅受年齡及體重等因素W著"A;喪/f去^r^W閱妄J^趙了妞*+Mkk你l太洽日月祈?yè)u處frfW玄,自、有助于建立一套新型的華發(fā)林安全使用劑量預(yù)測(cè)系統(tǒng)，針對(duì)中國(guó)漢族人種中擁有不同基因型的個(gè)體提供科學(xué)有依據(jù)的藥物安全使用劑量參考數(shù)據(jù)。圖1是VKORCl基因示意圖，顯示了包含該基因的部分基因組DNA和單核苦酸多態(tài)性位點(diǎn)rs9934438在此基因上的相對(duì)位置。圖2是CYP2C9基因部分基因組示意圖，顯示了包含該基因的部分基因組DNA和單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rsl057910在此基因上的相對(duì)位置。圖3是CYP2C9基因部分基因組示意圖，顯示了包含該基因的部分基因組DNA和單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs9332127在此基因上的相對(duì)位置。圖4是EPHX1基因部分基因組示意圖，顯示了包含該基因的部分5，非翻i奪區(qū)上游基因組DNA和單核苦酸多態(tài)性位點(diǎn)rs4653436在此基因上的相對(duì)位置。圖5顯示了SEQIDNO:l的核普酸序列以及單核苷酸多態(tài)性4立點(diǎn)的4立置。圖6顯示了SEQIDNO:4的核普酸序列以及單核普酸多態(tài)性4立點(diǎn)的4立置。圖7顯示了SEQIDNO:7的核普酸序列以及單核普酸多態(tài)性4立點(diǎn)的4立置。圖8顯示了SEQIDNO:IO的核苷酸序列以及單核苷酸多態(tài)性4立點(diǎn)的4立置。相關(guān)序列的描述SEQIDNO:l長(zhǎng)度為577bp,為人類VKORCl基因第一個(gè)內(nèi)含子的一部分，包含了多態(tài)性位點(diǎn)rs9934438(該位點(diǎn)又常^L稱呼為VKORCl—1173)。該SNP參考等位基因如圖5中下劃線位置所示，核香酸變化發(fā)生在第500堿基上，可由胸腺嘧啶(T)代替參考?jí)A基胞嘧啶(C)。SEQIDNO:2長(zhǎng)度為25bp-是用來檢測(cè)人類VK0RC1基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs9934438變化類型的人工合成DNA序列。SEQIDNO:3長(zhǎng)度為21bp，是用來檢測(cè)人類VK0RC1基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs9934438變化類型的人工合成DNA序列。SEQIDNO:4長(zhǎng)度為608bp,是人類CYP2C9基因的一部分，包括該基因的第7個(gè)外顯子及多態(tài)性位點(diǎn)rsl057910(該位點(diǎn)又常被稱呼為CYP2C9*3)。該SNP參考等位基因如圖6中下劃線位置所示，核苷酸變化發(fā)生在第441堿基上，可由胞嘧啶(C)代替參考?jí)A基腺嘌呤(A)。SEQIDNO:5長(zhǎng)度為25bp,是用來檢測(cè)人類CYP2C9基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rsl057910變化類型的人工合成DNA序列。SEQIDNO:6長(zhǎng)度為23bp，是用來檢測(cè)人類CYP2C9基因單核普酸多態(tài)性位點(diǎn)rsl057910變化類型的人工合成DNA序列。SEQIDNO:7長(zhǎng)度為313bp,是人類CYP2C9基因的一部分，包含了該基因第4個(gè)外顯子及多態(tài)性位點(diǎn)rs9332127。該SNP參考等位基因如圖7中下劃線位置所示，核苷酸變化發(fā)生在第188堿基上，可由胞嘧啶(C)代替參考?jí)A基烏噤呤(G)。SEQIDNO:8長(zhǎng)度為30bp,是用來檢測(cè)人類CYP2C9基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs9332127變化類型的人工合成DNA序列。SEQIDNO:9長(zhǎng)度為25bp,是用來檢測(cè)人類CYP2C9基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs9332127變化類型的人工合成DNA序列。SEQIDNO:IO長(zhǎng)度為208bp，是人類EPHX1基因5'非翻譯區(qū)上游基因組DNA的一部分，包含了該基因5'非翻譯區(qū)上游基因組DNA的一部分及多態(tài)性位點(diǎn)rs4653436。該SNP參考等位基因如圖8中下劃線位置所示，核苷酸變化發(fā)生在第88堿基上，可由鳥噤呤(G)代替參考?jí)A基腺嘌呤(A)。SEQIDNO:11長(zhǎng)度為25bp,是用來檢測(cè)人類EPHX1基因5，非翻譯區(qū)上游基因組DNA的單核普酸多態(tài)性位點(diǎn)rs4653436變化類型的人工合成DNA序列。SEQIDNO:12長(zhǎng)度為25bp,是用來檢測(cè)人類EPHX1基因5，非翻譯區(qū)上游基因組DNA的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs4653436變化類型的人工合成DNA序列。具體實(shí)施例方式為了便于更好地理解本發(fā)明，以下提供了本文使用的主要術(shù)語的定義。本文中使用的術(shù)語"患者"是指患有某種疾病或具有某種健康狀況，因而需要給予華發(fā)林的人，特別是中國(guó)漢族人。從個(gè)體獲得的"核酸樣品"是指含有核酸的樣品，包括但不限于例如細(xì)胞、組織、血液、腦脊液、分泌物或排出物等。樣品可以是獲自皮膚、肌肉、口腔或結(jié)膜的粘膜、胎盤、胃腸道或其他器官的組織樣品。來自胎兒或胚的細(xì)胞或組織的核酸樣品可以通過合適的方法，例如通過羊膜穿刺術(shù)或絨毛膜采樣來獲得。術(shù)語"樣品"還包括通過分離、純化和/或加工先前定義的樣品而衍生的任何材料。衍生的樣品可以包括從樣品提取的、或通過例如擴(kuò)增或mRNA逆轉(zhuǎn)錄等技術(shù)獲得的核酸樣品。術(shù)語"等位基因"(Allele)是指基因的核香酸序列的不同變化形式。等位基因占據(jù)了同源染色體上的相同基因座或位點(diǎn)。當(dāng)個(gè)體具有某一基因的兩個(gè)相同的等位基因時(shí)，稱為該個(gè)體對(duì)于所述基因是純合的；當(dāng)個(gè)體具有所述基因的兩個(gè)不同的等位基因時(shí)，稱為該個(gè)體對(duì)于所述基因是雜合的。特定基因的等位基因可以在單個(gè)核苷酸上或在多個(gè)核苷酸上相互不同，可以相對(duì)于另一方包括核苦酸替換、刪除和/或插入。"等位基因"可以包括多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，可以應(yīng)用于任何形式的基因組DNA序列，其可以小到單個(gè)核香酸。因而多態(tài)性位點(diǎn)的每種多態(tài)性變異體被認(rèn)為是一等位基因，當(dāng)涉及單個(gè)核苷酸多態(tài)性時(shí)，術(shù)語"多態(tài)性變異體，，和"等位基因"可互換地使用。例如，對(duì)于VK0RC1基因的rs9934438位點(diǎn)，其基因型可以為TT、TC或CC。術(shù)語"互補(bǔ)的，，(Complementary)或"互補(bǔ)物"(Complement)指一段核苷酸序列可以通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與另一條核普酸序列彼jt匕酉己只t。術(shù)語"多態(tài)性"(Polymorphism)指某個(gè)基因或基因的某個(gè)部分在人群中存在多于一種的形式。"多態(tài)的，，或"多態(tài)性的"(Polymorphic)指在某一人群中某一基因有兩種或兩種以上的形式。"多態(tài)性位點(diǎn)"(Polymorphicsite)指核苦酸序列上的存在變化的基因座。"多態(tài)性位點(diǎn)"可以是單個(gè)核苷酸位點(diǎn)，也可以是多個(gè)核苷酸位點(diǎn)。術(shù)語"基因型"(Genotype)是指?jìng)€(gè)體中所含有的等位基因的類型。更確切地說，術(shù)語"基因型"是指在個(gè)體中在一個(gè)或多個(gè)特定多態(tài)性位點(diǎn)上一個(gè)或多個(gè)等位變異體的存在情況。要理解的是，個(gè)體的基因組對(duì)于每個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)通常含有兩個(gè)等位變異體(位于同源染色體上)。等位變異體可以是相同或不同的。例如，對(duì)于某一個(gè)體的EPHX1基因的rs4653436位點(diǎn)來說，如果在其中一條同源染色體上該位點(diǎn)為A,而在另一條同源染色體上為G,那么該位點(diǎn)基因型將為AG;如果兩條同源染色體在該位點(diǎn)處都是A,那么該位點(diǎn)基因型將為AA;同樣地，如果兩條同源染色體在該位點(diǎn)處都是G,那么該位點(diǎn)基因型將為GG。對(duì)某一個(gè)體或其DNA樣品進(jìn)行"基因型檢測(cè)"或者對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行"檢測(cè)"是指在核苷酸的水平上來確定該個(gè)體在特定多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因序列。檢測(cè)手段包括本領(lǐng)域常用的PCR擴(kuò)增、DNA測(cè)序、限制性內(nèi)切酶消化等。與某一單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)"同屬一個(gè)單倍體型，，或呈現(xiàn)"連鎖不平衡"的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)指的是，由于人類染色體上一些相互鄰近的多態(tài)性位點(diǎn)趨向于在一起共同遺傳，該位點(diǎn)周圍染色體區(qū)域上的SNPs狀況很可能是一致的。這些變異連鎖的區(qū)域就同屬一個(gè)單倍體型。而連鎖不平衡是指在某一群體中，不同座位上某兩個(gè)等位基因出現(xiàn)在同一條單體型上的頻率與預(yù)期值之間有明顯的差異。這些位點(diǎn)在一定程度上可作為該群體的遺傳標(biāo)志。術(shù)語"寡核普酸，，(Oligonucleotide)和"多核苷酸"(Polynucleotide)在這里可互換使用，指的是在長(zhǎng)度上超過一個(gè)核苷酸的RNA或DNA序列，或者RNA/DNA雜交的序列。這些序列可以單鏈或雙鏈的形式存在。在此使用的術(shù)語"引物"(Primer),一般是指以序列特異性方式與互補(bǔ)模板核酸分子雜交的寡核苷酸。術(shù)語"引物"特別是指單鏈寡核苷酸，可以用于但不限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)的方法，在適合的條件下(例如，在存在四種不同的核苷三磷酸和聚合劑，例如DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA連接酶等的情況下)，在含有任何必需的輔助因子的適合緩沖液中以及在適合的溫度下，其可以作為模板-指導(dǎo)的DNA合成的起始點(diǎn)?？梢栽O(shè)計(jì)引物對(duì)通過PCR來擴(kuò)增DNA區(qū)域。這種引物對(duì)通常包括與;f莫板DNA分子的不同區(qū)域雜交的"正向"和"反向"引物。引物的長(zhǎng)度取決于引物的預(yù)期用途，但典型的范圍從約10個(gè)到約30個(gè)核苷酸。短的引物分子一般需要更低的溫度來與模板形成足夠穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。引物不必與模板完全互補(bǔ)，但應(yīng)當(dāng)具有足夠的互補(bǔ)性以與之雜交。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將了解，在設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮其他約束條件。典型地，引物與目標(biāo)核酸的至少約8個(gè)、更通常地至少約10到15個(gè)、更常見地約20-25個(gè)、甚至約40、50或75個(gè)連續(xù)核苷酸雜交。在某些實(shí)施方式中，引物包含100個(gè)或更少的核苷酸，例如6到50個(gè)核普酸、或12到30個(gè)核苷酸。在某些實(shí)施方式中，所述引物與所述目標(biāo)核酸或其互補(bǔ)物具有至少70%、80%、90%、95%或更高的同一性。在某些實(shí)施方式中，探針或引物進(jìn)一步包含標(biāo)記。例如，標(biāo)記可以是放射性同位素、焚光化合物、酶或酶輔因子。展現(xiàn)與多態(tài)性位點(diǎn)的差異性或選擇性結(jié)合的寡核普酸可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地設(shè)計(jì)。例如，與包含多態(tài)性位點(diǎn)的序列完全互補(bǔ)的寡核苷酸一般地將優(yōu)先與包含該序列的核酸雜交。術(shù)語"外顯子"(Exon)指的是基因中編碼蛋白質(zhì)的DNA序列。術(shù)語"內(nèi)含子"(Intron)指的是那些打斷基因中編碼蛋白質(zhì)的DNA序列的序列。通常，內(nèi)含子序列可以被轉(zhuǎn)錄為RNA,但是在RNA翻譯為蛋白質(zhì)之前會(huì)^f皮切除。本文所用的術(shù)語之SNP的編號(hào)，例如VK0RC1基因的"rs9934438"位點(diǎn)，是根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)之SNP數(shù)據(jù)庫(kù)(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)所提供，該位點(diǎn)序列可通過輸入相應(yīng)位點(diǎn)的編號(hào)于該數(shù)據(jù)庫(kù)中直接搜索并確定。本發(fā)明一方面提供了一種獲取對(duì)確定中國(guó)漢族患者華發(fā)林使用劑量有用的分?jǐn)?shù)的方法，包括以下步驟(l)獲取來自該患者的核酸樣品；(2)針對(duì)選自下組的一個(gè)或多個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)所述核酸樣品進(jìn)行檢測(cè)VKORC1基因的rs9934438位點(diǎn)、CYP2C9基因的rs1057910位點(diǎn)和rs9332127位點(diǎn)、EPHX1基因的rs4653436位點(diǎn)；(3)確定所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型；(4)對(duì)所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型進(jìn)行評(píng)分；其中步驟(4)中獲得的分?jǐn)?shù)對(duì)于確定該患者的華發(fā)林使用劑量有幫助。根據(jù)本發(fā)明的研究結(jié)果，所述分?jǐn)?shù)與所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型的關(guān)系為對(duì)于VK0RC1基因的rs9934438位點(diǎn)的分?jǐn)?shù)COTOTT;對(duì)于CYP2C9基因的rsl057910位點(diǎn)的分?jǐn)?shù)AA〉A(chǔ)OCC;對(duì)于CYP2C9基因的rs9332127位點(diǎn)的分?jǐn)?shù)GG〉GOCC;對(duì)于EPHX1基因的rs4653436位點(diǎn)的分?jǐn)?shù)AA>AG>GG。典型地，分?jǐn)?shù)較高的患者比分?jǐn)?shù)較低的患者通常需要更多的華發(fā)林。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，對(duì)于VKORC1的rs9934438位點(diǎn)來說，可以按以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分TT=0,TC=1,CC=2;CYP2C9的rsl057910位點(diǎn)可以按以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分AA=0,AC=-1,CC=-2;CYP2C9的rs9332127位點(diǎn)可以按以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分GG=0,GC=-1,CC=-2;EPHX1的rs4653436位點(diǎn)可以按以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分GG=0,AG=1,AA=2。應(yīng)當(dāng)理解，還可以采用其他的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，只要能夠反映上文所述的分?jǐn)?shù)與單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的關(guān)系即可。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，華發(fā)林臨床劑量的確定依賴于多種因素，本發(fā)明的方法所提供的分?jǐn)?shù)對(duì)于臨床醫(yī)師確定給予該患者的最終臨床劑量將有一定幫助，但并不能由該分?jǐn)?shù)直接確定最終臨床劑量。優(yōu)選地，對(duì)所述核酸樣品進(jìn)行的檢測(cè)通過PCR、限制性內(nèi)切酶消化或者DNA測(cè)序進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，所述PCR采用選自下組的引物對(duì)或其互補(bǔ)引物對(duì)進(jìn)行對(duì)于VK0RC1基因的rs9934438位點(diǎn)，SEQIDNO:2和3;對(duì)于CYP2C9基因的rsl057910位點(diǎn)，SEQIDNO:5和6;對(duì)于CYP2C9基因的rs9332127位點(diǎn)，SEQIDNO:8和9;對(duì)于EPHX1基因的rs4653436位點(diǎn)，SEQIDNO:ll和12。優(yōu)選地，上述步驟(2)中還包括檢測(cè)與所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)同屬一個(gè)單倍體型或呈現(xiàn)連鎖不平衡的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)。具體地，所述遺傳標(biāo)記位點(diǎn)特別包括與VKORCl基因的rs9934438位點(diǎn)有關(guān)聯(lián)的rs9923231、rs2359612及rs7294位點(diǎn)。本發(fā)明另一方面提供了一種獲取對(duì)確定中國(guó)漢族患者華發(fā)林使用劑量有用的參考值的方法，包括以下步驟(l)獲取來自該患者的核酸樣品；(2)針對(duì)選自下組的一個(gè)或多個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)所述核酸樣品進(jìn)行檢測(cè)VK0RC1基因的rs9934438位點(diǎn)、CYP2C9基因的rsl057910位點(diǎn)和rs9332127位點(diǎn)、EPHX1基因的rs4653436位點(diǎn)；(3)確定所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型；(4)對(duì)所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型進(jìn)行評(píng)分；(5)獲取該患者的年齡和體重；(6)根據(jù)選自下組的方程式計(jì)算參考值D:D=(2.187±0.635)+(0.026±0.009)xBW—(0.022±0.006)xAge+(2.010±0.228)x(VKORCl一rs9934438:TT=0;TC=1;CC=2)，D=(2.250±0.735)+(0.025±0.010)xBW—(0.013±0.007)xAge—(0.930±0.341)x(CYP2C9—rsl057910:AA=0;AC=1;CC=2)—(0.765±0.376)x(CYP2C9一rs9332127:GG=0;GC=1;CC=2)，D=(2.026±0.598)+(0.028±0.008)xBW—(0.017±0.006)xAge+(2.114±0.216)x(VKORCl—rs9934438:TT=0;TC=1;CC=2)—(1.172±0.278)x(GYP2C9—rsl057910:AA=0;AC=1;CC=2)—(0.866±0.305)x(CYP2C9一rs9332127:GG=0;GOl;CC=2),D=(2.120±0.604)+(0.027±0.008)xBW—(0.017±0.006)xAge+(2.114±0.216)x(VKORCl—rs9934438:TT=0;TC=1;CC=2)—(1.172±0.278)x(CYP2C9—rsl057910:AA=0;AC=1;CC=2)—(0.866±0.305)x(CYP2C9—rs9332127:GG=0;GC=1;CC=2)+(0.156±0.140)x(EPHXl一rs4653436:GG=0;AG=1;AA=2)，其中，BW代表患者體重，Age代表患者年齡；其中參考值D對(duì)于確定該患者的華發(fā)林使用劑量有幫助。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，由于華發(fā)林臨床劑量的確定依賴于多種因素，包括例如患者的總體健康狀況、疾病的嚴(yán)重程度等，因此上述方法所提供的參考值D對(duì)于臨床醫(yī)師確定給予該患者的最終臨床劑量將有一定幫助，但并不能以該參考值直接作為最終臨床劑量。本發(fā)明再一方面提供了一種生物芯片，包括用于針對(duì)選自下組的一個(gè)或多個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)來自中國(guó)漢族患者的核酸樣品進(jìn)行檢測(cè)的探針VKORC1基因的rs9934438位點(diǎn)、CYP2C9基因的rsl057910位點(diǎn)和rs9332127位點(diǎn)、EPHX1基因的rs4653436位點(diǎn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一段分離的多核苷酸片段，它具有SEQIDNO:l的序列。該多核苷酸片段為人類VK0RC1基因第一個(gè)內(nèi)含子的一部分，包含了多態(tài)性位點(diǎn)rs9934438(該位點(diǎn)又常被稱呼為VKORC1—1173)。該SNP參考等位基因如圖5中下劃線位置所示，核苷酸變化是發(fā)生在第500堿基上，可由胸腺嘧啶(T)代替參考?jí)A基胞嘧啶(C)?？梢酝ㄟ^測(cè)定該片段的核普酸序列來確定多態(tài)性位點(diǎn)rs9934438的情況。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，盡管SEQIDN0:1是優(yōu)選的核酸序列，但還可以通過測(cè)定包括多態(tài)性位點(diǎn)rs9934438的更長(zhǎng)或更短的核酸序列來研究該位點(diǎn)的有關(guān)情況。本發(fā)明還提供一套PCR引物可用于擴(kuò)增SEQIDNO:1的多核苷酸片段并可用于此片段的測(cè)序分析。該套引物中的第一條引物的序列與SEQIDNO:2所示相同，或與之互補(bǔ)；第二條引物的序列與SEQIDNO:3所示相同，或與之互補(bǔ)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一段分離的多核苷酸片段，它具有SEQIDNO:4的序列。該多核苷酸片段為人類CYP2C9基因的一部分，包括該基因的第7個(gè)外顯子及多態(tài)性位點(diǎn)rsl057910(該位點(diǎn)又常一皮稱呼為CYP2C9*3)。該SNP參考等位基因如圖6中下劃線位置所示，核苷酸變化是發(fā)生在第441堿基上，可由胞嘧啶(C)代替參考?jí)A基腺噪呤(A)。本發(fā)明還提供一套PCR引物可用于擴(kuò)增如同SEQIDNO:4的多核普酸片段并可用于此片段的測(cè)序分析。該套引物中的第一條引物的序列與SEQIDNO:5所示相同，或與之互補(bǔ)；第二條引物的序列與SEQIDNO:6所示相同，或與之互補(bǔ)。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一段分離的多核普酸片段，它具有SEQIDNO:7的序列。該多核苷酸片段為人類CYP2C9基因的一部分，包含了該基因第4個(gè)外顯子及多態(tài)性位點(diǎn)rs9332127。該SNP參考等位基因如圖7序列中下劃線位置所示，核苷酸變化是發(fā)生在第188堿基上，可由胞嘧啶(C)代替參考?jí)A基鳥。票呤(G)。本發(fā)明還提供一套PCR引物可用于擴(kuò)增如同SEQIDNO:7的多核苦酸片段并可用于此片段的測(cè)序分析。該套引物中的笫一條引物的序列與SEQIDNO:8所示相同，或與之互補(bǔ)；第二條引物的序列與SEQIDNO:9所示相同，或與之互補(bǔ)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一段分離的多核苷酸片段，它具有SEQIDNO:IO的序列。該多核苷酸片段為人類EPHX1基因的一部分，包含了該基因5'非翻譯區(qū)上游的部分基因組DNA及多態(tài)性位點(diǎn)rs4653436。該SNP參考等位基因如圖8序列中下劃線位置所示，核苷酸變化是發(fā)生在第88堿基上，可由鳥嘌呤(G)代替參考?jí)A基腺嘌呤(A)。本發(fā)明還提供一套PCR引物可用于擴(kuò)增如同SEQIDNO:IO的多核苦酸片段并可用于此片段的測(cè)序分析。該套引物中的第一條引物的序列與SEQIDNO:ll所示相同，或與之互補(bǔ)；第二條引物的序列與SEQIDN0:12所示相同，或與之互補(bǔ)。本發(fā)明還提供一系列用于檢測(cè)上述與華發(fā)林藥物使用劑量具有特異關(guān)聯(lián)性的SNP位點(diǎn)基因型的方法。為了檢測(cè)VK0RC1基因的rs9934438，可以使用SEQIDN0:2和SEQIDN0:3所示的引物來擴(kuò)增一段與SEQIDN0:1相同的DNA片段。如采用AmphTaqGold聚合酶試劑盒(AppliedB呵st畫,CA，USA)，則PCR反應(yīng)程序?yàn)?5度(。C)10分鐘(1個(gè)循環(huán))；接著是45個(gè)循環(huán)的94度15秒，64度15秒和72度1分鐘；最后72度延伸2分鐘(1個(gè)循環(huán))。產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙錠染色進(jìn)行分析確認(rèn)。經(jīng)PCR純化試劑盒純化后，該擴(kuò)增片段可使用SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示引物進(jìn)行測(cè)序直接獲得基因型。此外也可使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-P艮制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PolymeraseChainReactionRestrictionFragmentLengthPolymorphism,PCR-RFLP)方法分4斤，即孑吏用限制性內(nèi)切酶S^I對(duì)該擴(kuò)增片段進(jìn)行消化，并使用溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠成像電泳分析。如該擴(kuò)增片段消化前后沒有變化，說明該位點(diǎn)基因型為TT;如該擴(kuò)增片段消化后呈現(xiàn)為577bp、500bp及77bp三段，說明該位點(diǎn)基因型為TC;如該擴(kuò)增片段消化后呈現(xiàn)為500bp和77bp兩段，說明該位點(diǎn)基因型為CC。為了檢測(cè)CYP2C9基因的rsl057910位點(diǎn)，可以使用SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的引物來擴(kuò)增一段與SEQIDNO:4相同的DNA片I殳。如采用AmpliTaqGold聚合酶試劑盒(AppliedBiosystems,CA,USA),則PCR反應(yīng)程序?yàn)?5度10分鐘(1個(gè)循環(huán))；接著是45個(gè)循環(huán)的94度15秒，60度15秒和72度1分鐘；最后72度延伸2分鐘(1個(gè)循環(huán))。產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙錠染色進(jìn)行分析確認(rèn)。經(jīng)PCR純化試劑盒純化后，該擴(kuò)增片段可使用SEQIDNO:5或SEQIDNO:6所示引物進(jìn)行測(cè)序直接獲得基因型。為了檢測(cè)CYP2C9基因的rs9332127位點(diǎn)，可以使用SEQIDNO:8和SEQIDNO:9所示的引物來擴(kuò)增一段與SEQIDNO:10相同的DNA片段。如采用AmpliTaqGold聚合酶試劑盒(AppliedBiosystems,CA,USA)，則PCR反應(yīng)程序?yàn)?5度10分鐘(1個(gè)循環(huán))；接著是45個(gè)循環(huán)的94度15秒，64度15秒和72度1分鐘；最后72度延伸2分鐘(1個(gè)循環(huán))。產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙錠染色進(jìn)行分析確認(rèn)。經(jīng)PCR純化試劑盒純化后，該擴(kuò)增片段可使用SEQIDNO:8或SEQIDNO:9所示引物進(jìn)行測(cè)序直接獲得基因型。此外也可使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PolymeraseChainReactionRestrictionFragmentLengthPolymorphism,PCR醫(yī)RFLP)方法分才斤，即使用限制性內(nèi)切酶//pal對(duì)該擴(kuò)增片段進(jìn)行消化，并使用溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠成像電泳分析。如該擴(kuò)增片段消化前后沒有變化，說明該位點(diǎn)基因型為CC;如該擴(kuò)增片段消化后呈現(xiàn)為313bp、188bp及125bp三段，說明該位點(diǎn)基因型為GC;如該擴(kuò)增片段消化后呈現(xiàn)為188bp和125bp兩段，說明該位點(diǎn)基因型為GG。為了檢測(cè)EPHX1基因的rs4653436位點(diǎn)，可以使用SEQIDNO:11和SEQIDNO:12所示的引物來擴(kuò)增一段與SEQIDNO:10相同的DNA片段。如采用AmpliTaqGold聚合酶試劑盒(AppliedBiosystems,CA,USA),則PCR反應(yīng)程序?yàn)?5度10分鐘(1個(gè)循環(huán))；接著是45個(gè)循環(huán)的94度15秒，62度15秒和72度1分鐘；最后72度延伸2分鐘(1個(gè)循環(huán))。產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙錠染色進(jìn)行分析確認(rèn)。經(jīng)PCR純化試劑盒純化后，該擴(kuò)增片段可使用SEQIDNO:11或SEQIDNO:12所示引物進(jìn)行測(cè)序直接獲得基因型。此外也可使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PolymeraseChainReactionRestrictionFragmentLengthPolymorphism,PCR-RFLP)方法分析，即使用限制性內(nèi)切酶^"I對(duì)該擴(kuò)增片段進(jìn)行消化，并使用溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠成像電泳分析。如該擴(kuò)增片段消化前后沒有變化，說明該位點(diǎn)基因型為AA;如該擴(kuò)增片段消化后呈現(xiàn)為208bp、120bp及88bp三段，說明該位點(diǎn)基因型為AG;如該擴(kuò)增片段消化后呈現(xiàn)為120bp和88bp兩段，說明該位點(diǎn)基因型為GG。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，基于堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，還可以釆用上述引物的互補(bǔ)物來擴(kuò)增模板序列的互補(bǔ)物。本發(fā)明所提及之SNP位點(diǎn)檢測(cè)亦可使用以下多種不同的方法檢測(cè)以上所述單核普酸多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因型，包括有基因芯片的方法(例如:Affymetrix公司的GenFlexTMTag;PamgeneInc.公司的PamChip等)；把DNA固定在基質(zhì)上(例如MarligenBioscience公司的SIGNETY-SNPIdentificationSystem;AppliedBiosystemsInc.公司的SNPaPshotTMMultiplexSystem);分子4言才示才支術(shù)(SanyaTyagi,PublicHealthResearchInstitute,NewYork,USA)和PyrosequencingTM技術(shù)(PyrosequencingAB)。還可使用以下方法來完成用等位基因特異性引物，等位基因特異性探針直接對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行測(cè)序；單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SingleStrandComformationPolymorphism,SSCP);變性梯度膠電泳(DenaturingGradientGelElectrophoresis,DGGE);單堿基延伸反應(yīng)(SingleBaseExtension,SBE),又名孩i測(cè)序法(Minisequencing);乂又堿基延伸反應(yīng)(TwoBasesExtension,TBE);連接依賴性的多探針擴(kuò)增(MultiplexLigationDependentProbeAmplification,MLDPA)等等。it匕外，人工合成的或重組的DNA分子都可以用于4企測(cè)，這些DNA分子序列包含所述SNP位點(diǎn)的任意組合，可以是一條或兩條DNA鏈。序列可以是它們?nèi)我庖环N等位基因形式和側(cè)翼序列，也可以是和這些SNP位點(diǎn)連鎖不平衡的基因座。本發(fā)明提供如表1所顯示之在中國(guó)漢族人種中VKORCl基因的rs9934438位點(diǎn)、CYP2C9基因的rsl057910和rs9332127位點(diǎn)、EPHX1基因的rs4653436位點(diǎn)的等位基因型數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)顯示在中國(guó)漢族人種中上述SNP位點(diǎn)等位基因型分布比例和特征。本發(fā)明提供如表2所示為在中國(guó)漢族人種中各種影響因子包括體重、年齡、VKORC1基因的rs9934438位點(diǎn)、CYP2C9基因的rsl057910和rs9332127位點(diǎn)、EPHX1基因的rs4653436位點(diǎn)等分別與華發(fā)林藥物劑量之間的偏相關(guān)系數(shù)(PartialCorrelation)。此數(shù)據(jù)指出這些因素與華發(fā)林藥物使用劑量有著顯著影響關(guān)系。簡(jiǎn)單而言，數(shù)據(jù)分析顯示，如果從患者DNA所檢測(cè)到VKORC1基因上的rs9934438為TC或CC,那么同比而言該患者比擁有rs9934438為TT基因型的個(gè)體需要服用更多的華發(fā)林；如果從患者DNA所檢測(cè)到CYP2C9基因的rsl057910為AC或CC,那么同比而言該患者比擁有rsl057910為AA基因型的個(gè)體需要服用更少的華發(fā)林；如果從患者DNA所檢測(cè)到CYP2C9基因的rs9332127位點(diǎn)為GC或CC,那么同比而言該患者比擁有rs9332127位點(diǎn)為GG基因型的個(gè)體需要服用更少的華發(fā)林；如果從患者DNA所檢測(cè)到EPHX1基因的rs4653436位點(diǎn)為AA或AG，那么同比而言該患者比擁有rs9332127位點(diǎn)為GG基因型的個(gè)體需要服用更多的華發(fā)林。此外，通過檢測(cè)檢測(cè)與上述4個(gè)位點(diǎn)中的一個(gè)或幾個(gè)同屬一個(gè)單倍體型(Haplotype)或呈現(xiàn)連鎖不平衡(LinkageDis叫uilibrium,LD)的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)的核苷酸序列，特別是檢測(cè)與VKORCl基因上的rs9934438有關(guān)聯(lián)的rs9923231、rs2359612及rs7294位點(diǎn)等亦可使用該方法進(jìn)行診斷。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了檢測(cè)與華發(fā)林藥物使用劑量相關(guān)的SNP位點(diǎn)的試劑盒以及明確的測(cè)試方法。用DNA測(cè)序或其他基因型才企測(cè)方法檢測(cè)感興趣的SNP位點(diǎn)，首先需要從患者總DNA模板中使用PCR技術(shù)擴(kuò)增含有以下一個(gè)或者多個(gè)SNP位點(diǎn)的DNA片段，這些SNP位點(diǎn)包括VKORCl基因的rs9934438位點(diǎn)、CYP2C9基因的rsl057910和rs9332127位點(diǎn)、EPHX1基因的rs4653436位點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的核苷酸序列，或者通過檢測(cè)與上述4個(gè)位點(diǎn)中的一個(gè)或幾個(gè)同屬一個(gè)單倍體型(Haplotype)或呈現(xiàn)連鎖不平衡(LinkageDis叫uilibrium,LD)的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)的核苷酸序列，特別是4全測(cè)與VKORCl基因上的rs9934438有關(guān)聯(lián)的rs9923231、rs2359612及rs7294位點(diǎn)等。所獲得的PCR產(chǎn)物可用于之后的DNA測(cè)序或別的包括如上文所述之基因型檢測(cè)方法來檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的不同等位基因形式。一個(gè)能夠用于以上檢測(cè)的試劑盒可能包括下列組分中的一個(gè)或幾個(gè)PCR引物，等位基因特異性探針，DNA聚合酶，PCR反應(yīng)緩沖液，氯化鎂，PCR反應(yīng)或引物延伸所需的4種脫氧核糖核酸。如使用PCR-RFLP方法進(jìn)行檢測(cè)，則可能包含特異的限制性內(nèi)切酶。如果需要測(cè)序的話，該試劑盒還可能需要含有測(cè)序引物，DNA聚合酶，4種標(biāo)記的雙脫氧核糖核酸和4種未標(biāo)記的脫氧核糖核酸。當(dāng)基因型檢測(cè)方法中不需要對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，該DNA可直接用于片企測(cè)上述SNP位點(diǎn)。本發(fā)明還提供如表3所示基于各種影響因子包括體重、年齡、VKORCl基因的rs9934438位點(diǎn)、CYP2C9基因的rsl057910和rs9332127位點(diǎn)、EPHX1基因的rs4653436位點(diǎn)之等位基因型與華發(fā)林安全使用劑量之間相關(guān)性多元線形回歸分析得出的五種^t型研究數(shù)據(jù)。相應(yīng)的，本發(fā)明提供一種對(duì)華發(fā)林的安全使用劑量進(jìn)行評(píng)估預(yù)測(cè)的模型方法。該方法包括以下選項(xiàng)中的一項(xiàng)或者多項(xiàng)(l)確定患者的年齡和體重；(2)選擇并確定以下所述4個(gè)SNP位點(diǎn)(包括VKORC1基因的rs9934438位點(diǎn)、CYP2C9基因的rs1057910和rs9332127位點(diǎn)、EPHX1基因的rs4653436位點(diǎn))中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的核苷酸序列，或者通過檢測(cè)與上述4個(gè)位點(diǎn)中的一個(gè)或幾個(gè)同屬一個(gè)單倍體型(Haplotype)或呈現(xiàn)連鎖不平衡(LinkageDisequilibrium,LD)的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)的核普酸序列，特別是檢測(cè)與VK0RC1基因上的rs9934438有關(guān)聯(lián)的rs9923231、rs2359612及rs7294位點(diǎn)等；(3)借助使用統(tǒng)計(jì)方法得到的相關(guān)系數(shù)對(duì)以上不同參數(shù)組合進(jìn)行劑量方程計(jì)算。該方法可以在了解相應(yīng)的參數(shù)后為患者的藥物安全劑量使用方面提供指導(dǎo)，最大可能地避免抗凝過度導(dǎo)致的出血并發(fā)癥或抗凝不足引致的血栓栓塞事件的產(chǎn)生。以下將舉例說明如何進(jìn)行本發(fā)明所述劑量方程計(jì)算的^t型方法。下列示例性方程中，患者所需華發(fā)林安全使用日劑量使用D代表，單位為毫克(mg);體重使用BW代表，單位為公斤(kg);年齡使用Age代表，單位為歲數(shù)(year);其中包含特異SNP基因型變化的模型直接根據(jù)所提示數(shù)據(jù)直接代替進(jìn)行換算。下列各項(xiàng)系數(shù)通過研究數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸統(tǒng)計(jì)計(jì)算而得，但正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的那樣，本發(fā)明所提及之劑量計(jì)算方程并不局限于以下實(shí)施例中所列，以下所使用之方程亦僅為其表現(xiàn)的幾種形式，由于統(tǒng)計(jì)系數(shù)的不同及參數(shù)代碼的不同，基于本發(fā)明所描述之華發(fā)林安全使用劑量評(píng)估預(yù)測(cè)模型方法將有多種不同的表現(xiàn)形式。實(shí)施例1:確定患者的年齡和體重進(jìn)行華發(fā)林藥物安全使用劑量的預(yù)測(cè)評(píng)估。該模型為最簡(jiǎn)約模式，除相關(guān)環(huán)境因素外，僅基于體重及年齡兩種參數(shù)的數(shù)據(jù)，對(duì)中國(guó)漢族患者服用藥物華發(fā)林的安全使用劑量進(jìn)行計(jì)算。該回歸方程為D=(2.375±0.753)+(0.024±0.010)xBW—(0.018±0.008)xAge(/<0.001)。實(shí)施例2:確定患者的年齡和體重，以及VKORC1基因的rs9934438位點(diǎn)的基因型檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行華發(fā)林藥物安全使用劑量的預(yù)測(cè)評(píng)估。該模型除相關(guān)環(huán)境因素、體重及年齡外，加上了對(duì)VK0RC1基因的rs9934438位點(diǎn)的基因型檢測(cè)數(shù)據(jù)，對(duì)中國(guó)漢族患者服用藥物華發(fā)林的安全使用劑量進(jìn)行計(jì)算。該回歸方程為D=(2.187±0.63》+(0.026±0.009)xBW—(0.022±0.006)xAge+(2.010±0.228)x(VKORC1—rs9934438:TT=0;TC=1;C02)(pO.OOl)。實(shí)施例3:確定患者的年齡和體重，以及CYP2C9基因的rsl057910和rs9332127位點(diǎn)的基因型檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行華發(fā)林藥物安全使用劑量的預(yù)測(cè)評(píng)估。該模型除相關(guān)環(huán)境因素、體重及年齡外，加上了對(duì)CYP2C9基因的rsl057910和rs9332127位點(diǎn)的基因型檢測(cè)數(shù)據(jù)，對(duì)中國(guó)漢族患者服用藥物華發(fā)林的安全使用劑量進(jìn)行計(jì)算。該回歸方程為D=(2.250土0.735)+(0.025±0.010)xBW—(0.013±0.007)xAge—(0.930±0.341)x(CYP2C9—rsl057910:AA=0;AC=1;CC=2)-(0.765±0.376)x(CYP2C9—rs9332127:GG=0;GOl;CC=2)(pO細(xì))。實(shí)施例4:確定患者的年齡和體重，以及VKORC1基因的rs9934438位點(diǎn)、CYP2C9基因的rsl057910和rs9332127位點(diǎn)的基因型檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行華發(fā)林藥物安全使用劑量的預(yù)測(cè)評(píng)估。該模型除相關(guān)環(huán)境因素、體重及年齡外，加上了對(duì)VK0RC1基因的rs9934438位點(diǎn)以及CYP2C9基因的rsl057910和rs9332127位點(diǎn)的基因型檢測(cè)數(shù)據(jù)，對(duì)中國(guó)漢族患者服用藥物華發(fā)林的安全使用劑量進(jìn)行計(jì)算。該回歸方程為D=(2.026±0.598)+(0.028±0.008)xBW_(0.017±0.006)xAge+(2.114±0.216)x(VK0RC1—rs9934438:TT=0;TC=1;CC=2)-(1.172±0.278)x(CYP2C9一rsl057910:AA=0;AC=1;CC=2)-(0.866±0.305)x(CYP2C9—rs9332127:GG=0;GC=1;CC=2)(;O.OOl)。實(shí)施例5:確定患者的年齡和體重，以及VKORC1基因的rs9934438位點(diǎn)、CYP2C9基因的rsl057910和rs9332127位點(diǎn)、EPHX1基因的rs4653436位點(diǎn)的基因型檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行華發(fā)林藥物安全使用劑量的預(yù)測(cè)評(píng)估。該模型除相關(guān)環(huán)境因素、體重及年齡外，加上了對(duì)VK0RC1基因的rs9934438位點(diǎn)、CYP2C9基因的rsl057910和rs9332127位點(diǎn)、EPHX1基因的rs4653436位點(diǎn)的基因型檢測(cè)數(shù)據(jù)，對(duì)中國(guó)漢族患者服用藥物華發(fā)林的安全使用劑量進(jìn)行計(jì)算。該多元回歸方程為D=(2.120±0.604)+(0.027±0.008)xBW—(0.017±0.006)xAge+(2.114±0.216)x(VKORC1—rs9934438:TT=0;TC=1;C02)-(1.172±0.278)x(CYP2C9一rs1057910:AA=0;AC=1;CC=2)—(0.866±0.305)x(CYP2C9—rs9332127:GG=0;GC=1;CC喝+(0.156±0.140)x(EPHXl—rs4653436:GG-0;AG=1;AA=2)(p=0.005)。表1是在中國(guó)漢族人種中VKORCl基因的rs9934438位點(diǎn)、CYP2C9基因的rsl057910和rs9332127位點(diǎn)、EPHX1基因的rs4653436位點(diǎn)的等位基因型數(shù)據(jù)。SNP(基因)等位基因No.(%)基因型No.(%)rs9934438989T1810(91.51)TT832(84.13)(VK0RC1)C168(8.49)TC146(14.76)CC11(1.11)1057910(*3)957A1827(95.45)AA870(90.91)(CYP2C9)C87(4.55)AC87(9.09)rs9332127995G1900(95.48)GG907(91.16)(CYP2C9)C90(4.52)GC86(8.64)CC2(0.20)rs4653436992G1538(77.52)GG588(59.10)(EPHX1)A446(22.48)GA362(36.38)AA42(4.22)表2是在中國(guó)漢族人種中各種影響因子包括體重、年齡、VKORC1基因的rs9934438位點(diǎn)、CYP2C9基因的rs1057910和rs9332127位點(diǎn)、EPHX1基因的rs4653436位點(diǎn)等分別與華發(fā)林藥物劑量之間的偏相關(guān)系數(shù)(PartialCorrelation)。影響因子基因偏相關(guān)系數(shù)尸-值<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表3是基于各種影響因子包括體重、年齡、VK0RC1基因的rs9934438位點(diǎn)、CYP2C9基因的rsl057910和rs9332127位點(diǎn)、EPHX1基因的rs4653436位點(diǎn)之等位基因型與華發(fā)林安全使用劑量之間相關(guān)性多元線形回歸分析得出的五種示例性模型研究數(shù)據(jù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>序列表<110>李文正纟內(nèi)米研究院(MochtarRiadyInstituteforNanotechnology)<120〉利用相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性分析預(yù)測(cè)中國(guó)漢族患者的華發(fā)林使用劑量<130>CPCH0860428<160>12<210>1<211〉577<212>DNA<213>人工序列<220><223>人類VKORCl基因第一個(gè)內(nèi)含子的一部分<400>1GCAAAACCGAGTGAACCGTTATACCAGCCTTGCCATTTTAAGAATTACTT50AAGGGCCGGGCGCGGTGGCCCACTCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGC100CGAGGCGGATGGATCACTTGAAGTCAGGAGTTGACCAGCCTGGCCAACAT150GGTGAAAGCCTGTCTCTACCAAAAATAGAAAMTTAATCGGGCGCTATGG200CGGGTGCCTTAATCCCAGCTACTCGGGGGGGCTAAGGCAGGAGAATCGCT250TGAACCCGGGAGGCGGAGGTTTCAGTGAGCCGAGATCGCGCCACTGCACT300CCAGCCTGGGCCAGAGTGAGACTCCGTCTCAMAAAAAMAMAAAAAAA350AAAAAAAGAGACTTACTTAAGGTCTAAGATGMAAGCAGGGCCTACGGAG400TAGCCACGTCCGGGCCTGGTCTGGGGAGAGGGGAGGATAGGGTCAGTGAC450ATGGAATCCTGACGTGGCCAAAGGTGCCCGGTGCCAGGAGATCATCGACC500CTTGGACTAGGATGGGAGGTCGGGGAACAGAGGATAGCCCAGGTGGCTTC550TTGGAAATCACCTTTCTCGGGCAGGGT577<210〉2<211>25<212>薩<213〉人工序列<220><223〉引物<400>2GCAAAACCGAGTGAACCGTTATACC25<210〉3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223〉引物<400〉3ACCCTGCCCGAGAAAGGTGAT21<210>4<211>608<212〉DNA<213>人工序列<220><223>人類CYP2C9基因的一部分<400>4GTAAGGACTTACCCATGCCCCTTTGTTATTGACTTCTCTTCCTTCTTTCATTTCTTCCTGTTTTCTCCACTTATATGTGTACAGATTTTTAGTTACACATTTGTGCATCTGTAACCATCCCTTCCAGCACTATAATTTAAATTTATAATGTTCATATACCCCTGAATTGCTACAACAAATCATCAGTTTTTACTTGTGTCTTATCAGCTACGTGTGATTGGCAGAAACCGGAGCCCCTGCGCCCTACACAGATGCTGTGGTGCACGAGGTTCCCCACCAGCCTGCCCCATGCAGTGACCTTATCTCATTCCCAAGGTAAGTTTGTTTCTCTTCGAAGTCCCCAAATTCATAGTATCATTTGGTGAGAGTGTTTTCTGGTTGTTTTGTG50TCTTCCTTTATTGAAGAGAA100CTTAATATCTGGTTTATGGC150TCTCTTTAAGTTTGCATATA200ATGTTTGGATACCTTCATGA250GTGCCATTTTTCTCCTTTTC300AAGTCCAGGAAGAGATTGAA350ATGCAAGACAGGAGCCACAT400CCAGAGATACATTGACCTTC450GTGACATTMATTCAGAAAC500CTACACTGCAACTCCATGTT550TTAAACCTCTACCATCACCG600608<210〉5<211>25<212〉麗<213>人工序列<220><223>引物<400〉5GTAAGGACTTACCCATGCCCCTTTG25<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><220><223〉引物<400〉9ATGGAGCAGATCACATTGCAGGGAG25<210>10<211>208<212>DNA<213>人工序列<220><223〉人類EPHX1基因5'非翻譯區(qū)上游基因組DNA的一部分<400>10GTACCTGGAAACTCTCCAGATGTTTATGCAGAACAACAGCCTTGCTCTGA50TTTTTTACACAATATAATTTATTCTAAAGAGCACACTATACCCATTCTTT100TGCCCCGTAAACCTTTCMTGGCTTTTAGCCMAAGCAGTGMAATCTGT150CTAAATTTTGCCCTGCTGAGTTGGACTCTGATGCATTTGTTTCTACACTG200CCCATATG208<210>11<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400〉11GTACCTGGAAACTCTCCAGATGTTT25<210>12<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400〉12CATATGGGCAGTGTAGAAACAAATG2權(quán)利要求1.一種獲取對(duì)確定中國(guó)漢族患者華發(fā)林使用劑量有用的分?jǐn)?shù)的方法，包括以下步驟(1)獲取來自該患者的核酸樣品；(2)針對(duì)選自下組的一個(gè)或多個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)所述核酸樣品進(jìn)行檢測(cè)VKORC1基因的rs9934438位點(diǎn)、CYP2C9基因的rs1057910位點(diǎn)和rs9332127位點(diǎn)、EPHX1基因的rs4653436位點(diǎn)；(3)確定所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型；(4)對(duì)所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型進(jìn)行評(píng)分；其中步驟(4)中獲得的分?jǐn)?shù)對(duì)于確定該患者的華發(fā)林使用劑量有幫助。2.權(quán)利要求1的方法，其中，所述分?jǐn)?shù)與所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型的關(guān)系為對(duì)于VK0RC1基因的rs9934438位點(diǎn)的分?jǐn)?shù)COTOTT;對(duì)于CYP2C9基因的rsl057910位點(diǎn)的分?jǐn)?shù)AA〉A(chǔ)OCC;對(duì)于CYP2C9基因的rs9332127位點(diǎn)的分?jǐn)?shù)GG〉GOCC;對(duì)于EPHX1基因的rs4653436位點(diǎn)的分?jǐn)?shù)AA>AG>GG。3.權(quán)利要求2的方法，其中，所述分?jǐn)?shù)與所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型的關(guān)系為對(duì)于VKORCl基因的rs9934438位點(diǎn):TT=0,TC=1,CC=2;對(duì)于CYP2C9基因的rsl057910位點(diǎn)AA=0,AC=-1,CC=-2;對(duì)于CYP2C9基因的rs9332127位點(diǎn)GG=0，GC=-1,CC=-2;對(duì)于EPHX1基因的rs4653436位點(diǎn)GG=0,AG=1,AA=2。4.權(quán)利要求1的方法，其中，步驟(2)中所述的檢測(cè)采用PCR進(jìn)行。5.權(quán)利要求4的方法，其中，所述PCR采用選自下組的引物對(duì)或其互補(bǔ)引物對(duì)進(jìn)行對(duì)于VKORCl基因的rs9934438位點(diǎn)，SEQIDNO:2和3;對(duì)于CYP2C9基因的rsl057910位點(diǎn),SEQIDNO:5和6;對(duì)于CYP2C9基因的rs9332127位點(diǎn)，SEQIDNO:8和9;對(duì)于EPHX1基因的rs4653436位點(diǎn)，SEQIDNO:ll和12。6.權(quán)利要求1的方法，其中，步驟(2)中還包括檢測(cè)與所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)同屬一個(gè)單倍體型或呈現(xiàn)連鎖不平衡的遺傳才示i己^f立,泉。7.權(quán)利要求6的方法，其中，所述遺傳標(biāo)記位點(diǎn)包括與VKORCl基因的rs9934438位點(diǎn)有關(guān)聯(lián)的rs9923231、rs2359612及rs7294位點(diǎn)。8.權(quán)利要求1的方法，其中，步驟(2)中所述的檢測(cè)通過限制性內(nèi)切酶消化或者通過DNA測(cè)序進(jìn)行。9.一種獲取對(duì)確定中國(guó)漢族患者華發(fā)林使用劑量有用的參考值的方法，包括以下步驟(1)獲取來自該患者的核酸樣品；(2)針對(duì)選自下組的一個(gè)或多個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)所述核酸樣品進(jìn)行檢測(cè)VK0RC1基因的rs9934438位點(diǎn)、CYP2C9基因的rs1057910位點(diǎn)和rs9332127位點(diǎn)、EPHX1基因的rs4653436位點(diǎn)；(3)確定所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型；(4)對(duì)所述單核普酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型進(jìn)行評(píng)分；(5)獲取該患者的年齡和體重；(6)根據(jù)選自下組的方程式計(jì)算參考值D:D=(2.187±0.635)+(0.026±0.009)xBW—(0.022±0.006)xAge+(2.010±0.228)x(VKORCl—rs9934438:TT=0;TC=1;CC=2),D=(2.250±0.735)+(0.025±0.010)xBW—(0.013±0.007)xAge—(0.930±0.341)x(CYP2C9—rsl057910:AA=0;AC=1;CC=2)—(0.765±0.376)x(CYP2C9—rs9332127:GG=0;GC=1;CC=2)，D=(2.026±0.598)+(0.028±0.008)xBW一(0.017±0.006)xAge+(2.114土0.216)x(VKORCl一rs9934438:TT=0;TC=1;CC=2)—(1.172±0.278)x(CYP2C9一rsl05791(hAA=0;AC=1;CC=2)—(0.866±0.305)x(CYP2C9—rs9332127:GG=0;GC=1;CC=2)，D=(2.120±0.604)+(0.027±0.008)xBW一(0.017土0.006)xAge+(2.114±0.216)x(VKORCl—rs9934438:TT=0;TC=1;CC=2)—(1.172±0.278)x(CYP2C9—rsl057910:AA=0;AC-1;CC=2)—(0.866±0.305)x(CYP2C9—rs9332127:GG=0;GC=1;CC=2)+(0.156±0.140)x(EPHX1—rs4653436:GG=0;AG=1;AA=2),其中，BW代表患者體重，Age代表患者年齡；其中參考值D對(duì)于確定該患者的華發(fā)林使用劑量有幫助。10.—種生物芯片，其特征在于，包括用于針對(duì)選自下組的一個(gè)或多個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)來自中國(guó)漢族患者的核酸樣品進(jìn)行檢測(cè)的探針VKORCl基因的rs9934438位點(diǎn)、CYP2C9基因的rsl057910位點(diǎn)和rs9332127位點(diǎn)、EPHX1基因的rs4653436位點(diǎn)。11.權(quán)利要求10的生物芯片，其中還包括用于檢測(cè)與所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)同屬一個(gè)單倍體型或呈現(xiàn)連鎖不平衡的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)的4笨針。12.權(quán)利要求11的生物芯片，其中所述遺傳標(biāo)記位點(diǎn)包括與VKORCl基因的rs9934438位點(diǎn)有關(guān)聯(lián)的rs9923231、rs2359612及rs7294位點(diǎn)。13.權(quán)利要求9的生物芯片，其中所迷探針選自由SEQIDNO:1、4、7、IO及其互補(bǔ)序列構(gòu)成的組。全文摘要本發(fā)明涉及利用單核苷酸多態(tài)性分析輔助確定中國(guó)漢族患者華發(fā)林使用劑量的方法和生物芯片。更具體地說，本發(fā)明提供了一種獲取對(duì)確定中國(guó)漢族患者華發(fā)林使用劑量有用的分?jǐn)?shù)的方法，包括以下步驟(1)獲取來自該患者的核酸樣品；(2)針對(duì)選自下組的一個(gè)或多個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)所述核酸樣品進(jìn)行檢測(cè)VKORC1基因的rs9934438位點(diǎn)、CYP2C9基因的rs1057910位點(diǎn)和rs9332127位點(diǎn)、EPHX1基因的rs4653436位點(diǎn)；(3)確定所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型；(4)對(duì)所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型進(jìn)行評(píng)分；其中步驟(4)中獲得的分?jǐn)?shù)對(duì)于確定該患者的華發(fā)林使用劑量有幫助。本發(fā)明還提供了用于上述方法的生物芯片。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101545005SQ200810084249公開日2009年9月30日申請(qǐng)日期2008年3月27日優(yōu)先權(quán)日2008年3月27日發(fā)明者吳汪黔生,戴書文,李紅蕾,王廷亮申請(qǐng)人:李文正納米研究院