專利名稱：動(dòng)物源草酸青霉發(fā)酵產(chǎn)飼料級(jí)果膠酶工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動(dòng)物源草酸青霉菌(尸emc朋ww Currie &Thom)發(fā)酵產(chǎn)詞料級(jí)
果膠酶工藝。
背景技術(shù)：
隨著飼料工業(yè)和畜牧業(yè)的迅猛發(fā)展，飼料資源短缺的問題日益嚴(yán)重，已成為影響我國(guó)飼 料工業(yè)和畜牧業(yè)進(jìn)一步發(fā)展的主要限制因素。2007年8月份全國(guó)玉米平均價(jià)格為1.66元/公 斤，比去年同期上漲16.1%;豆粕平均價(jià)格為2.83元/公斤，同比上漲13.7%;苜蓿干草比去 年同期增長(zhǎng)了20%以上。據(jù)預(yù)測(cè)，2010年，中國(guó)能量飼料將短缺22 38%，蛋白飼料將短缺 40%。解決詞料資源缺乏的兩個(gè)主要途徑為提高現(xiàn)有飼料資源的利用率和開發(fā)新的詞料資 源。運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)將酶制劑應(yīng)用于飼料中是當(dāng)前世界飼料工業(yè)重點(diǎn)研究和發(fā)展的方向， 是提高飼料轉(zhuǎn)化率、擴(kuò)大飼料資源行之有效的措施。目前大量的試驗(yàn)研究表明，酶制劑的合 理應(yīng)用可擴(kuò)大詞料資源的應(yīng)用范圍，而且可有效提高現(xiàn)有詞料資源的利用效率。
果膠(Pectin)是植物組織中與纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)等結(jié)合的不溶于水的 一類物質(zhì)，主要是由D-半乳糖醛酸以a-l,4糖苷鍵連接形成的直鏈狀的聚合物，是非淀粉多 糖(NSP)的成分之一。果膠廣泛存在于高等植物中，沉積于初生細(xì)胞壁和細(xì)胞間層，在初生壁 中與不同含量的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的微纖絲以及某些伸展蛋白(extensin)相互交聯(lián)， 使各種細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)堅(jiān)硬，表現(xiàn)出固有的形態(tài)； 一般以豆科植物中果膠含量較多，如苜蓿中 含量達(dá)5% 10%,豆粕果膠含量10% 14%,菜籽粕果膠含量11.5%。在動(dòng)物的蛋白飼料 中，果膠作為豆粕中含量最高的抗?fàn)I養(yǎng)因子，目前并沒有受到研究者的重視。
果膠酶(Pectinase,PE)是最早在人們生活中得到應(yīng)用的酶類之一，商業(yè)應(yīng)用最早見于1930 年，用來制備酒水和果汁。果膠酶是一個(gè)多酶復(fù)合體系，能夠水解果膠中以a-l,4糖苷鍵結(jié)合 的半乳糖醛基，產(chǎn)生還原糖，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率。
目前，有關(guān)果膠酶產(chǎn)生菌主要來源于土壤和腐敗植物，有關(guān)動(dòng)物源的菌株來源生產(chǎn)飼料 級(jí)果膠酶工藝國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道。
目前，飼用酶領(lǐng)域的研究多集中在蛋白酶和淀粉酶上，對(duì)飼用果膠酶并沒有進(jìn)行深入的 研究。另外，生產(chǎn)上多數(shù)采用復(fù)合菌發(fā)酵獲得粗酶制劑，其產(chǎn)品組分和比例不夠清楚，各種 酶的功能也不夠明確，導(dǎo)致難以科學(xué)、合理的應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)。經(jīng)査新，我國(guó)與本項(xiàng)研究相 關(guān)的報(bào)道尚未發(fā)現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供組分確定的果膠酶產(chǎn)品發(fā)酵工藝，該產(chǎn)品適宜在動(dòng)物日糧中添加， 并能夠提高日糧中營(yíng)養(yǎng)成分利用率。
本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的 使用的微生物
用來發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的微生物是一種新的微生物，屬于真菌的青霉屬，草酸青霉菌種
(尸em'c朋wm ojca//cw j Cuirie & Thom)。名稱為F67，簡(jiǎn)稱F67菌。它是果膠酶高產(chǎn)菌株。F67來自鵝盲腸內(nèi)，經(jīng)動(dòng)物毒力試驗(yàn)表明，該菌株安全無毒性。已于2004年11月通過中國(guó)科學(xué) 院微生物研究所的鑒定，保藏日期2007年11月23日；微生物保藏號(hào)為CGMCC NO. 2260; 分類命名草酸青霉0^"/"7/!'脂0辺// /附入生物材料樣品保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理
委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；郵政編碼 100101。
F67菌株具有以下性質(zhì)
菌落在查氏培養(yǎng)基上，25°C、 7d直徑4lmm-44咖，質(zhì)地絲絨狀，平坦，深綠色，邊緣白 綠色，整齊；分生孢子結(jié)構(gòu)較多，易脫落；反面淺綠色。菌落在查氏酵母膏瓊脂培養(yǎng)基上生 長(zhǎng)迅速，25°C、 7d直徑59mm-60mm，質(zhì)地絲絨狀，平坦，分生孢子結(jié)構(gòu)大量，深灰綠色。菌 落在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上，25°C、 7d直徑54mm-60mm,質(zhì)地絲絨狀，平坦，分生孢子結(jié)構(gòu)大 量，灰綠色;反面呈不同程度的黃褐色。分生孢子梗發(fā)于基質(zhì)菌絲，壁光滑，直徑3. 8 mm-5. 4Wn; 帚狀枝雙輪生，?；枯?個(gè)-4個(gè)，近柱狀，19-24X3. 7-4. ORii;瓶梗每輪4個(gè)-8個(gè)，披針 形，10.8-14.6X2.4-3. 8陶;分生孢子灰綠色，橢圓形，5. 5-6. 1X2. 8-3. 4Mm，壁光滑；分 生孢子鏈長(zhǎng)圓柱形。
本發(fā)明所述F67菌株培養(yǎng)基的制備
固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基麩皮15g，葡萄糖0.9g， (NH4)2S041.2g， KH2PO40.075g，水15ml， 培養(yǎng)基起始pH為4.5， 250rrd三角瓶分裝，O.lMPa滅菌25 min。 培養(yǎng)的F67菌株，貯存于-2(TC冰箱中。
斜面菌種一活化一接種1環(huán)至5ml液態(tài)培養(yǎng)基一28°C， 150rpm搖床培養(yǎng)24h—以8%的接 種量接種至三角瓶一將F67按8%的接種量接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵時(shí)間為48h，料水比為 1:1，發(fā)酵溫度為28'C。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是
1、 用來發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的微生物草酸青霉F67分離于鵝的盲腸內(nèi)，生產(chǎn)的果膠酶酶活力大。 總酶活力達(dá)10123.22 U'g人其中聚半乳糖醛酸酶活力達(dá)5101 3U'g—1，果膠酯酶活力達(dá)6986.52 U-g"，果膠裂解酶達(dá)0.56U'g"。
2、 發(fā)酵所產(chǎn)的果膠酶組分固定，保存期長(zhǎng)，耐貯性好，各組分百分含量穩(wěn)定。其中聚半 乳糖醛酸酶活力為總酶活力50%，果膠酯酶為總酶活力的69%，果膠裂解酶為總酶活力的 0.005%。結(jié)果詳見表1和表2。
表l貯存時(shí)間對(duì)果膠酶總酶活力的影響(U，g-1)
酶活力
時(shí)間(月)
0
6
9
低溫(0 4°C) 常溫(15 30 °C)
固態(tài) 固態(tài)
10668.39± 89.96a
10668.39± 89.96a
10336.77± 123.35a
10112.32± 332.64a
10242.35± 289.65a
8998.69± 123.89b
10225.88± 221.03a
6562.39± 97.44e
_表2 t存時(shí)間對(duì)果膠酶不同組分酶活力的影響(Uf1) _
聚半乳糖醛酸酶 時(shí)間(月)~
_Q_^_^_9
5101.23±"~4999.21±4989.26± 4889.64± 低;k(U 4 L) 2526a79.63a 89.67a 121.14a果膠酯酶
果膠裂解酶
常溫(15 30 °C) 低溫(0 4°C) 常溫(15 30 °C) 低溫(0 4 °C) 常溫(15 30 °C)
5101.23±4989.59士4302.84±3137.88±
25.26a32.54a123.89b97.44e
6986.52±6973.41±6898.98±6899.26±
98.56a102.23a98.56a77.89a
6986.52±6908.23±6206.08±5033.60±
98.56a97.79a68.77b103.23e
0.567±0.567±0.566±0.558±
0.013a0.015a0.009a0.023a
0.567±0.526±0.498±0.467±
0.013a0.004aO細(xì)b0.123c
3、 本發(fā)明應(yīng)用動(dòng)物日糧，不僅可以提高飼料利用率，降低飼料成本，而且可以緩解飼料 源短缺，達(dá)到節(jié)約飼料的效果。
4、 本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，常溫發(fā)酵，既適合于規(guī)模生產(chǎn)又可以分散加工，便于推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l
果膠酶制劑對(duì)鵝日糧消化率的影響
選取24月齡的健康鵝24只，隨機(jī)分為4個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)。第l組為對(duì)照組(基礎(chǔ) 日糧)，其余3組為試驗(yàn)組。第2組，第3組，第4組果膠酶添加量分別為0.1%、 0.2%、 0.3%。 采用全收糞法進(jìn)行體內(nèi)消化代謝試驗(yàn)，檢測(cè)飼料和糞便中的粗蛋白(CP)、氨基酸(AA)、 CF、 氨態(tài)氮(NH3-N)、鈣(Ca)和磷(P)等多種營(yíng)養(yǎng)成分及糞便微生物數(shù)量，確定其表觀消化率， 研究果膠酶對(duì)鵝玉米一豆粕日糧消化率的影響。
體內(nèi)消化代謝試驗(yàn)結(jié)果表明，在代謝能(ME)和CP等營(yíng)養(yǎng)成分?jǐn)z入量一致的條件下，各 試驗(yàn)組養(yǎng)分的消化率顯著高于對(duì)照組(尸<0.05或尸<0.01)。與對(duì)照組相比，CF的消化率提 高了 5.78% 17.04%， NDF提高了 9.80% 12. 15%， ADF提高了 4. 53% 13. 95%;凈蛋白利用 率(NPU)提高了 0. 43% 9. 53%，糞便中氨態(tài)氮濃度比對(duì)照組降低5. 83mg/kg 26. 37 mg/kg; 除甘氨酸(GLY)偏低之外，各種氨基酸表觀消化率(AAAD)均較高，試驗(yàn)組達(dá)到75.92% 94. 27%，而對(duì)照組為72. 19% 90. 54%; Ca、 P的表觀消化率分別比對(duì)照組提高了 1. 81% 7. 04% 和5.51% 8.38%;每克糞便中乳酸桿菌、雙歧桿菌、酵母菌分別提高了 0.47~1.05、 0.17 0.63、 0.12 0.37數(shù)量級(jí)(lgn)。說明添加果膠酶制劑能夠提高鵝對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收效果 和改善腸道微生物區(qū)系。試驗(yàn)結(jié)果詳見表3。
表3各試驗(yàn)組CF， NDF， ADF消化率的比較
組別
果膠酶添加水平(％。)CF消化率(％) NDF消化率(％)
-^—
ADF消化率(％)
1
2
3
4
0
1
2
20.55±4.22c 26.33±3.33bc 37.59±2.15a 30.76±1.56b
38.74±5.35。 48.54±4.23c 55.62±5.32a 50.89±3.98b
34.03 .±3.29c 38.56±2.23c 47.98±3.53a 40.23±5.56b
注表中數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，同列數(shù)據(jù)字母相同、相鄰和相間分別表示差異不顯著(戶
〉0.05)，顯著(尸<0.05)和極顯著(/3<0.01)。
權(quán)利要求
1、從健康鵝腸道菌群中分離篩選出的一種果膠酶高產(chǎn)菌株——草酸青霉F67(Penicillium oxalicum Currie&amp;Thom)(微生物保藏號(hào)CGMCC NO.2260)用來發(fā)酵產(chǎn)飼料級(jí)果膠酶；主要工藝包括菌種的選擇與優(yōu)化、培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件的確定、載體的選擇、冷凍干燥等；其特征在于通過固態(tài)發(fā)酵，生產(chǎn)出酶活力大，保存期長(zhǎng)，耐貯性好，各組分百分含量穩(wěn)定的酶制劑。生產(chǎn)的果膠酶制劑總酶活力達(dá)10123.22U·g-1；聚半乳糖醛酸酶活力5101.23U·g-1，為總酶活力的50.39％；果膠酯酶活力6986.52U·g-1，為總酶活力的69.01％；果膠裂解酶0.56U·g-1，為總酶活力的0.005％。將果膠酶制劑添加到動(dòng)物日糧，結(jié)果粗纖維(CF)的消化率提高了17.04％，中性洗滌纖維(NDF)提高了12.15％，酸性洗滌纖維(ADF)提高了13.95％；凈蛋白利用率(NPU)提高了9.53％；Ca、P的表觀消化率分別比對(duì)照組提高了7.04％和8.38％。
2、 根據(jù)權(quán)利要求書1所述的草酸青霉F67產(chǎn)飼料級(jí)果膠酶工藝，其特征在于菌種草酸青 霉F67源于動(dòng)物體內(nèi)，較土壤、腐爛物以及糞便等其它來源的菌株所產(chǎn)的果膠酶能更好的適 應(yīng)動(dòng)物腸道環(huán)境條件，使用安全，是理想的果膠酶生產(chǎn)菌株。
3、 根據(jù)權(quán)利要求書1所述的草酸青霉F67產(chǎn)果膠酶工藝，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基中最佳 氮源為硫酸銨，其適宜添加量分別為8。/。。
4、 根據(jù)權(quán)利要求書1所述的草酸青霉F67產(chǎn)果膠酶工藝，其特征在于在固態(tài)發(fā)酵過程中， 用麩皮作為底物，以調(diào)節(jié)發(fā)酵底物的營(yíng)養(yǎng)，起到膨松劑的作用，有助于提高發(fā)酵效果。
5、 根據(jù)權(quán)利要求書1所述的草酸青霉F67產(chǎn)果膠酶工藝，其特征在于最佳發(fā)酵條件為發(fā) 酵時(shí)間48h，發(fā)酵溫度28'C。最佳接種量為8%，最佳初始pH為4.5。產(chǎn)品中聚半乳糖醛酸酶 活力5101 .23U'g";果膠酯酶活力6986.52 U'g'1;果膠裂解酶0.56 U'g"。
6、 根據(jù)權(quán)利要求書1所述的草酸青霉F67產(chǎn)果膠酶工藝，其特征在于果膠酶制劑可添加 到動(dòng)物日糧中，提高動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率。
7、 根據(jù)權(quán)利要求書1所述的草酸青霉F67產(chǎn)果膠酶工藝，其特征在于發(fā)酵產(chǎn)生的果膠酶 制劑耐貯性好，在0 4'C冷藏9個(gè)月，酶活力不受影響。在常溫15 3(TC保存時(shí)，3月之內(nèi) 酶活不受影響；到6個(gè)月時(shí)，固態(tài)酶制劑仍保留有原始活力的84.33%，到9個(gè)月時(shí)為61.51%， 達(dá)到國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。
全文摘要
一種以鵝體內(nèi)分離所得到的草酸青霉發(fā)酵產(chǎn)飼料級(jí)果膠酶工藝，屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域。通過固態(tài)發(fā)酵，生產(chǎn)出酶活力大，保存期長(zhǎng)，耐貯性好，各組分百分含量穩(wěn)定和純度高的酶制劑。生產(chǎn)的果膠酶制劑總酶活力達(dá)10123.22U·g^-1；聚半乳糖醛酸酶活力5101.23U·g^-1，為總酶活力的50％；果膠酯酶活力6986.52U·g^-1，為總酶活力的69％；果膠裂解酶0.56U·g^-1，為總酶活力的0.005％。將果膠酶制劑在動(dòng)物日糧添加0.2％時(shí)，粗纖維(CF)的消化率提高了17.04％，中性洗滌纖維(NDF)提高了12.15％，酸性洗滌纖維(ADF)提高了13.95％；凈蛋白利用率(NPU)提高了9.53％；Ca、P的表觀消化率分別比對(duì)照組提高了7.04％和8.38％；該工藝的發(fā)明，解決了生產(chǎn)中復(fù)合菌發(fā)酵飼料用酶制劑其酶組分及含量不確定的關(guān)鍵生產(chǎn)技術(shù)問題，為果膠酶不同組分酶制劑的合理配伍及應(yīng)用提供了新技術(shù)。
文檔編號(hào)C12N1/14GK101565695SQ200810088248
公開日2009年10月28日 申請(qǐng)日期2008年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月26日
發(fā)明者王寶維 申請(qǐng)人:王寶維;荊麗珍;張名愛;葛文華;龍芳羽