專利名稱：微流體溫度驅(qū)動的閥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的主題是一種利用核酸擴增分析液體樣品的儀器中使用的 微流體器件、 一種利用核酸擴增分析液體樣品的儀器、 一種分析液體樣 品的方法以及 一 種擴增液體中的核酸的方法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明對保健，以及生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)研究領(lǐng)域特別有用，尤其在 核酸分析、基因定量和基因分型，這類需要對所含組分實施可靠樣品分 析的領(lǐng)域。擴增核酸用的方法和器件是技術(shù)上熟知的。
一種利用包括變性和擴增步驟的反應(yīng)循環(huán)的方法是聚合酶鏈反應(yīng)
(PCR)。該技術(shù)給核酸處理帶來革命性變化，特別是核酸分析，因為它 提供一種將特定序列的核酸的數(shù)量由微不足道增加到可檢測數(shù)量的工 具。PCR描述在，例如，EP 0201184和EP 0200362中。 一種利用加熱 和冷卻某一延長的金屬塊以控制方式對管子中的樣品實施熱循環(huán)的儀 器公開在例如EP 0236069中。
最近，已研發(fā)出改進和更強大的PCR技術(shù)。定量實時PCR是一種 用于同時定量和擴增給定DNA分子特定部分的實驗室技術(shù)。它被用來 確定某一特定序列是否存在于樣品中以及，如果存在，可對樣品中復(fù)制 的份數(shù)進行定量。2種常用定量方法是采用嵌入了雙鏈DNA的熒光染料 以及，當與互補DNA雜交時，發(fā)熒光的改性DNA低聚核苷探針。此類 方法描述在，例如，EP 0512334中。
通常，聚合酶鏈反應(yīng)在特殊反應(yīng)容器中實施。為提供魯棒、可靠和 高度準確的核酸擴增結(jié)果，重要的是避免反應(yīng)區(qū)的污染。PCR能使單個 分子擴增十億倍。因此，哪怕很少量污染物也可能被擴增并導(dǎo)致假陽性
結(jié)果。此種污染物常常是來自以前的PCR擴增的產(chǎn)物，被稱作帶入的污 染。除了預(yù)防反應(yīng)區(qū)灌注期間帶入的污染之外，特別重要的是，在反應(yīng) 進行期間將反應(yīng)區(qū)密封，以防止污染物。這在1個以上反應(yīng)區(qū)使用共同 的流體通道同時灌注的場合特別難以辦到。此類場合常常采用帶有多個 反應(yīng)區(qū)的小型化器件以達到較高處理量，具有減小的反應(yīng)體積，這導(dǎo)致對減少污染危險的技術(shù)要求的進一步提高。
微流體學(xué)是設(shè)計、制造和制定與"納-或皮升"范圍流體體積打交道的 器件和方法的科學(xué)。微流體硬件要求不同于宏觀尺度硬件的構(gòu)造和式 樣。通常不可能將傳統(tǒng)器件按比例縮小，然后預(yù)期它們在微流體場合同 樣能行，因為系統(tǒng)行為有了巨大改變。毛細管作用改變了流體通過微尺 度-直徑管子的規(guī)律，它將與宏觀尺度通道截然不同。另外，涉及到諸多 未知因素，尤其涉及微尺度熱量傳遞和質(zhì)量傳遞。微流體體系在保健， 例如，血細胞分離、生化化驗、化學(xué)合成、基因分析、藥物篩選和電色
譜法等方面具有多種多樣和廣泛潛在的應(yīng)用。
為解決污染問題，已研發(fā)出減少當進行反應(yīng)時的交叉污染危險的、 允許將液體樣品灌注并維持在反應(yīng)區(qū)中及其以外的特定微流體閥。這 里，該閥將每個反應(yīng)腔逐一氣密密封。這一點很重要，特別是在對1或 多個樣品就幾個截然不同的參數(shù)接受試驗的陣列格式中。由于交叉反應(yīng) 可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果，故主要的任務(wù)是避免此類交叉反應(yīng)。于是，在許 多領(lǐng)域，閥被應(yīng)用在陣列器件中以防止反應(yīng)腔特定試劑的帶入。
技術(shù)上已知有幾種類型閥，其中兩種主要類型可能是著名的，通常
被稱作一次性關(guān)閉閥(once-close valve)和啟/閉閥(ON/OFF valve)。 一次性 關(guān)閉閥在基態(tài)(ground state)處于敞開并可能關(guān)閉僅僅一次。關(guān)閉后，該 閥將可能被被再打開。啟/閉型閥可打開和關(guān)閉數(shù)次，通常借助外部執(zhí)行 機構(gòu)。
US 20050072946公開一種采用多層軟光刻(lithography)的拔i流體 閥。此種閥的特征在于其恒定厚度的彈性體膜部分，從而允許該膜沿其
整個寬度對外加壓力產(chǎn)生相近的反抗力。此種用可撓曲膜制造的啟/閉閥 可具有極低致動壓力，因此可用于實現(xiàn)主動(active)功能，例如，在集成 微流體芯片中的泵和混合機。然而，此類帶有一體化軟膜的器件是采用 雙組分生產(chǎn)技術(shù)制造的。第一組分一般是較硬聚合物材料，例如，聚丙 烯(PP)或聚甲基丙烯酸曱酯(PMMA),而第二組分是軟材料，例如，熱 塑性彈性體(TPE)。那些雙組分技術(shù)是復(fù)雜且成本高的，況且生產(chǎn)1個 器件的時間，與單組分技術(shù)相比，大大增加。另外，該彈性體閥必須是 三維構(gòu)成的。該器件不得不建造在幾層上，每層具有特定功能(例如，流 體層、開關(guān)層等)。用于閥的致動層在幾何上位于流體層上方。這樣的多 層工藝進一步增加了商品的成本和器件的復(fù)雜性。利用Peltier(珀耳帖)-致動的微型閥(Richard P. Welle和Brian S. Hardy,第24屆熱電學(xué)國際會議(24th International Conference on Thermoelectrics (ICT))， 2005， pp. 343-346)抑制流體排出物進出反應(yīng)區(qū)的 閥在技術(shù)上是公知的。Peltier元件放在靠近流體通道網(wǎng)或流體通道網(wǎng)下 方。通過利用Peltier元件冷卻進出反應(yīng)腔的通道中的流體使流體凍結(jié)， 從而導(dǎo)致通道內(nèi)形成水塞。該冰塞堵住通道，于是擴散受阻。當把Peltier 元件關(guān)掉時，冰塞融化，于是通道重新打開。這樣一來，液體就可流過 通道，同時擴散可再次發(fā)生了。此類型閥也劃歸啟/閉閥一類，因為可能 要實施幾個凍融循環(huán)。然而，此種Peltier-致動的閥具有許多缺點。每個 閥在非?？拷牟课痪托枰?個Peltier元件。該Peltier元件是尺寸有 限的，因此，該閥不能用于具有高度密集反應(yīng)腔和通道的微流體器件。 另外，每個Peltier元件必須能電子存取和調(diào)節(jié)，從而要求容納布線和復(fù) 雜控制器的空間。不僅如此，此種閥也不能用于熱循環(huán)領(lǐng)域，因為在關(guān) 閉狀態(tài)，通道中的液體被凍結(jié)在非?？拷磻?yīng)腔的部位，而這里卻進行 著50 90。C之間溫度的熱循環(huán)。閥與反應(yīng)腔之間的溫度梯度勢必既影響 凍結(jié)也影響加熱過程，而這兩個過程都需要較多能量。這種作用將限制 快速熱循環(huán)的速度和效率。再者，冷凍也導(dǎo)致液體體積的改變，從而在 器件及其材料中感應(yīng)出應(yīng)力。
利用毛細管與所述毛細管進入反應(yīng)區(qū)的開口之間潤濕度差異的、基 于毛細管的被動閥被稱作毛細管驅(qū)動的截止閥或毛細管破裂閥，其描述 在Duffy等人的《分析化學(xué)》(Analytical Chemistry, 1999， 71， 4669 ~ 4678) 中。此種被動閥基于潤濕能。將彎月面從細毛細管推入到較大腔內(nèi)所需 要的力被用作閥。該壓力——被定義為單位面積的力——通常明顯低于 1.4 bar,其是熱循環(huán)期間被關(guān)閉的PCR反應(yīng)腔中產(chǎn)生的壓力。因此，被 動閥不足以強到耐受PCR反應(yīng)的加熱所產(chǎn)生的壓力。該壓力導(dǎo)致較大的 腔#/潤濕，因此該閥將在應(yīng)該關(guān)閉時卻開啟。
總之，所有上面所描述的這些閥都具有共同缺點它們不過是部分 地適應(yīng)微流體用途要求的宏觀閥的小型化而已，因此，不能滿足微流體 用途的全部需要和要求。這樣的閥的共同之處在于，需要外致動，例如， 電流、氣壓或溫度。然而，超結(jié)構(gòu)零件，例如，供應(yīng)外致動作用所需要 的管道和接線通常都非常占據(jù)空間并且是成本密集型。特別是對于集成 芯片領(lǐng)域來說，可供此類閥使用的空間僅僅是有限的。另外，尤其是在微流體芯片上的核酸分析中，攜帶閥致動的另一層的添加是不利的，因
為微流體芯片的熱質(zhì)量(thermal mass)應(yīng)盡可能小以便提供快速和高效 的傳熱，特別是當實施擴增反應(yīng)時。
另外，并非是宏觀閥小型化的微流體概念也沒有完全滿足較高通量 的微流體領(lǐng)域的要求，特別是就成本而言。此種閥的例子是用于"芯片 上的實驗室(Lab-on-a-Chip)"領(lǐng)域的自致動熱響應(yīng)水凝膠閥，正如在以下 中描述的JingWang等，Biomedical Microdevices 7:4， 313-322, 2005。此 種閥利用這樣的事實聚合物N-異丙基丙烯酰胺表現(xiàn)出感溫行為。該聚 合物材料由具有多孔結(jié)構(gòu)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成。孔隙的尺寸依賴于溫度。當此種 材料被用來起閥的作用時，灌注在微流體網(wǎng)絡(luò)腔內(nèi)的材料隨溫度之不同 允許流體流動抑或阻止其流動。但是，帶有水凝膠閥的器件制造起來既 復(fù)雜，成本又高，因為水凝膠必須經(jīng)受就地聚合或不得不被結(jié)合到薄襯 (foil)中。水凝膠材料與工藝流體直接接觸，并且由于其孔隙結(jié)構(gòu)提供巨 大的每單位體積的表面。在大多數(shù)情況中，這是不利的，因為巨大的表 面為蛋白質(zhì)、DNA或其他化學(xué)成分的吸附提供更多空間，因為那些物質(zhì) 可能根據(jù)表面化學(xué)規(guī)律結(jié)合到表面。然而，那些物質(zhì)乃是反應(yīng)腔內(nèi)需要 的，不應(yīng)被水凝膠吸附。于是，化驗/測試的表現(xiàn)就可能受到損害。
此外，另一些閥采用一種可膨脹微球，它具有包圍著氣體芯的軟組 分殼(P. Griss, H. Andersson和G. Stemme, Lab Chip, 2002， 2: 117-120, "Expandable microspheres for the handling of liquids (處理液體用的可膨 脹微球)")。溫度一旦升高，微球便膨脹，從而關(guān)閉通道。珠粒的殼在某 一提高的溫度軟化。殼軟化后，被嚢封的氣體可膨脹，于是微粒就脹大 到比其原來體積大幾倍的大小。該膨脹是不可逆的并且當溫度降低時微 球?qū)⒉恢赜肿冃?。因此，這種閥被歸為一次性關(guān)閉閥。然而，此種包含 微球的器件的生產(chǎn)非常復(fù)雜，因為必須將微球結(jié)合并在恰當?shù)奈恢么娣e 到微流體器件中。此種微球閥的制造很難，因為在制造器件期間溫度不 得不維持在低于微球膨脹點的水平。
總之，技術(shù)上公知的閥或者是宏觀閥為適應(yīng)微流體應(yīng)用所做的小型 化，因此，沒有滿足微流體領(lǐng)域的所有要求，因為需要外致動來關(guān)閉閥， 或者是微流體概念，這一概念的主要缺點在于必須采用復(fù)雜材料，從而 導(dǎo)致，當這些復(fù)雜材料表現(xiàn)出對以熱或液體的處理不穩(wěn)定時，生產(chǎn)過程 的錯綜復(fù)雜，從而導(dǎo)致微流體器件的高成本。因此，目前需要提供一種制造低成本微流體器件用的微流體閥，它不需要復(fù)雜外致動和復(fù)雜制造方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第 一 個主題是一種利用核酸擴增分析液體樣品用的儀器 中使用的微流體器件，它至少包括反應(yīng)腔，后者具有適合給所述反應(yīng)腔 灌注所述液體樣品的進口通道，和適合從所述反應(yīng)腔中排出流體的出 口，其中所述出口可在反應(yīng)腔灌注所述液體樣品后關(guān)閉，且其中所述進 口通道還包含至少一個包含死端分岔的微流體閥，所述死端分岔不具有 出口，它包含氣體并且尺寸設(shè)計為，在至少所述死端分岔加熱期間，至 少包含足以密封所迷進口通道的量的氣體，此時所迷氣體從所述死端分 岔膨脹到所迷進口通道中形成能可逆地密封所述進口通道的擴散屏障。
本發(fā)明的第二個主題是利用核酸擴增分析液體樣品的儀器，其至少
包括
-本發(fā)明的微流體器件，
-監(jiān)視核酸擴增反應(yīng)的器件，以及
-至少覆蓋所述微流體器件的所述至少 一個死端分盆的加熱器件。
本發(fā)明的第三個主題是利用核酸擴增分析液體樣品的方法，其至少 包括
-通過所述器件的進口通道向本發(fā)明微流體器件的反應(yīng)腔內(nèi)提供 液體樣品，
-利用加熱器件加熱所述器件的至少死端分盆，借此，死端分盆 內(nèi)的氣體從所述死端分岔膨脹到所述進口通道中形成擴散屏障并從而 可逆地密封所述器件的進口通道，
-擴增所述液體樣品中的核酸，以及
-監(jiān)視擴增反應(yīng)。
本發(fā)明的第四個主題是擴增液體樣品中的核酸的方法，其至少包
括
-通過所迷器件的進口通道向本發(fā)明微流體器件的反應(yīng)腔內(nèi)提供 液體樣品，
-利用加熱器件加熱所述器件的至少死端分岔，借此，死端分岔內(nèi)的氣體從所述死端分岔膨脹到所述進口通道中形成擴散屏障并從而 可逆地密封所述器件的進口通道，以及 -擴增所述液體樣品中的核酸。
本發(fā)明的第五個主題是一種包含規(guī)定體積氣體的死端分岔室形成 微流體閥用于關(guān)閉含液體的微流體通道的用途，其中，當加熱至少所述 死端分岔室時，所迷氣體從所述死端分盆室膨脹到所述通道中形成能可
逆地密封所述通道的擴散屏障，從而將所述液體分割為2部分并且關(guān)閉
所述通道。
附圖簡述
下面將通過實施例說明本發(fā)明優(yōu)選實施方案，同時參考附圖，其中 圖l(A)顯示微流體器件(l)，它包含主通道(15)和由主通道分出的幾 條進口通道(12),每條進口通道通往反應(yīng)腔(11)并具有含有氣體的死端分 岔(14)， 一旦加熱，所示氣體可以密封進口通道。圖l(B)詳細展示了進 口通道(12)的具體實施案，它具有死端分岔(14),通往一個反應(yīng)腔(ll), 后者具有出口通道(13)，它包含疏水改性的幾何閥(16)，而圖l(C)則詳 細展示防止從反應(yīng)腔(11 )外流的幾何閥(16)。
圖2顯示本發(fā)明微流體溫度驅(qū)動閥的某些實施方案，它具有進口通 道(12)和死端分岔(14),其中死端分岔與進口通道之間的夾角小于90°, 指向所迷反應(yīng)腔灌注期間液體樣品的流動方向(A)，或其中進口通道包 含2個死端分岔且其中死端分岔進入進口通道的開口基本上位于另 一個 的對面(B)。
圖3顯示本發(fā)明微流體溫度驅(qū)動閥的功能。放大斷面圖顯示了以下 情況下的通往反應(yīng)腔(11)的進口通道(12)和灌注了氣體(14)的死端分盆 當不存在液體時(A);當進口通道和反應(yīng)腔灌注了液體時(B)，以及當 加熱至少死端分岔從而導(dǎo)致氣體膨脹，同時反應(yīng)腔和進口通道灌注了液
體時(C)。
圖4顯示微流體器件的放大斷面，特別顯示出部分主通道(15)和通 往反應(yīng)腔(11)的進口通道(12)的連接點。表示出進口通道(12)上的死端分 岔(14)的幾種實施方案和安排。
圖5顯示微流體器件的放大斷面，特別顯示出部分主通道(15)和通 往反應(yīng)腔(l l)的進口通道(12)的連接點。表示出進口 (12)和出口 (13)通道上的死端分岔(14)的幾種范例實施方案和安排。
圖6顯示微流體器件的放大斷面，特別顯示出部分主通道(15)和通 往反應(yīng)腔(11)的進口通道(12)的連接點。出口通道(13)還包含幾何閥(16)。 表示出進口通道(12)上的死端分岔(14)的幾種實施方案和安排。
圖7顯示微流體器件的放大斷面，特別顯示出部分主通道(15)和通 往反應(yīng)腔(11)的進口通道(12)的連接點。出口通道(13)還包含幾何閥(16)。 表示出進口(12)和出口(13)通道上的死端分岔(14)的幾種范例實施方案 和安排。
圖8顯示具有幾何閥(16)的死端分岔(14)的特定實施方案。
圖9顯示在出口通道(13)中包含幾何閥(16)的實施方案中反應(yīng)腔(11) 和收集通道(17)的灌注。


圖10代表當在6個平行反應(yīng)中分析一份人類HBV-陽性患者的血漿 樣品時，循環(huán)數(shù)目對焚光的曲線圖。
附圖標記說明
I 微流體器件
II 反應(yīng)腔
12 進口通道
13 出口通道
14 死端分岔
15 主通道
16 幾何閥
17 收集通道
18 樣品進入孔口
19 補償體積
具體實施例方式
本發(fā)明涉及可應(yīng)用在微流體器件或微流體芯片上的微流體溫度驅(qū) 動閥。此種閥在微流體器件中的應(yīng)用是優(yōu)越的，因為它允許器件不是由 多層構(gòu)成，并在一個-復(fù)合方法中制成，這既省錢又省時。此種微流體器 件或微流體芯片可用于分析液體樣品的儀器中。這里所使用的術(shù)語"微 流體器件"描述一種器件，具有微結(jié)構(gòu)化(micro-structured)的零件，例如 通道、通道網(wǎng)絡(luò)或反應(yīng)腔。微流體器件可以是儀器的一部分(多次使用)或者是一次性的(一次使用)。
在本發(fā)明的 一種實施方案中，用于利用核酸擴增分析液體樣品的儀 器中的微流體器件至少包括反應(yīng)腔，它具有適合給反應(yīng)腔灌注液體樣品 的進口通道，和適合從反應(yīng)腔排出流體的出口 。出口可在反應(yīng)腔灌注液 體樣品后關(guān)閉，并且進口通道還包含至少一個死端分岔。死端分岔不具 有出口，包含氣體。另外，死端分岔的尺寸被設(shè)計成，當至少分岔被加 熱期間氣體從分盆膨脹出來時，至少包含足以密封進口通道的量的氣 體。當液體存在于進口通道中并對至少死端分岔加熱時，氣體將從死端 分岔室膨脹到進口通道中。從死端分岔延伸到進口通道中的氣泡于是便 形成擴散屏障，將進口通道中存在的液體分割為分開的部分，從而密封 進口通道。死端分岔的尺寸被設(shè)計成，使延伸自從死端分岔的氣泡是足 夠大量的以致在發(fā)生反應(yīng)的溫度下完全密封進口通道。在優(yōu)選的實施方 案中，氣體從死端分岔到進口通道中的延伸達到這樣的程度，以致氣泡 與進口通道的壁發(fā)生物理接觸從而使得完全密封。
反應(yīng)腔是在微流體器件上分析物與反應(yīng)試劑發(fā)生要求的反應(yīng)的區(qū) 域。另外，在某些方面，反應(yīng)腔也可以是，當監(jiān)—見反應(yīng)時，檢測反應(yīng)用
的部位。反應(yīng)腔通過作為流體網(wǎng)絡(luò)一部分的進口通道^L灌注以液體，該 液體就某些方面而言包含分析物。就某些方面而言，進口通道可在反應(yīng) 腔灌注液體之后利用塞子或閥(例如，本發(fā)明微流體溫度驅(qū)動閥)可逆或 不可逆地關(guān)閉，借助膠粘，熱和/或機械力或具有高沸點的不可混溶液體 (例如，礦物油、蠟、卣代烴)，取決于進口通道的類型和器件的應(yīng)用領(lǐng) 域的類型。
出口也是在反應(yīng)腔灌注液體期間用作從流體網(wǎng)絡(luò)和反應(yīng)腔中被替 換的氣體的排氣裝置的流體網(wǎng)絡(luò)的一部分。出口可以是通道，通氣孔或 滲透性或半滲透性膜，它們在某些方面可涂以疏水化合物或由疏水化合 物制成。在某些方面，出口可在反應(yīng)腔灌注液體后，利用塞子或閥(例如， 本發(fā)明微流體溫度驅(qū)動閥)利用膠粘、熱和/或機械力或具有高沸騰溫度 不可混溶液體(例如，礦物油、蠟、卣代烴)，取決于出口的類型和器件 應(yīng)用領(lǐng)域的類型，可逆或不可逆地關(guān)閉。
微流體閥的主要特征之一是死端分岔，它也是流體網(wǎng)絡(luò)的 一部分。 死端分岔灌注了氣體(空氣、無菌空氣或惰性氣體如氮氣、氬氣等)并從 通道中分岔出來。當微流體器件灌注液體時，死端分岔依然灌注了氣體，因為死端分岔不具另外的出口。
死端分岔可具有多種幾何形狀；優(yōu)選的是，與死端分岔的連接是窄 通道，比進口通道窄。在窄通道后面，坐落著氣體體積，其至少大到足 以膨脹到通道內(nèi)并把流體分割為2部分。這種較大的體積的形狀可以是 圓形、矩形、三角形或任何其他有利于高存儲密度或制造的形狀。
在微流體器件的某些實施方案中，死端分岔基本上垂直于所迷進口 通道。在微流體器件的另一種實施方案中，死端分岔出口部分與進口通 道之間的夾角小于90。，沿反應(yīng)腔灌注期間液體樣品的流動方向。在此 種實施方案中，當對至少死端分岔加熱時，氣體朝反應(yīng)腔膨脹。該實施 方案是有利的，因為反應(yīng)腔灌注期間死端分岔中所含的氣體被液體擠出 以及死端分岔中灌入液體的危險減少了 。
然而，在某些方面，死端分岔出口部分與進口通道之間的角度高于 90°，沿反應(yīng)腔灌注期間液體樣品流動方向，也可能有利。這里，當對 至少死端分盆加熱時，氣體將膨脹遠離反應(yīng)腔，從而防止氣體意外地膨 脹到反應(yīng)腔內(nèi)。這對于器件具有高反應(yīng)腔密度和/或相對于死端分岔中所 提供的氣體量而言僅具有短進口通道的情況特別有用。
另外，如果采用包含死端分盆的微流體溫度驅(qū)動閥來關(guān)閉出口通 道，則在某些方面可能有利的是，死端分岔基本上垂直于所述出口通道， 或者死端分岔出口部分與出口通道之間的角度小于90。，沿反應(yīng)腔灌注 期間液體樣品流動方向。這樣的實施方案保證，當對至少死端分岔加熱 時氣體膨脹遠離反應(yīng)腔，并借此防止氣體意外地膨脹到反應(yīng)腔內(nèi)。
一種范例實施方案表示在圖2(A)中。在該實施方案中，死端分岔(14) 的出口部分的直徑分別小于進口通道(12)和出口通道(13)的直徑，以防止 不希望的死端分岔室被灌注。死端分忿(14)的出口部分與進口通道(12) 之間的角度為約130°,而死端分岔(14)的出口部分與出口通道(13)之間 的角度為約50°，沿反應(yīng)腔灌注期間液體樣品流動方向。這樣的組件保 證，當對至少死端分岔(14)加熱時，膨脹自2個死端分盆(14)的氣體擴散 入相應(yīng)的通道而遠離反應(yīng)腔(ll)。借此，反應(yīng)腔(ll)的內(nèi)容物便被密封， 同時不希望的氣體膨脹到反應(yīng)腔(11)內(nèi)的情況也得以防止。
在微流體器件的某些實施方案中，進口通道的內(nèi)壁，至少在死端分 岔與進口通道之間的連接處，被覆蓋以疏水涂層。這樣做之所以有利是 因為，膨脹后的氣體在膨脹階段期間及其以后得到穩(wěn)定，因為基于能量的原因，空氣將聚集在疏水表面。這樣的行為最小化了空氣從微流體閥 流向反應(yīng)腔的危險——將導(dǎo)致閥功能的喪失。 一種疏水涂層是具有表現(xiàn)
出與作為試驗流體的水之間大于90。接觸角的低表面張力的涂層。例子 是聚四氟乙烯(Teflon)(PTFE)涂層、烴類或氟代烴、鈦(titan)涂層、聚對 二甲笨(parylene)和硅烷化玻璃表面。
在某些實施方案中，微流體器件包括多個反應(yīng)腔，以便允許在1個 器件上平行地分析1個以上液體樣品。在某些方面，每條進口通道一端 連接一個反應(yīng)腔，而另一端連接主通道。主通道對于樣品的分配，以及 給多個反應(yīng)腔每一 個灌注所述液體樣品是有用的。這使得若干反應(yīng)腔在 基本上同 一 時間灌注同 一 液體樣品成為可能。樣品被提供在器件上的特 定灌注位置。隨后，液體樣品沿著主通道被送入到進口通道并進而到反 應(yīng)腔中，優(yōu)選地通過毛細管力。在其他實施方案中，反應(yīng)腔可通過低壓、 高壓或利用離心機旋轉(zhuǎn)器件得到灌注。在此種實施方案中，同樣的樣品 可在幾個反應(yīng)腔內(nèi)平行地進行同樣的擴增和/或檢測反應(yīng)，以提供同 一 實 驗的多個結(jié)果，如果在所有反應(yīng)腔內(nèi)提供同一擴增混合物；或者同一 樣品可在幾個反應(yīng)腔中接受各種不同的擴增和/或檢測反應(yīng)，如果在反 應(yīng)腔中提供不同的擴增混合物。這樣的擴增和/或檢測反應(yīng)是，例如，聚 合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction)、 連接酶鏈反應(yīng)(ligase chain reaction)、 基于核酸序歹'J的擴增(nucleic acid sequence-based amplification)、 ^J不才廣i曽(rolling circle amplification)、鏈置才奐擴增(stmnd-displacement amplification)或轉(zhuǎn)錄-介導(dǎo)的擴增(transcription- mediated amplification),
在圖l(A)中，畫出一種微流體器件(l)的范例實施方案，其包括主通 道(15)和從主通道分出的若千進口通道(12)，每條進口通道通往反應(yīng)腔 (ll)并具有包含氣體的死端分岔(M)，該氣體在一旦加熱時可密封進口通 道。樣品(例如，血漿)被提供在器件(l)上，進入樣品進入孔口(18),通 過各種微流體結(jié)構(gòu)(例如，主通道(15))被送到反應(yīng)腔(11)，這或者借助對 流體網(wǎng)絡(luò)加壓，借助器件的離心力或者借助毛細管力實現(xiàn)。主通道(15) 包括幾個連接點，引導(dǎo)液體樣品通過進口通道(12)進入反應(yīng)腔(U)中。每 條進口通道(12)包括起微流體閥作用的死端分岔(14)。灌注死端分岔(14) 的空氣沒有被液體樣品替代，因為在死端分岔(14)中不存在另外的出口。 每個反應(yīng)腔(ll)包括出口通道(13),存在于反應(yīng)腔(ll)中的空氣在空氣被樣品液體替代時通過所述出口通道(13)被排出。最終進口通道(12)從主通 道分叉后，主通道(15)彎曲并被引導(dǎo)使得出口通道(13)注入到主通道(15) 中。該段主通道被稱作收集通道(7)。于是，從反應(yīng)腔(ll)通過出口通道 (13)排出的氣體通過收集通道(17)放出。反應(yīng)腔(ll)灌注完成后，器件應(yīng) 將利用關(guān)閉手段，例如，蓋子、軟塞、膠或利用膠帶來關(guān)閉。當對器件 施以熱循環(huán)時，被困在死端分岔(14)內(nèi)的氣體將在較高溫度膨脹到進口 通道(12)中，并借此將通道分隔成2個獨立的段——2個充液段夾一氣體 體積。由于此種膨脹，使得從一個反應(yīng)腔(ll)進入另一個反應(yīng)腔(ll)的擴 散得到防止。熱循環(huán)過程完成后，芯片冷卻下來，于是氣體體積收縮， 導(dǎo)致閥的開啟。因此，只要閥處于關(guān)閉，必須在高溫或?qū)崟r地使用檢測 手段。
在另一種優(yōu)選的實施方案中，如圖l(B)和(C),以及圖6(A)詳細表 示的，微流體器件的出口通道(13)每條包括疏水改性的幾何閥(16)。如圖 1 (C)詳細描述的幾何閥將空氣圍困在狹窄小段內(nèi)，因為該段為疏水的。 當收集通道(17)灌注液體時，幾何閥被反應(yīng)腔和出口通道內(nèi)的液體樣品 從內(nèi)側(cè)關(guān)閉，并被收集通道(17)內(nèi)的液體樣品從外側(cè)關(guān)閉。另外，被困 在疏水改性的幾何閥(16)的狹窄小段中的氣體阻止了分子從反應(yīng)腔(U) 到收集通道(17)的擴散。
在某些方面，包含引物(primer)、探針和/或緩沖液的不同反應(yīng)混合 物被提供給不同反應(yīng)腔(U),從而允許分析一種樣品中幾種不同核酸的 存在。在另一個方面，不同反應(yīng)腔(ll)包含相同的含引物、探針和/或緩 沖液的反應(yīng)混合物，從而允許分析一種樣品在幾種獨立反應(yīng)中的1個參 數(shù)。
在擴增和/或檢測反應(yīng)中在微流體器件上微流體溫度驅(qū)動閥的使用 的主要優(yōu)點是，可利用反應(yīng)期間的加熱作為致動以利用死端分岔中提供 的氣體膨脹關(guān)閉該閥，從而關(guān)閉進口通道和將液體樣品密封在1或多個 反應(yīng)腔內(nèi)。于是，當在擴增和/或檢測反應(yīng)中采用此種微流體器件時，不 需要提供額外致動以密封反應(yīng)腔(例如，額外加熱器和/或冷卻器或機械 密封反應(yīng)腔的器件)。另外，在此種裝置中不需要附加的用于供應(yīng)外致動 的超結(jié)構(gòu)零件如管道和接線，從而導(dǎo)致器件的簡化。替代包括超結(jié)構(gòu)零 件和通道以及反應(yīng)腔的復(fù)雜多層結(jié)構(gòu)，包含微流體溫度驅(qū)動閥的本發(fā)明 微流體器件可制成一層，具有可比的簡單幾何形狀，從而導(dǎo)致制造成本的降低。
本發(fā)明微流體溫度驅(qū)動閥的詳細功能展示在圖3中。該放大斷面表 示出，當不存在液體時(A),通往反應(yīng)腔(11)的進口通道(12)和灌注氣體 的死端分岔(14)。液體樣品通過進口通道(12)供應(yīng)給微流體器件的反應(yīng)腔 (11)。進口通道(12)包括至少一個死端分岔(14)。死端分岔(14)不包括另 外的出口，因此，死端分岔中裝有的氣體在樣品經(jīng)過進口通道(12)流向 反應(yīng)腔(ll)時不被液體樣品所替代。因此，當反應(yīng)腔(11)和進口通道(12) 灌注液體時，規(guī)定數(shù)量的氣體被包含在死端分岔(14)中。這情形表示在 圖3(B)中。死端分岔(14)的尺寸以及因此被包含的氣體數(shù)量，根據(jù)待關(guān) 閉的進口通道(12)的直徑以及給死端分岔施加的熱量來選擇。正如可從 圖3(C)看出的，當對至少死端分岔(14)加熱時，氣體從死端分岔(14)膨 脹進入灌注液體的進口通道(12)中，此過程符合理想氣體定律并依賴于 氣體的熱容。氣體在一側(cè)的膨脹以及幾何閥(16)在出口通道(13)中的存 在，只允許氣體但阻止液體從反應(yīng)腔(ll)移出，致使液體聯(lián)通被中斷并 使反應(yīng)腔(ll)內(nèi)的液體分成段。因此，從死端分岔(14)膨脹出的氣體起到 擴散屏障的作用，使反應(yīng)腔(U)與進口通道(12)脫節(jié)，從而當對至少死端 分岔(14)加熱時，在反應(yīng)腔(11)與進口通道(12)之間不可能進行物質(zhì)交 換。
當加熱時，微流體器件必須關(guān)閉以防止液體樣品蒸發(fā)。敞開的器件 在熱循環(huán)后將是空的，因此不能實現(xiàn)成功的擴增。關(guān)閉可通過，例如， 蓋子、膠帶、軟塞或膠(其通過UV或快速反應(yīng)(2組分體系)在孔口(port) 內(nèi)瞬間聚合)來實施。
為實現(xiàn)在閉合系統(tǒng)內(nèi)氣體從死端分岔到進口通道中的所述膨脹，必 須存在一定補償體積。該補償體積允許氣體從死端分岔膨脹，同時補償 體積本身則收縮。補償體積也必須灌注氣體，因為液體幾乎不可壓縮。 沒有這樣的補償體積，閉合系統(tǒng)中的壓力將升高，而氣體從死端分岔到 進口通道中的膨脹將不會發(fā)生。理想地，補償體積在施加熱循環(huán)期間不 被加熱，否則在補償體積和死端分岔閥中的壓力將同等程度地升高。在 補償體積也被加熱的情況下，氣體從死端分岔的膨脹是通過相對于死端 分岔室的高度而言增加補償體積室的厚度和/或高度而成為可能的。借 此，沿補償體積的溫度梯度允許氣體從死端分岔室膨脹。作為例子，可 采用一種在器件灌注后關(guān)閉并且在施加熱循環(huán)期間不被加熱的空灌注孔口作為補償體積(19)，正如圖l(A)所示。
在如圖2(B)的例子所示的微流體器件的其他實施方案中，進口通道 (12)包含至少2個死端分岔(14),其中所述死端分岔(14)進入進口通道(12) 的開口位于彼此基本上相反的位置。在另一些實施方案中，死端分岔可
與另一個相鄰。這樣的實施方案的第一個優(yōu)點是冗余度。這樣，如果1 個死端分岔偶然被灌注了流體，則第二個閥可關(guān)閉通道。此種實施方案 的第二個優(yōu)點是存儲密度。可將氣體體積分成2個部分，在進口通道每 側(cè)各一個部分，從而造成閥以及，因此，器件，與整個氣體體積都在進 口通道一側(cè)的一個死端分盆中的實施方案相比，更為緊湊的格式。
方案:范例實施方案、^繪在圖4(B; (E)中。死端分岔(;)可位于另二個 的對面(B),對面但錯開(C)，與另一個相鄰(D),或者可存在多個死端分 岔(E)。另外，如圖5所示，在出口通道(13)中也可存在1或多個死端分 岔，讓出口通道(13)也能在微流體器件加熱的同時關(guān)閉。在該死端分岔 中提供的氣體的量可選擇，使得，當加熱該器件時，每個死端分岔(14) 含有足夠氣體用于關(guān)閉進口通道(12)，或者使得，當器件加熱時，在2 或多個死端分盆(14)合在一起中的氣體的量足以關(guān)閉進口通道(12)。第一 種實施方案具有優(yōu)越性，因為冗余度。這樣，假如1個死端分岔偶然被 灌注了流體，則第二個閥能關(guān)閉通道。后一種實施方案具有的優(yōu)勢在于 它能夠?qū)崿F(xiàn)在器件上的高存儲密度。
在微流體器件的又一種實施方案中，出口通道(13)包含幾何閥(16) 和/或至少一個死端分岔(M)和/或疏水涂層。這樣的實施方案描繪在圖6 和7中。在圖6(A)中畫出一種微流體器件的實施方案，它具有從引導(dǎo)液 體進入反應(yīng)腔(11)的進口通道(12)分出的1個死端分岔(M),并具有位于 出口通道(13)末端的幾何閥(16),后者能，當反應(yīng)腔(ll)灌注液體樣品時， 引導(dǎo)氣體離開反應(yīng)腔(11)進入收集通道(17)中。另外，在圖6(B)-(E)展 示其他具有至少2個從進口通道(12)分出的死端分岔(14)的范例實施方 案，其中死端分岔(14)位于另一個的對面(B),對面但錯開(C)，與另一個 相鄰(D)，或者可存在多個死端分岔(E)。另外，出口通道(13)也可包含1 或多個死端分岔，這讓出口通道(13)也能在微流體器件加熱期間被關(guān)閉。 這樣的實施方案表示在圖7中。
在圖l(C)中畫出一種范例幾何閥。該幾何閥由小直徑的小通道(例如，毛細管)組成并位于2個較大腔或通道之間。優(yōu)選的是，小通道位于 2個較大腔或通道之間的壁的中間并且不與腔或通道共享任何側(cè)壁部 分。構(gòu)成幾何閥的小通道的延續(xù)部分應(yīng)制造成這樣，即，在每一側(cè)存在 著較大腔或通道與小通道之間的90°角。由于制造的原因，這樣的閥難 以生產(chǎn)。因此， 一般地這些幾何閥通過與腔或通道共享一個壁而簡化(例 如，通道的一個側(cè)壁直接延伸到腔或通道中，而不形成90。角)。另外， 如圖8所示，死端分岔(14)還可包含幾何閥(16),它優(yōu)選是疏水的，位于 通道(12/13)與死端分岔(14)的出口之間的交叉點。這樣的實施方案是有 利的，因為，幾何閥(16)起到避免在器件灌注期間死端分岔(14)被意外地 灌注液體的附加功能。
在某些方面，幾何閥經(jīng)過疏水處理或者材料固有的是疏水的。這樣 的實施方案表示在圖9中。具有疏水表面的幾何閥的行為不同于具有親 水表面的幾何閥之處在于，當微流體器件灌注水基液體時灌注(A)在閥的 狹窄部分前停止(B)。由于這樣的行為， 一定數(shù)量氣體被困在幾何閥(16) 的狹窄部分中。與收集通道(17)相結(jié)合，氣體被從兩側(cè)困住，并被來自 兩側(cè)的液體包圍(C)。這兩段液體被困在幾何閥狹窄部分中的氣體分開， 因此在2段液體之間不會發(fā)生擴散。此類型閥不要求加熱，但如果幾何 閥被加熱，則困住的氣體將膨脹而不妨礙功能。疏水改性的幾何閥(16) 與收集通道(17)的組合被用作本發(fā)明器件中的反應(yīng)腔的特殊出口。單靠 幾何閥(16)，抑或與收集通道(17)組合起來，可在認為在出口需要閥的場 合用來替代或輔助閥(例如，死端分岔閥)以密封出口(13)。
在另 一種實施方案中，本發(fā)明提供一種利用核酸擴增分析液體樣品 的儀器，其至少包括本發(fā)明的微流體器件、監(jiān)視核酸擴增反應(yīng)用的器 件，以及至少覆蓋所述至少一個死端分岔的加熱器件。在某些實施方案 中，加熱器件還覆蓋所述反應(yīng)腔。該實施方案之所以有利是因為，關(guān)閉 微流體溫度驅(qū)動閥與核酸的擴增正好重合。在某些方面，該儀器還包括 熱控制(heat control),它允許加熱以便按照受控方式開啟和關(guān)閉微流體 閥，和/或加熱或?qū)嵤嵫h(huán)以便按照受控方式完成擴增反應(yīng)。在特定的 領(lǐng)域(例如，PCR領(lǐng)域)，有用的是，加熱器件能執(zhí)行熱曲線(heat profiles)。 在某些領(lǐng)域，微流體器件在加熱期間必須關(guān)閉，以防止液體樣品蒸發(fā)。 微流體器件的關(guān)閉可通過，例如，蓋子、膠帶、軟塞或膠(其通過UV或 快速反應(yīng)(2組分體系)在孔口內(nèi)瞬間聚合)來實施。在另 一種實施方案中，本發(fā)明提供一種利用核酸擴增分析液體樣品
的方法，其至少包括通過所述器件的進口通道向本發(fā)明微流體器件的 反應(yīng)腔內(nèi)提供液體樣品。在下一個步驟中，利用加熱器件對該器件的至 少死端分岔加熱，由此導(dǎo)致死端分岔內(nèi)的氣體膨脹，借此密封器件的進 口通道。隨后，液體樣品中的核酸進行擴增，并監(jiān)視擴增反應(yīng)。
在又一種實施方案中，本發(fā)明提供一種擴增在液體樣品中的核酸的 方法，其至少包括通過所述器件的進口通道向本發(fā)明微流體器件的反 應(yīng)腔內(nèi)提供液體樣品，利用加熱器件對該器件的至少死端分岔加熱，由 此導(dǎo)致死端分岔內(nèi)的氣體膨脹，借此密封所述器件的進口通道，以及擴 增液體樣品中的核酸。
這兩種方法在某些方面還可以包括，在反應(yīng)腔灌注液體樣品后，關(guān) 閉進口和/或出口通道。另外，在這些方法中，核酸的擴增可利用擴增反 應(yīng)來實施，例如，聚合酶鏈反應(yīng)、連接酶鏈反應(yīng)、基于核酸序列的擴增， 滾環(huán)擴增、鏈置換擴增或轉(zhuǎn)錄-介導(dǎo)的擴增。
實施例
對在抗凝劑EDTA中收集的HBV-陽性患者的人體血漿利用以下手 段對乙型肝炎(Hepatitis B)病毒(HBV)進行測試COBAS AmpliPrep/ COBAS TaqMan HBV測試(Roche, P/N 03587819 190)。樣品制備按照 手冊采用COBAS AmpliPrep機器實施。樣品制備后，提純的樣品與以 下試劑進行混合
提純的樣品 45^1
HBV Mn2+ (獲自HBV CS4盒) 15 (xl
HBV MMx (獲自HBV CS4盒) 35 pi
HBV QS (獲自HBV CS4盒) 5 pi
總體積 100 pi
獲得的溶液隨后被吸移到如圖1 (A)所示的具有6個反應(yīng)腔的微流體 器件的樣品孔口(18)中。樣品是利用泵灌注到芯片中的。灌注后，用隨 器件帶來的一體化蓋子關(guān)閉器件。按照以下程序?qū)ζ骷嵤嵫h(huán)，所 迷熱循環(huán)使用 一 種為固定該器件并實時檢測反應(yīng)腔中的反應(yīng)而采取的熱循環(huán)機
勻變溫度時間[°c][s]
預(yù)循環(huán)1.250.0200
順序開始
變性1.295.0150
退火1.259.0251
順序結(jié)束5
順序開始
變性1.291.0150
退火1.252.0251
順序結(jié)束55
后循環(huán)1.240.01200
集(aquisation)
器件的初始加熱期間，溫度驅(qū)動閥按照死端分岔的幾何式樣對于特 定溫度處于關(guān)閉狀態(tài)，并維持關(guān)閉直至PCR反應(yīng)完成以及器件冷卻下來。
PCR性能在熱循環(huán)期間進行實時在線監(jiān)視。指出樣品中存在的HBV 的量的類似Ct值可在每一個反應(yīng)腔中檢測到(見圖10)。
權(quán)利要求
1.一種利用核酸擴增分析液體樣品用的儀器中使用的微流體器件，其至少包括-反應(yīng)腔，具有適合給所述反應(yīng)腔灌注所述液體樣品的進口通道，和-適合從所述反應(yīng)腔中排出流體的出口，其中所述出口可在反應(yīng)腔灌注所述液體樣品后關(guān)閉，且其中所述進口通道還包含至少一個包含死端分岔的微流體閥，所述死端分岔不具有出口，它包含氣體并且尺寸設(shè)計為，在至少所述死端分岔加熱期間，至少包含足以密封所述進口通道的量的氣體，此時所述氣體從所述死端分岔膨脹到所述進口通道中形成能可逆地密封所述進口通道的擴散屏障。
2. 權(quán)利要求的微流體器件，其中所述死端分盆基本上垂直于所述進C7通道。
3. 權(quán)利要求1~2中任何一項的微流體器件，其中所述進口通道至少 在所迷死端分岔與所述進口通道之間連接點處的內(nèi)壁被疏水涂層覆蓋。
4. 權(quán)利要求1~3中任何一項的微流體器件，具有多個反應(yīng)腔，每個 反應(yīng)腔具有進口通道和出口 ，其中每個進口通道還包含至少一個包含死端 分岔的微流體閥，每個死端分岔不具有出口，它包含氣體并且尺寸設(shè)計為， 在至少所迷死端分岔加熱期間，至少包含足以密封所迷進口通道的量的氣 體，此時所述氣體從所述死端分岔膨脹到所述進口通道中形成能可逆地密 封所迷進口通道的擴散屏障。
5. 權(quán)利要求4的微流體器件，其中每個進口通道一端連接1個反應(yīng) 腔，而另一端連接主通道，所迷主通道用于給所迷多個反應(yīng)腔中每一個灌 注所述液體樣 品。
6. 權(quán)利要求1 ~5中任何一項的微流體器件，其中所述進口通道包含微流體閥，該閥包括至少2個死端分岔，且其中所迷死端分岔進入進口通 道的開口與另一個相鄰或基本上位于另一個的反面。
7. 權(quán)利要求1 ~6中任何一項的微流體器件，其中出口是出口通道并 包括幾何閥和/或至少一個死端分岔和/或疏水涂層。
8. —種利用核酸擴增分析液體樣品的儀器，其至少包括 -權(quán)利要求1 ~ 7中任何一項的微流體器件，- 監(jiān)視核酸擴增反應(yīng)的器件，以及- 至少覆蓋所述微流體器件的所述至少一個死端分忿的加熱器件。
9. 權(quán)利要求8的儀器，其中所述加熱器件還覆蓋所述微流體器件的所迷反應(yīng)腔。
10. 權(quán)利要求8和9中任何一項的儀器，還包括熱控制。
11. 權(quán)利要求8~10中任何一項的儀器，其中所述加熱器件能執(zhí)行熱曲線。
12. —種利用核酸擴增分析液體樣品的方法，其至少包括- 通過所述器件的進口通道向權(quán)利要求1 ~7中任何一項的微流體 器件的反應(yīng)腔內(nèi)提供液體樣品，- 利用加熱器件加熱所述器件的至少死端分盆，借此，死端分岔內(nèi) 的氣體從所述死端分岔膨脹到所述進口通道中形成擴散屏障并從而可逆地 密封所述器件的進口通道，- 擴增所述液體樣品中的核酸，以及- 監(jiān)視擴增反應(yīng)。
13. —種擴增液體樣品中的核酸的方法，其至少包括- 通過所述器件的進口通道向權(quán)利要求1~7中任何一項的微流體 器件的反應(yīng)腔內(nèi)提供液體樣品，- 利用加熱器件加熱所述器件的至少死端分岔，借此，死端分岔內(nèi) 的氣體從所述死端分岔膨脹到所述進口通道中形成擴散屏障并從而可逆地 密封所述器件的進口通道，以及- 擴增所述液體樣品中的核酸。
14. 權(quán)利要求12或13中任何一項的方法，其還包括- 反應(yīng)腔灌注了所迷液體樣品后，關(guān)閉進口和/或出口通道。
15. 權(quán)利要求12~ 14中任何一項的方法，其中核酸是利用聚合酶鏈反 應(yīng)、連接酶鏈反應(yīng)、基于核酸序列的擴增、滾環(huán)擴增、鏈置換擴增、等溫 擴增、觸地聚合酶鏈反應(yīng)或轉(zhuǎn)錄-介導(dǎo)的擴增實施擴增的。
16. —種死端分岔室的應(yīng)用，該室包含一定體積的氣體以形成關(guān)閉含 液體的微流體通道用的微流體閥，其中當加熱至少所述死端分岔室時，所 述氣體從所述死端分岔室膨脹到所迷通道中形成能可逆地密封所述通道的 擴散屏障，借此，將所述液體分隔成2部分并且關(guān)閉所述通道。
全文摘要
一種微流體溫度驅(qū)動的閥，其主題是一種利用核酸擴增來分析液體樣品的儀器中使用的微流體器件、一種利用核酸擴增分析液體樣品的儀器、一種分析液體樣品的方法以及一種擴增液體中的核酸的方法。
文檔編號C12M1/00GK101307834SQ20081008848
公開日2008年11月19日 申請日期2008年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月30日
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