專利名稱：：一種牡丹組織培養(yǎng)方法及改良的基本培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，涉及一種牡丹的組織培養(yǎng)繁殖方法，具體地，涉及一種牡丹組織的無(wú)菌培養(yǎng)方法和一種改良的基本培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
：牡丹(paeoniasiz/f/Y/z^'cassAndr.)屬于芍藥禾斗(paeoniaceae)芍藥屬牡丹組落葉亞灌木植物，因其花朵大，花色多，雍容華貴，儀態(tài)萬(wàn)千，被尊為"百花之王"，是中國(guó)十大名花之首，在國(guó)內(nèi)外有極高盛譽(yù)。中國(guó)作為牡丹唯一的原產(chǎn)地，栽培歷史悠久，從南北朝至今已有1500多年，其品種類型已達(dá)800余種，分布于我國(guó)大江南北。它作為我國(guó)原生的、古老的特有植物是研究栽培植物起源、人工選擇理論和進(jìn)行科學(xué)試驗(yàn)的良好材料。牡丹作為我國(guó)重要的出口花卉，在長(zhǎng)期的牡丹栽培歷史過(guò)程中，我國(guó)人民對(duì)它的認(rèn)識(shí)逐步深入，產(chǎn)生了深厚的感情，也歷史地形成和發(fā)展出了我國(guó)特有的牡丹文化。目前，牡丹生產(chǎn)主要依靠常規(guī)繁殖，通過(guò)播種牡丹種子進(jìn)行有性繁殖。由于其繁殖系數(shù)大，生產(chǎn)上多用于選育優(yōu)良品種與培育砧木，藥用牡丹也用種子繁殖。但主要用于觀賞的重瓣品種一般不結(jié)實(shí)，并且種子還具有上胚軸休眠現(xiàn)象，繁育周期長(zhǎng)，而且播種得到的苗木容易發(fā)生變異和性狀分離。在無(wú)性繁殖中，主要依靠分株繁殖、嫁接繁殖、壓條繁殖和扦插繁殖。但這些技術(shù)都存在著種種限制，不僅繁殖系數(shù)小，繁殖速度慢，而且其生產(chǎn)周期相對(duì)較長(zhǎng)。一株商品種苗的生產(chǎn)至少需要3年的時(shí)間，很難形成規(guī)模，根本無(wú)法滿足市場(chǎng)的需求。尤其是一些優(yōu)良品種，用傳統(tǒng)的繁殖方法難以在短期內(nèi)得到推廣，這些都嚴(yán)重影響并制約著牡丹的商品化、產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn)。因此，組織培養(yǎng)就是解決其快速繁殖的最有效手段之一。通過(guò)對(duì)牡丹組織培養(yǎng)技術(shù)的研究，可以改變傳統(tǒng)的繁殖方法，縮短牡丹的生產(chǎn)周期，極大地提高其繁殖系數(shù)，為生產(chǎn)提供大量種苗。有些牡丹品種感染病毒病后就會(huì)大大地影響其觀賞價(jià)值，采用組織培養(yǎng)技術(shù)就可以利用植株的分生組織不易感染病毒的原理培育牡丹的脫毒苗木。由于常規(guī)的有性繁殖往往會(huì)造成大小不一的變異，如牡丹花的紅色可能變異成粉紅色等。而組織培養(yǎng)不存在變異，可保持其原母本的一切遺傳特性，防止種質(zhì)資源的退化。而且，利用組織培養(yǎng)技術(shù)保存種質(zhì)資源還有諸多優(yōu)點(diǎn)(1)占空間??；(2)可防止病蟲(chóng)；(3)可以迅速大量繁殖；(4)費(fèi)用低；(5)便于交流等。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對(duì)牡丹的組織培養(yǎng)進(jìn)行了大量的研究工作，均取得了不同程度的進(jìn)展，有的已經(jīng)獲得了生根植株，在理論上進(jìn)行生產(chǎn)是可行的，但尚未投入生產(chǎn)。因?yàn)樵谀档そM培苗的生產(chǎn)工藝中，外植體表面消毒污染率高一直是一個(gè)瓶頸一方面其大量增加人為工作量，一方面又耗費(fèi)掉相當(dāng)數(shù)量種資材料。此外，用于外植體滅菌的消毒劑，多采用升汞、次氯酸鹽及抗生素。其中，升汞由于對(duì)環(huán)境的嚴(yán)重污染，已不提倡使用；抗生素由于對(duì)植物生長(zhǎng)造成抑制，應(yīng)用也不廣泛。次氯酸鹽，尤其次氯酸鈉，以滅菌效果好，對(duì)環(huán)境污染很小，使用方便等優(yōu)點(diǎn)成為外植體滅菌劑的最佳選擇。文獻(xiàn)中常用于牡丹組織培養(yǎng)的有兩種基本培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基和WPM培養(yǎng)基。然而，在培養(yǎng)過(guò)程中，這兩種培養(yǎng)基經(jīng)常使培養(yǎng)物發(fā)生嚴(yán)重褐變、玻璃化，而且繁殖系數(shù)低、組培苗生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)出的不定芽生根困難；在有的研究中甚至未獲得瓶?jī)?nèi)生根苗。還有煉苗、出瓶等問(wèn)題，尤其是后者，這是在當(dāng)前牡丹組織培養(yǎng)環(huán)節(jié)中眾所周知的最大困擾，特別在高溫季節(jié)，造成成本過(guò)高，難于推廣。此外，褐化是伴隨牡丹組織培養(yǎng)始終的一個(gè)現(xiàn)象，其本質(zhì)是酚類物質(zhì)在多酚氧化酶作用下，氧化成蒽醌類物質(zhì)。牡丹作為一種肉質(zhì)根的亞灌木植物，富含該類物質(zhì)。此物質(zhì)對(duì)植物本身的生長(zhǎng)，有一定促進(jìn)作用，但積累過(guò)多，也會(huì)造成毒害。所以，關(guān)鍵在于改善其組培苗的生長(zhǎng)環(huán)境。首要的，即是改善其生長(zhǎng)培養(yǎng)基組分。因此，在牡丹的組織培養(yǎng)技術(shù)中，這些關(guān)鍵步驟仍需進(jìn)行深入的研究。本申請(qǐng)的發(fā)明人通過(guò)多年潛心研究，改進(jìn)了目前牡丹組織無(wú)菌培養(yǎng)的方法，建立了一種牡丹組織無(wú)菌培養(yǎng)體系，并且發(fā)現(xiàn)了一種更適于牡丹組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基，克服了當(dāng)前培養(yǎng)技術(shù)中的上述缺陷。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于牡丹組織無(wú)菌培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基PM，其配方的組成為200—700mg/LNH4N03、300—400mg/LMgS047H20、150_350mg/LKH2P04、50—900mg/LCaCl22H20、O—1000mg/LK2S04、0—1400mg/LCa(N03)2、1500—2000mg/L跳、20—100mg/LFeS047H20、37.3mg/LNa2-EDTA、22.3rag/LMnS044H20、8.6mg/LZnS047H20、6.2mg/LH3B03、0.025mg/LCuS045H20、0.25mg/LNa2Mo042H20、0.83mg/LKI、0.025mg/LCoCl26H20、0.1mg/L鹽酸硫胺素、0.5mg/L鹽酸吡哆辛、0.5mg/L煙酸VB5、2.0mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、25g/L蔗糖和6—7g/L瓊脂。優(yōu)選地，其中N^N03為296mg/L、MgS047H20為370mg/L、KH2P04為340mg/L、CaCl22H20為95.55mg/L、K2S04》990mg/L、Ca(N03)24H20為1309.8mg/L、訓(xùn)3為1900mg/L、FeS047H20為27.8mg/L。更優(yōu)選地，其中NH萬(wàn)為700mg/L、MgS047H20為370mg/L、,04為340mg/L、CaCl22H20為882mg/L、1(2504為0mg/L、Ca(N0》2為0mg/L、跳為1500mg/L、FeS047H20為99.90mg/L。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種用于牡丹組織培養(yǎng)的增殖培養(yǎng)基，其配方為在基本培養(yǎng)基PM的基礎(chǔ)上添加0.5—1.5mg/LBA、25g/L蔗糖和6—7g/L瓊脂。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種牡丹組織無(wú)菌培養(yǎng)的方法，其特征在于包括下列步驟(1)外植體的消毒；(2)將步驟(1)處理后的外置體接種于基本培養(yǎng)基PM;(3)將經(jīng)過(guò)步驟(2)培養(yǎng)的外植體組織轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。其中，外植體滅菌的步驟包括先將外植體以70%乙醇浸泡30秒鐘，然后使用濃度為0.2—0.5%的次氯酸鈉作為表面滅菌劑消毒10分鐘，無(wú)菌水沖洗4次，剝?nèi)ネ鈱喻[片；再用0.1%次氯酸鈉溶液消毒5分鐘，用無(wú)菌水沖洗4次。由于本發(fā)明的基本培養(yǎng)基PM是在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，改變了大量元素的組成和含量，使得基本培養(yǎng)基中鹽分的總摩爾數(shù)減少，大大降低了牡丹培養(yǎng)物的褐變；同時(shí)也避免了高鹽培養(yǎng)基對(duì)植株生長(zhǎng)的抑制，使得在繼代增殖階段的植株生長(zhǎng)健壯，葉片濃綠，葉柄呈粉紅、紅紫色，莖段木質(zhì)化程度增加，增殖率顯著高于平均水平。此外，在本發(fā)明的牡丹組織無(wú)菌培養(yǎng)體系中，由于改進(jìn)了目前對(duì)牡丹組織培養(yǎng)過(guò)程中外植體消毒的方法，顯著降低了外植體的污染率，提高了組織培養(yǎng)的存活率。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用于來(lái)限制本發(fā)明的范圍。6實(shí)施例l:牡丹外植體的消毒處理在12月_次年1月間在晴朗的午后，從生長(zhǎng)健壯的"趙粉"品種的牡丹植株上采集無(wú)病蟲(chóng)害、飽滿的鱗芽作為外植體，放入4'C冰箱中保存?zhèn)溆?。先用自?lái)水沖洗外植體的表面，再用毛刷蘸洗衣粉溶液刷洗每一個(gè)鱗芽，然后在自來(lái)水下沖洗30—60分鐘，轉(zhuǎn)移到超凈臺(tái)工作上，在每個(gè)無(wú)菌三角瓶中放5—7個(gè)鱗芽。將上述采集的鱗芽分別按下述方法進(jìn)行消毒處理(1)70%的乙醇消毒30秒鐘，無(wú)菌水清洗2次；添加2—3滴吐溫80的5%次氯酸鈉溶液消毒5分鐘，無(wú)菌水沖洗4次；(2)70%的乙醇消毒30秒鐘，無(wú)菌水清洗2次；添加2—3滴吐溫80的5%次氯酸鈉溶液消毒10分鐘，無(wú)菌水沖洗4次；(3)70%的乙醇消毒30秒鐘，無(wú)菌水清洗2次；添加2—3滴吐溫80的5%次氯酸鈉溶液消毒15分鐘，無(wú)菌水沖洗4次；(4)70%的乙醇消毒30秒鐘，無(wú)菌水清洗2次；添加2—3滴吐溫80的1%次氯酸鈉溶液消毒15分鐘，無(wú)菌水沖洗4次；(5)70%的乙醇消毒30秒鐘，無(wú)菌水清洗2次；添加2—3滴吐溫80的1%次氯酸鈉溶液消毒20分鐘，無(wú)菌水沖洗4次；(6)70%的乙醇消毒30秒鐘，無(wú)菌水清洗2次；添加2—3滴吐溫80的1%次氯酸鈉溶液消毒25分鐘，無(wú)菌水沖洗4次；(7)70%的乙醇消毒30秒鐘，無(wú)菌水清洗2次；添加2—3滴吐溫80的0.2%次氯酸鈉溶液消毒10分鐘，無(wú)菌水沖洗4次；再用0.1%次氯酸鈉溶液消毒5分鐘，用無(wú)菌水沖洗4次；(8)70%的乙醇消毒30秒鐘，無(wú)菌水清洗2次；添加2—3滴吐溫80的0.5%次氯酸鈉溶液消毒10分鐘，無(wú)菌水沖洗4次；再用0.1%次氯酸鈉溶液消毒5分鐘，用無(wú)菌水沖洗4次；經(jīng)過(guò)上述消毒方法處理后，將鱗芽置于培養(yǎng)皿中，用剪刀、鑷子撥掉芽外部鱗片，剪去芽基部較硬的部分后將芽接種在預(yù)先制備的基本培養(yǎng)基MS上，每瓶放一個(gè)外植體，在25±1°C，光照周期14h/d，相對(duì)濕度60%，光照強(qiáng)度為200030001x條件下培養(yǎng)7天，統(tǒng)計(jì)經(jīng)上述處理后的鱗芽的污染率，比較不同消毒方法的消毒效果。結(jié)果如下表l:"趙粉"品種表面滅菌情況消毒方法接種數(shù)污染數(shù)污染率％1302790.002302066.673301756.674302170.005301653.336301343.337301033.33830826.67上述結(jié)果表明與現(xiàn)有的單一消毒液濃度一次滅菌的方法相比，本發(fā)明的先用0.2_0.5%的次氯酸鈉消毒，然后剝?nèi)ネ鈱喻[片，再用0.1%次氯酸鈉溶液消毒的二次消毒方法能夠顯著降低外植體的污染率，提高無(wú)菌組織培養(yǎng)的存活率。實(shí)施例2:基本培養(yǎng)基對(duì)牡丹培養(yǎng)組織增殖的影響在12月一次年1月間在晴朗的午后，從生長(zhǎng)健壯的"紫蘭魁"品種的牡丹植株上釆集無(wú)病蟲(chóng)害、飽滿的鱗芽作為外植體，按上述實(shí)施例1所述方法對(duì)外植體進(jìn)行消毒滅菌。將無(wú)菌消毒后的外植體接種到分別添加了0.5—1.5mg/LBA、25g/L蔗糖和6—7g/L瓊脂的1/2MS、MS、WPM、PM—1和PM—2基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在25土1。C，光照周期14h/d，相對(duì)濕度60%，光照強(qiáng)度為200030001x條件下培養(yǎng)30天，重復(fù)進(jìn)行三次，并根據(jù)組織培養(yǎng)增值率的計(jì)算方法統(tǒng)計(jì)增殖率，并且觀察植株的生長(zhǎng)狀況。PM—1基本培養(yǎng)基的配方為700mg/LNH萬(wàn)、370mg/LMgS047H20、340mg/LKH2P04、882mg/LCaCl22H20、1500mg/LKN03、99.90mg/LFeS047H20、22.3mg/LMnS04■、8.6mg/LZnS047H20、6.2mg/LH肌、0.025mg/LCuS045H20、0，25mg/LNa2Mo042H20、0.83mg/LKI、0.025mg/LCoCl26H20、37.3mg/LNa廠EDTA、0.1mg/L鹽酸硫胺素、0.5mg/L鹽酸吡眵辛、0.5mg/L煙酸VBs、2.0mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇；PM—2基本培養(yǎng)基的配方為296mg/LNH萬(wàn)、370mg/LMgS047H20、340mg/LKH2P04、95.55mg/LCaCl22H20、1309.8mg/LCa(N03)24H20、990mg/LK2S04、1900rag/LKN03、27.8mg/LFeS047H20、22.3mg/LMnS044H20、8.6mg/LZnS047H20、6.2mg/LH3B03、0.025mg/LCuS045H20、0.25mg/LNa2Mo042H20、0.83mg/LKI、0.025mg/LCoCl26H20、37.3mg/LNa2-EDTA、0.1mg/L鹽酸硫胺素、0.5mg/L鹽酸吡哆辛、0.5mg/L煙酸VB5、2.0mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇。結(jié)果如表2所示。表2:基本培養(yǎng)基對(duì)"紫蘭魁"增殖的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>上述結(jié)果表明由于本發(fā)明的基本培養(yǎng)基PM—1和2在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，改變了大量元素的組成和含量，使得培養(yǎng)基中鹽分的總摩爾數(shù)減少，增殖率顯著高于普通基礎(chǔ)培養(yǎng)基；并且同時(shí)還觀察到在基本培養(yǎng)基PM—1和2上培養(yǎng)的植株生長(zhǎng)健壯，葉片濃綠，葉柄呈粉紅、紅紫色，莖段木質(zhì)化程度增加，褐變也顯著降低。權(quán)利要求1.一種用于牡丹組織無(wú)菌培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基PM，其組成為200-700mg/LNH4NO3、300-400mg/LMgSO4·7H2O、150-350mg/LKH2PO4、50-900mg/LCaCl2·2H2O、0-1000mg/LK2SO4、0-1400mg/LCa(NO3)2·4H2O、1500-2000mg/LKNO3、20-100mg/LFeSO4·7H2O、37.3mg/LNa2-EDTA、22.3mg/LMnSO4·4H2O、8.6mg/LZnSO4·7H2O、6.2mg/LH3BO3、0.025mg/LCuSO4·5H2O、0.25mg/LNa2MoO4·2H2O、0.83mg/LKI、0.025mg/LCoCl2·6H2O、0.1mg/L鹽酸硫胺素、0.5mg/L鹽酸吡哆辛、0.5mg/L煙酸VB5、2.0mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇。2.權(quán)利要求1的基本培養(yǎng)基PM，其中順4冊(cè)3為296mg/L、MgS047H20為370mg/L、,04為340mg/L、CaCl22H20為95.55mg/L、K2S04為990mg/L、Ca(N03)24H20為1309.8mg/L、跳為1900mg/L、FeS047H20為27.8mg/L。3.權(quán)利要求1的基本培養(yǎng)基PM，其中朋4恥3為700mg/L、MgS04，7H20為370mg/L、,04為340mg/L、CaCl22H20為882mg/L、K2S04》0mg/L、Ca(N03)2■為0mg/L、跳為1500mg/L、FeS047H20為99.90mg/L。4.一種用于牡丹組織無(wú)菌培養(yǎng)的增殖培養(yǎng)基，其組成為在權(quán)利要求1_3中任一項(xiàng)的基本培養(yǎng)基PM基礎(chǔ)上添加0.5—1.5mg/LBA、25g/L蔗糖和6—7g/L瓊脂。5.—種牡丹組織無(wú)菌培養(yǎng)的方法，其特征在于包括下列步驟(1)外植體的消毒；(2)將步驟(1)處理后的外植體接種于權(quán)利要求1_3任一項(xiàng)所述的基本培養(yǎng)基PM中；(3)將經(jīng)過(guò)步驟(2)培養(yǎng)的外植體組織轉(zhuǎn)接于權(quán)利要求4所述的增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。6、權(quán)利要求5的方法，其中外植體消毒的步驟包括將外植體以70%乙醇浸泡30秒鐘，無(wú)菌水清洗2次，然后用0.2—0.5%的次氯酸鈉消毒10分鐘，無(wú)菌水沖洗4次，剝?nèi)ネ鈱喻[片；再用0.1%次氯酸鈉溶液消毒5分鐘，用無(wú)菌水沖洗4次。全文摘要本發(fā)明提供一種用于牡丹組織培養(yǎng)的方法，包括下列步驟(1)外植體的滅菌；(2)滅菌處理后的外置體接種于基本培養(yǎng)基PM；(3)外植體轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。本發(fā)明還提供一種更適于牡丹組織無(wú)菌培養(yǎng)的改良的基本培養(yǎng)基PM和增殖培養(yǎng)基。在本發(fā)明的牡丹組織的無(wú)菌培養(yǎng)方法中，采用將外植體先用70％酒精消毒，然后用0.2-0.5％次氯酸消毒，剝?nèi)ネ庵搀w外殼，再用0.1％次氯酸再次進(jìn)行滅菌的方法，大大降低了外植體的污染率，顯著提高了組織培養(yǎng)的存活率。此外，發(fā)明的基本培養(yǎng)基PM是在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，改變了其中的大量元素的組成和含量，減少了基本培養(yǎng)基中鹽分的總摩爾數(shù)，提高了外植體的增殖率，同時(shí)降低了牡丹培養(yǎng)物的褐變，也避免了高鹽培養(yǎng)基對(duì)植株生長(zhǎng)的抑制。文檔編號(hào)C12N5/04GK101248764SQ20081008969公開(kāi)日2008年8月27日申請(qǐng)日期2008年4月14日優(yōu)先權(quán)日2008年4月14日發(fā)明者張俊琦,瑩李,羅曉芳申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)