專利名稱：：病原體原發(fā)感染的檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及適合用作病原體感染、尤其病原體原發(fā)感染的檢測中的試驗抗原的融合多肽。另外，本發(fā)明涉及用于檢測和差別化測定由病原體感染產(chǎn)生的IgM抗體的方法。此外，提供了用于實現(xiàn)這些方法的試驗試劑。
背景技術(shù)：
：除了PCR技術(shù)以外，免疫試驗仍然在感染血清學(xué)中起重要作用。通過不同免疫球蛋白類別的特異性測定，免疫學(xué)使得分析疾病的病期成為可能。通過測定針對某些病毒抗原的IgM和IgG效價，可能區(qū)分不同的感染階段，例如急性感染、復(fù)發(fā)性感染、慢性/持續(xù)感染或感染后疾病病期。例如，針對病毒糖蛋白的IgG分子僅僅在巨細(xì)胞病毒感染的晚期產(chǎn)生(Schoppel等JID(1997)175,533-544;Eggers等，J.Med.Virol.(2001)63，135-142)。在有各個其它免疫球蛋白類別存在下可靠地特異性檢測IgG和IgM的重要方面是，檢測抗原的有效表位濃度或有效表位密度。高度有效的表位濃度是指，存在高表位密度，且所有表位都可用于抗體結(jié)合。與此相反，多肽聚集體也具有高表位濃度，但是有效表位濃度低，因為表位部分地或完全地被掩蓋或隱藏，且因而不可用于抗體結(jié)合。高表位濃度是特異性IgM識別的前提，而低表位濃度是特異性IgG識別的前提。在應(yīng)檢測針對抗原A的IgM分子的經(jīng)典夾心IgM試驗中，將多聚體抗原A用作固定化的捕獲抗原。攜帶報道基團(tuán)的相同多聚體抗原A用作檢測抗原。IgM分析物結(jié)合捕獲抗原和檢測抗原，從而將報道基團(tuán)固定化在固相(例如包被鏈霉抗生物素蛋白的珠子)上。為了避免針對A的IgG分子的干擾，向試驗中加入未標(biāo)記的單體抗原A，作為干擾消除劑(WO98/23955，US6,489,129Bl)。相應(yīng)地，特異性的IgG夾心試驗(WO98/23961,US6,645,732Bl)可以包含用于檢測IgG的單體抗原和避免用IgM千擾的未標(biāo)記的多聚體抗原。允許IgM和IgG分子的特異性檢測的原理基于它們各自的分子結(jié)構(gòu)。五聚體IgM具有IO個相同的抗原結(jié)合互補(bǔ)位，而單體IgG每個分子僅具有2個結(jié)合部位。IgG的檢測基于對分析物的親和力，而IgM的檢測基于親合力(avidity)。在第一種情況下，通過表位和互補(bǔ)位(即IgG抗原結(jié)合部位)之間的高親和力相互作用來實現(xiàn)結(jié)合；在后一種情況下，通過幾種低親和力相互作用的協(xié)同增強(qiáng)來實現(xiàn)結(jié)合(親合力是指，單個解離常數(shù)不是相加，而是相乘，即ko約l(T5M的相對弱的相互作用被2個獨立的結(jié)合事件增加，以產(chǎn)生kD約1(T1GM的高親和力相互作用)。因而，可以說作為經(jīng)驗法則，單體抗原用于檢測IgG，而寡聚體/多聚體抗原用于檢測IgM。通過同或異雙功能交聯(lián)劑化學(xué)交聯(lián)單體抗原，可以實現(xiàn)抗原寡聚化或多聚化。通常，可以通過調(diào)節(jié)反應(yīng)條件(蛋白和交聯(lián)劑的濃度、pH、溫度、攪拌速率、反應(yīng)時間)來最優(yōu)化寡聚化或多聚化，這是非常耗時和費力的。盡管如此，在不同批次中可能得到不同的交聯(lián)度，這需要隨后的分級分離和/或校準(zhǔn)程序。此外，更高的交聯(lián)度經(jīng)常導(dǎo)致溶解度的降低，這可能導(dǎo)致試驗性能的問題。因而，需要發(fā)現(xiàn)改良的以確定的且可再現(xiàn)的方式提供多聚體抗原的方法。美國專利6,207,420描述了一種融合序列，其包含與靶異源肽或蛋白融合的具有至少90%預(yù)測的溶解度可能性的載體蛋白，包括大腸桿菌(五.co/z')蛋白。優(yōu)選地，異源肽或蛋白在細(xì)菌中表達(dá)時，通常不溶。WO03/000878描述了一種融合蛋白，其包含至少一個耙多肽和位于其上游的至少一個FKBP蛋白伴倡，所述FKBP蛋白伴倡選自FkpA、SlyD和觸發(fā)因子。靶多肽可以是哺乳動物基因產(chǎn)物或哺乳動物病原體基因產(chǎn)物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個方面涉及融合多肽，其包含(i)至少一個多聚化結(jié)構(gòu)域，和(ii)來自病原體的表位區(qū)段的多個拷貝。所述融合多肽分子能形成多聚體。多聚體包含多個經(jīng)由多聚化結(jié)構(gòu)域通過非共價相互作用結(jié)合到一起的單體亞基。多聚體可以通過例如在合適條件下溫育融合多肽分子來形成。本發(fā)明的融合多肽是遺傳融合體，其可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法大量和以可再現(xiàn)的質(zhì)量生產(chǎn)。融合多肽和由其形成的多聚體具有高穩(wěn)定性和溶解度，且因而在檢測由病原體感染產(chǎn)生的抗體的方法中是優(yōu)良的試驗抗原。優(yōu)選地，融合多肽用于測定IgM抗體，更優(yōu)選地用于差別化測定IgM抗體，最優(yōu)選地用于差別化測定在急性和/或原發(fā)感染中產(chǎn)生的早期IgM抗體。融合多肽可以攜帶報道基團(tuán)和/或捕獲基團(tuán)，且因而可以用作檢測和/或捕獲抗原。此外，融合多肽也適用作千擾消除劑。本發(fā)明的融合多肽分子優(yōu)選地包含l個或2個多聚化結(jié)構(gòu)域、更優(yōu)選1個多聚化結(jié)構(gòu)域。多聚化結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地位于融合多肽的N-和/或C-末端、更優(yōu)選N-末端。多聚化結(jié)構(gòu)域是支持單獨融合多肽分子多聚化的多肽序列，其中形成包含通過非共價相互作用結(jié)合到一起的多個單體亞基的多聚體。復(fù)合物的單體亞基是遺傳融合蛋白，其中所述單獨氨基酸殘基通過肽鍵相連。多聚體的單體亞基優(yōu)選地是相同的。例如，多聚化結(jié)構(gòu)域可以是二聚化結(jié)構(gòu)域，即支持2個亞基的非共價結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，支持3個亞基的非共價結(jié)合的三聚化結(jié)構(gòu)域，四聚化結(jié)構(gòu)域或甚至更高的多聚化結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，多聚化結(jié)構(gòu)域是二聚化結(jié)構(gòu)域、三聚化結(jié)構(gòu)域或四聚化結(jié)構(gòu)域。多聚化結(jié)構(gòu)域可以選自原核或真核蛋白伴侶，優(yōu)選不依賴于ATP的蛋白伴侶。多聚化結(jié)構(gòu)域的具體實例是來自大腸桿菌的蛋白FkpA、Skp和SecB或來自其它原生生物的它們的直向同源物。FkpA是來自大腸桿菌的不依賴于ATP的周質(zhì)二聚化蛋白伴侶。Skp是來自大腸桿菌的不依賴于ATP的周質(zhì)三聚化蛋白伴侶。SecB是來自大腸桿菌的不依賴于ATP的胞質(zhì)四聚化蛋白伴侶。其它合適的多聚化結(jié)構(gòu)域是來自真核或原核生物的熱激蛋白，例如Hsp25，即不依賴于ATP的真核胞質(zhì)/核寡聚體蛋白伴侶。其它合適的多聚化結(jié)構(gòu)域是MIP(巨噬細(xì)胞感染性增強(qiáng)劑)，在結(jié)構(gòu)上與FkpA相關(guān)的不依賴于ATP的二聚化蛋白伴侶。依賴于ATP的蛋白伴倡如GroEL(來自大腸桿菌的依賴于ATP的胞質(zhì)七聚化蛋白伴侶)或ClpB(來自大腸桿菌的依賴于ATP的六聚化蛋白伴倡)或ClpX也是合適的。此外，多聚化結(jié)構(gòu)域可以選自上述多肽的片段或變體，它們保留其形成多聚體的能力。本發(fā)明的融合多肽包含表位區(qū)段的多個拷貝。表位區(qū)段包含由抗體識別的氨基酸序列。因而，所述多肽包含識別各個表位的抗體的多個結(jié)合部位。優(yōu)選地，單獨表位區(qū)段的氨基酸序列是相同的或基本上相同的。但是，一個或多個表位區(qū)段可能是不同的，只要這些差異不會負(fù)面地影響待測抗體的識別即可。所述融合多肽包含表位區(qū)段的至少2個、優(yōu)選2-10個、更優(yōu)選2-6個和最優(yōu)選2、3、4、5或6個拷貝。少4個、更優(yōu)選i少6個和^^選至少/;拷貝。所述多聚體可以包含例如表位區(qū)段的最高達(dá)40個、優(yōu)選最高達(dá)30個和最優(yōu)選最高達(dá)25個拷貝。通常，所述融合多肽包括僅一個表位區(qū)段的多個拷貝。在該情況下，所述融合多肽具有一種抗體特異性。但是，在有些實施方案中，預(yù)見到所述融合多肽包含2個或更多個不同表位區(qū)段、優(yōu)選2個不同表位區(qū)段的多個拷貝。在該情況下，所述融合多肽適用于檢測幾種類型的抗體特異性。表位區(qū)段的長度通常是至少5個氨基酸，優(yōu)選至少6個氨基酸和更優(yōu)選至少8個氨基酸。表位區(qū)段的最大長度通常是100-120個氨基酸，優(yōu)選80個氨基酸和更優(yōu)選70個氨基酸。最優(yōu)選地，表位區(qū)段的長度是15-50個氨基酸。融合多肽的單獨表位區(qū)段可以被間隔序列隔開。間隔序列優(yōu)選地是與表位區(qū)段的來源病原生物異源的序列。為了實踐目的，間隔序列選自幾乎不在任何程序上妨礙該融合多肽作為測定抗體的試驗抗原的應(yīng)用的序列。這意味著，間隔序列對待測抗體是非免疫反應(yīng)性的。優(yōu)選地，間隔序列包含甘氨酸和/或絲氨酸殘基。尤其優(yōu)選的是聚甘氨酸間隔序列。間隔序列的長度優(yōu)選地是l-10個氨基酸、更優(yōu)選2-5個氨基酸且最優(yōu)選3或4個氨基酸。尤其優(yōu)選的是(Gly)3間隔序列。此外，在多聚化結(jié)構(gòu)域和表位區(qū)段之間可以存在間隔序列。該間隔序列可以具有例如1-100個氨基酸的長度。優(yōu)選地，該間隔序列與多聚化結(jié)構(gòu)域和表位區(qū)段異源。優(yōu)選地，間隔序列如上所述。融合多肽的表位區(qū)段是來自病原體的抗原序列，其能結(jié)合在病原體感染的生物的免疫反應(yīng)過程中產(chǎn)生的抗體。優(yōu)選地選擇表位序列，以被在感染的特定階段產(chǎn)生的抗體所識別，例如被早期感染狀態(tài)期間的抗體所優(yōu)先識別的"早期"表位，或在晚期感染狀態(tài)中優(yōu)先識別的"晚期"表位。在優(yōu)選的實施方案中，表位區(qū)段包含被所述病原體感染的早期和/或急性階段產(chǎn)生的抗體特異性識別的表位。在尤其優(yōu)選的實施方案中，表位區(qū)段包含被所述病原體原發(fā)感染的早期和/或急性階段產(chǎn)生的抗體特異性識別的表位。在另一個實施方案中，表位區(qū)段包含被所迷病原體感染的晚期階段或感染后產(chǎn)生的抗體特異性識別的表位。在另一個實施方案中，表位區(qū)段包含被所述病原體持續(xù)或復(fù)發(fā)性感染中產(chǎn)生的抗體特異性識別的表位。表位區(qū)段可以源自任何病毒、細(xì)菌或原生動物(protozoic)病原體，它能造成可檢測的免疫反應(yīng)，即作為感染的結(jié)果，產(chǎn)生抗體、尤其IgM抗體。例如，所述病原體選自(i)皰滲病毒例如人單純皰疹病毒1和2(HHV1和HHV2)、水痘-帶狀皰滲病毒(HHV3)、EB病毒(HHV4/EBV)或人巨細(xì)胞病毒(HHV5)和人皰滲病毒6、7和8;(ii)風(fēng)滲病毒；(iii)肝炎病毒例如甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV);(iv)副粘病毒例如麻滲病毒和腮腺炎病毒；(v)弓形蟲屬(Toxoplasma)生物和(vi)疏螺旋體屬(SoATe"a)生物。來自這些病原體的合適表位的實例，已經(jīng)在下面詳迷的許多文件中描迷。這些文件和其中引用的文獻(xiàn)在本文中引作參考。指示著早期感染的IgM分子的特異性檢測，在臨床上對人中的許多病毒、細(xì)菌和原生動物感染是重要的。皰滲病毒科(herpesviridae)，例如包含單純皰滲病毒1和2(HHV1、HHV2)、水痘-帶狀皰滲病毒(HHV3)、EB病毒(HHV4)、人巨細(xì)胞病毒(HHV5)和人皰滲病毒6、7和8。人巨細(xì)胞病毒(HHV5)在妊娠常規(guī)診斷中起關(guān)鍵作用當(dāng)沒有針對該病毒的體液或細(xì)胞免疫的生育婦女在妊娠前三個月期間經(jīng)歷原發(fā)感染時，它可以對胎兒造成毀壞性損害。通過表位繪圖，已經(jīng)在不同皰滲抗原中鑒別出了許多重要的免疫決定簇例如，Greijer等，J.Clin.Microbiol.(1999)37(1)，179-188總結(jié)了HCMV抗原ppl50、p52、gB和pp28中的單獨表位的抗體反應(yīng)性。Schoppel等，J.Infect.Dis.(1997)175(3),533-544描述了其它表位。至于單純皰疹病毒，已經(jīng)分別將優(yōu)勢免疫表位作圖在來自HSV-2的成熟糖蛋白G的序列552-578中(Marsden等，J.Med.Virol.(1998)56,79-84;Liljeqvist等，J.Gen.Virol.(1998)79，1215-1224)和來自HSV-l的糖蛋白Gl的序列112-127(Tunback等，J.Gen,Virol.(2000)81，1033-1040)。這些表位可以摻入本發(fā)明的融合多肽中。作為妊娠篩選中的參數(shù)起突出作用，鼠弓形蟲(7b;cop/flwwagow力/)和風(fēng)滲病毒以及人巨細(xì)胞病毒和單純皰疹病毒1型和2型構(gòu)成TORCH家族。這些病原體在妊娠前三個月對孕婦(缺少體液和細(xì)胞免疫)的原發(fā)感染，可能導(dǎo)致對胎兒的嚴(yán)重?fù)p害。這迫切需要區(qū)分原發(fā)和復(fù)發(fā)性感染的可靠的差別診斷。如上所述，在幾種HCMV抗原內(nèi)的免疫顯性決定簇從文獻(xiàn)中可獲知，例如來自ppl50的序列595-636和1011-1048、來自p52的序列266-293和295-312、來自糖蛋白B的序列792-809和60-81和來自pp28的序列15-45和130-160(Greijer等，同上)。類似地，已經(jīng)在來自風(fēng)滲病毒的免疫顯性包膜蛋白El上鑒別出了主要表位。例如，氨基酸243-286之間的區(qū)域含有3個中和表位，如Terry等(Terry等，Arch.Virol.(1988)98，189-197)所報道的。另一種中和El表位已經(jīng)在氨基酸213-239之間的區(qū)域表征(Mitchell等，J.Clin.Microbiol.(1992)30(7)，1841-1847)。已經(jīng)在第二種風(fēng)滲包膜蛋白E2上，鑒別出具有中和能力的至少一種優(yōu)勢免疫表位(Green&Dorsett，J.Virol(1986)57(3)，893-898)。免疫顯性的T-細(xì)胞表位和幾種線性B-細(xì)胞表位已經(jīng)被定位在E2區(qū)域31-105(McCarthy等，J.Virol.(1993)67(2),673-681;Wolinsky等,J.Virol.(1991)65,3986-3994)。這些表位可以摻入本發(fā)明的融合多肽中。已經(jīng)將來自鼠弓形蟲的幾種蛋白鑒別為免疫顯性抗原致密顆粒蛋白GRA1(p24)、GRA2(p28)、GRA4(p41)、GRA6(p32)、GRA7(p29)和GRA8(p35),表面4元原SAG1(p30)和SAG2(p22)，4奉狀體抗原ROP1(p66)和ROP2(p54)，基質(zhì)蛋白MAGI(p65)和微絲蛋白MIC3和MIC5(Pfrepper等，ClinDiagn.Lab.Immunol.(2005)12(8),977-982)。關(guān)于抗-弓形蟲屬IgM抗體的檢測，以前已經(jīng)提出了GRA7、GRA8和ROP1的組合(Aubert等,J.Clin.Microbiol.(2000)38:1144-U50)。這些表位可以摻入本發(fā)明的融合多肽中。血清學(xué)的另一個重要領(lǐng)域覆蓋了肝炎病毒例如HAV、HBV和HCV。的。例如，HBV核殼蛋白是慢性乙型肝炎中宿主免疫應(yīng)答^l主要靶:且已經(jīng)表征了幾種優(yōu)勢免疫表位。乙型肝炎表面抗原(HBsAg)上的重要B-細(xì)胞表位已經(jīng)被定位在氨基酸74-89、130-138(Salfeld等，J.Virol.(1989)63,798-808)和107-118(Colucci等，J.Immunol.(1988)141，4376-4380)。這些表位可以摻入本發(fā)明的融合多肽中。已經(jīng)表征了許多丙型肝炎抗原的優(yōu)勢免疫表位(總結(jié)在Carlos等，Clin.Immunol.(2004)111,22-27)。例如，已經(jīng)定義了核心(7-18)、E2(484-499)、NS3(1248-1265)和NS4(1767-1786)的免疫顯性區(qū)域的表位，以及來自E2HVR1基因型la(386-406)、E2HVR2基因型la(472-485)、E2HVR1基因型lb(386-406)和E2HVR2基因型lb(472-485)的高變區(qū)的表位。這些和其它HCV表位可以摻入本發(fā)明的融合多肽中，并應(yīng)證實可用于開發(fā)根據(jù)本發(fā)明的差別IgM免疫測定。其它重要的人病原體是麻疹病毒和腮腺炎病毒，它們二者都屬于副粘病毒科，且各自由6個結(jié)構(gòu)蛋白組成。麻滲病毒的核殼蛋白N是體液免疫應(yīng)答的主要靶，且針對N的B-細(xì)胞應(yīng)答在控制麻滲感染中是關(guān)鍵的。最近，將優(yōu)勢免疫表位作圖在氨基酸419和525之間的N抗原C-末端內(nèi)。具體地，線性表位可定位于440-448的序列內(nèi)(Zvirbliene等，Arch.Virol.(2007)152，25-39)。類似地，來自肥腺炎病毒的核衣殼結(jié)合的蛋白NP構(gòu)成主要抗原決定簇，且NP的重組變體表現(xiàn)出高抗原性，并非常適用于在腮腺炎血清學(xué)中特異性檢測IgM(Samuel等，J.Med.Virol.(2002)66,123-130)。疏螺旋體屬(布氏疏螺旋體(及、嘎氏疏螺旋體(及gan'm'O、阿氏疏螺旋體()的免疫診斷引起了日益增長的興趣，這是因為該螺旋體的無情傳播。由于尾隨顯著的氣候變化的即將到來的暖冬，假定疏螺旋體屬的影響在不久的將來甚至?xí)黾痈?。已?jīng)描述了布氏疏螺旋體VlsE抗原的免疫顯性保守區(qū)，它非常適用于靈敏的且特異性的血清診斷(Liang等，J.Clin.Microbiol.(1999)37(12),3990-3996)。所謂的IR6或C6區(qū)域(Liang&Philipp,Infect.Immun.(1999)67,6702-6706;Liang等，J.Immunol.(1999)163(10)5566-5573)包含不變的26氨基酸區(qū)段，它可以摻入本發(fā)明的融合多肽中。所述融合多肽優(yōu)選地在檢測樣品中的抗體、尤其IgM抗體的方法中用作試驗試劑。為此目的，融合蛋白可以攜帶報道和/或偶聯(lián)基團(tuán)。合適的報道基團(tuán)的實例是通過視覺手段可檢測的基團(tuán)，例如焚光基團(tuán)，發(fā)光基團(tuán)，例如化學(xué)發(fā)光基團(tuán)，或微?；鶊F(tuán)例如金屬，例如金或膠乳粒子。當(dāng)然，其它報道基團(tuán)例如酶基團(tuán)、放射性基團(tuán)、半抗原基團(tuán)等也是合適的。特別優(yōu)選的是電致化學(xué)發(fā)光報道基團(tuán)，尤其釕基團(tuán)，例如釕(聯(lián)吡啶)3或釕(菲咯啉)3基團(tuán)。尤其優(yōu)選的也是半抗原報道基團(tuán)，例如洋地黃毒香基團(tuán)，其可以用抗-半抗原抗體例如抗-洋地黃毒苷抗體檢測。在另一個實施方案中，所述融合多肽可以攜帶至少一個偶聯(lián)基團(tuán)。偶聯(lián)基團(tuán)是用于將融合多肽偶聯(lián)到其它化合物或物質(zhì)(例如固相或上面定義的報道基團(tuán))上的基團(tuán)。偶聯(lián)基團(tuán)可以是用于共價偶聯(lián)或非共價偶聯(lián)的基團(tuán)。優(yōu)選地，偶聯(lián)基團(tuán)是特異性結(jié)合對的第一配偶體，它與結(jié)合對的第二配偶體特異性地相互作用。優(yōu)選的結(jié)合對是生物素/抗生物素蛋白、生物素/鏈霉抗生物素蛋白、生物素/抗生物素抗體、半抗原/抗-半抗原抗體和碳水化合物/凝集素。優(yōu)選地，偶聯(lián)基團(tuán)是生物素基團(tuán)，包括生物素衍生物，即結(jié)構(gòu)上與生物素相關(guān)的化合物，其保持結(jié)合鏈霉抗生物素蛋白和/或抗生物素蛋白的能力。根據(jù)常規(guī)方式，可以將融合多肽結(jié)合到報道和/或偶聯(lián)基團(tuán)上。例如，可以制備包含報道和/或偶聯(lián)基團(tuán)的綴合試劑。這些試劑還可以包含能與多肽上存在的基團(tuán)反應(yīng)的基團(tuán)，例如羥基、氨基、羧基和/或硫代基團(tuán)。偶聯(lián)基團(tuán)的具體實例是活性酯基團(tuán)，例如N-羥基琥珀酰亞胺基團(tuán)或馬來酰亞胺基團(tuán)。本發(fā)明還涉及編碼上述融合多肽的核酸分子。所述核酸分子優(yōu)選地是DNA分子。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，優(yōu)選地編碼單獨表位區(qū)段(它們優(yōu)選地在氨基酸水平是相同的)的部分具有在遺傳密碼簡并范圍內(nèi)的不同核苷酸序列，其中使用編碼相同氨基酸的不同核苷酸三聯(lián)體密碼子。更優(yōu)選地，編碼單獨相同表位區(qū)段的每個部分具有不同于其它部分的核苷酸序列。另外，本發(fā)明涉及表達(dá)栽體，其包含至少一個可操作地連接到表達(dá)控制序列上的上述核酸分子。所述表達(dá)栽體可以是原核或真核載體，其另外包含用于在各自宿主細(xì)胞中維持和繁殖的遺傳元件，例如復(fù)制起點和/或選擇標(biāo)記基因。所述表達(dá)控制序列可以是原核或真核表達(dá)控制序列，其可以是組成型或誘導(dǎo)型的。選擇表達(dá)控制序列，以允許在所需宿主細(xì)胞中有效表達(dá)。合適的表達(dá)栽體和表達(dá)控制序列的實例是技術(shù)人員已知的，且記栽在標(biāo)準(zhǔn)教科書中，例如Sambrook等，MolecularCloning-ALaboratoryManual(1989)，ColdSpringHarbourPress,或可商業(yè)上得到。另外，本發(fā)明涉及用上述核酸分子或表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，例如革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌，或真核細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以用于上述融合多肽的重組制備。優(yōu)選地，重組生產(chǎn)包含下述步驟(i)提供上述的宿主細(xì)胞，(ii)在表達(dá)融合多肽的條件下，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，和(iii)分離所述融合多肽。如上所述，本發(fā)明的融合多肽優(yōu)選地用作檢測樣品中的抗體的方法中的對企測試劑。所述抗體優(yōu)選是IgM抗體。更優(yōu)選地，；險測包含IgM抗體的差別化測定。在尤其優(yōu)選的實施方案中，抗體是在感染、尤其病原體原發(fā)感染的早期或急性階段中產(chǎn)生的IgM抗體。在另一個實施方案中，所述融合多肽可以在檢測樣品中的抗體的方法中用作干擾消除試劑。在該實施方案中，抗體優(yōu)選是IgG抗體。本發(fā)明也涉及用于檢測樣品中的抗體的試驗試劑試劑盒，其包含至少一種融合多肽和其它試驗組分。所述試驗試劑可以包含含有單一類型表位的單一融合多肽，或含有2種或更多種不同類型表位的單一融合多肽，或含有單一類型表位或2種或更多種不同類型表位的2種或更多種融合多肽。本發(fā)明的融合多肽可以是檢測試劑或干擾消除試劑。如果融合多肽是檢測試劑，則它優(yōu)選包含如上所述的報道和/或偶聯(lián)基團(tuán)。如果融合多肽是干擾消除試劑，則它優(yōu)選不包含任何報道基團(tuán)。所述干擾消除試劑的特征在于，它的有效表位濃度或密度不同于檢測試劑的有效表位濃度。優(yōu)選地，干擾消除試劑的表位濃度或表位密度低于檢測試劑的表位濃度或表位密度。本發(fā)明也涉及檢測樣品中針對病原生物的抗體的方法，其包含下述步驟(a)溫育所述樣品和包含至少一種上述融合多肽和其它試驗組分的試驗試劑，和(b)通過評價樣品組分與試驗試劑的反應(yīng)，測定所述抗體在所述樣品中的存在和/或濃度。所述試驗試劑優(yōu)選包含檢測試劑和至少一種干擾消除試劑，且步驟(b)包含測定所需樣品組分(即待測抗體類型)與檢測試劑的反應(yīng)，其中用至少一種干擾消除試劑，捕獲不需要的樣品組分，例如不同類別的抗體，例如無關(guān)的感染階段特有的IgG和/或IgM抗體。在優(yōu)選的實施方案中，待測抗體是IgM抗體，更優(yōu)選在感染、尤其原發(fā)感染的早期和/或急性階段中產(chǎn)生的IgM抗體。在該情況下，試驗試劑優(yōu)選還包含用于捕獲IgG抗體的干擾消除試劑，和/或用于捕獲在感染晚期和/或復(fù)發(fā)性感染中產(chǎn)生的IgM抗體的干擾消除試劑，其中所述干擾消除試劑不攜帶報道基團(tuán)。所述干擾消除試劑的特征在于，它的有效表位濃度或密度不同于檢測試劑的有效表位濃度或密度。在提供^r測試劑來差別化檢測在感染的早期和/或急性階段產(chǎn)生的IgM抗體的情況下，干擾消除試劑的有效表位濃度或密度更低。例如，千擾消除試劑的表位濃度或密度不應(yīng)當(dāng)超過檢測試劑表位密度的50%。優(yōu)選地，將樣品與一種或多種干擾消除試劑預(yù)溫育，然后接觸檢測試劑。IgG干擾消除試劑的實例是抗原，包括含有單體表位的片段。在優(yōu)選的實施方案中，IgG干擾消除試劑是融合多肽，其包含單體蛋白伴侶結(jié)構(gòu)域(例如來自大腸桿菌的SlyD)和來自病原體的包含表位的片段的單個拷貝。在IgG干擾消除試劑中存在的表位可以與檢測試劑中的表位相同。用于捕獲并從而猝滅晚期IgM抗體的干擾消除試劑的實例是，包含多個表位的多聚體抗原。但是，在該實施方案中，干擾消除試劑包含比檢測試劑更少數(shù)目的表位。優(yōu)選地，干擾消除試劑包含至少2個表位和最高達(dá)各個檢測試劑表位的半數(shù)。令人驚奇地，發(fā)現(xiàn)這樣的多聚體干擾消除試劑能捕獲并從而猝滅晚期IgM抗體，發(fā)現(xiàn)它們具有比待測早期抗體更高的對表位的親和力，且對所需早期IgM抗體的檢測沒有顯著的負(fù)面作用。因而，例如，IgM干擾消除試劑可以包含表位的2-6個、例如2、3、4或6個拷貝，而早期IgM檢測試劑可以包含含有表位的片段的至少8個、例如至少12或16個拷貝。干擾消除試劑可以是例如，包含單體蛋白伴侶結(jié)構(gòu)域例如SlyD和多個表位的融合多肽，或包含多聚化結(jié)構(gòu)域和單個表位或2個表位拷貝的融合多肽。在IgM千擾消除試劑中存在的表位優(yōu)選可與檢測試劑中的表位相同。本發(fā)明的方法優(yōu)選作為雙抗原夾心試驗來實現(xiàn)，其中所述試驗試劑包含2種如上所述的融合多肽，其中所述第一種融合多肽攜帶報道基團(tuán)或攜帶可以結(jié)合到報道基團(tuán)上的偶聯(lián)基團(tuán)。第二種融合多肽結(jié)合在固相上，或攜帶用于固定化到固相上的偶聯(lián)基團(tuán)。在該實施方案中，通過用第一種和第二種融合多肽形成復(fù)合物，并檢測所述固相上的所述復(fù)合物，測定抗體分析物。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法可以作為間接試驗來實現(xiàn)，其中所述試驗試劑包含一種融合多肽，其攜帶用于固定化到固相上的偶聯(lián)基團(tuán)和識別待測抗體類別(例如抗-人IgM抗體)的受體，其中所述受體攜帶報道基團(tuán)，且其中通過在固相上用融合多肽和受體形成復(fù)合物來測定抗體。或者，該間接試驗可以包含使用固定化的或可固定化的受體和包含報道基團(tuán)的融合多肽。如上所述，本發(fā)明允許差別診斷IgM抗體。因而，另一個實施方案涉及特異性測定在感染晚期和/或復(fù)發(fā)性感染中產(chǎn)生的IgM抗體。在該實施方案中，檢測試劑包含至少一種具有上迷低表位密度的多聚體抗原，例如優(yōu)選地包含2-6個、例如2、3、4或6個表位拷貝的融合多肽，其可能適用作"早期"IgM抗體試驗中的干擾消除試劑，但是攜帶報道和/或偶聯(lián)基團(tuán)。另外，該試驗優(yōu)選包含捕獲如上所迷IgG抗體的干擾消除試劑和/或捕獲在感染早期階段、尤其原發(fā)和/或急性感染早期階段中產(chǎn)生的IgM抗體的干擾消除試劑。優(yōu)選地，"早期"IgM抗體的千擾消除試劑對應(yīng)著用于測定"早期"IgM抗體、但是沒有報道基團(tuán)的試驗試劑?；蛘?，有差別的IgM測定可以通過差別分析來實現(xiàn)，即在有僅檢測一類IgM抗體(例如"早期"抗體)的試驗試劑存在下的第一個試驗和使用檢測所有IgM抗體的試驗試劑的第二個試驗。在另一個實施方案中，待測抗體是IgG抗體。在該情況下，檢測試劑是單體抗原，例如上述的單體融合蛋白。另外，試驗試劑包含用于捕獲IgM抗體的干擾消除試劑，它是包含如上所述的本發(fā)明融合多肽復(fù)合物的多聚體抗原，其中每個融合多肽包含多聚化結(jié)構(gòu)域和多個表位拷貝。干擾消除試劑優(yōu)選不含有報道基團(tuán)。本發(fā)明的另一個方面涉及差別化檢測樣品中的IgM抗體的方法，其中所述樣品可以包含選自干擾IgM抗體和/或干擾IgG抗體的千擾抗體。根椐該方法，使用包含多個抗原的試驗試劑，所迷抗原即包含待測抗體可以結(jié)合的多個表位拷貝的抗原。優(yōu)選地，試驗抗原包含報道基團(tuán)。本發(fā)明的方法基于使用具有預(yù)選的有效表位密度和/或濃度的多聚體試驗抗原，它適合待測的IgM抗體類型。試驗抗原優(yōu)選地與干擾消除試劑相組合，所迷干擾消除試劑適合消除不需要的IgM抗體類型與試驗抗原的結(jié)合。試驗抗原的有效表位密度或濃度適合待測IgM抗體的類型，例如在感染、優(yōu)選原發(fā)感染的早期或急性階段中產(chǎn)生的IgM抗體，或者在感染晚期產(chǎn)生的IgM抗體，在感染后產(chǎn)生的IgM抗體和/或在持續(xù)或復(fù)發(fā)性感染中產(chǎn)生的IgM抗體。優(yōu)選地，差別化IgM抗體檢測在有至少一種干擾消除試劑存在下進(jìn)行，其可以包含特異性結(jié)合干擾IgM抗體的抗原和/或特異性結(jié)合千擾IgG抗體的抗原。在優(yōu)選的實施方案中，所述方法包含下迷步驟(a)溫育所迷樣品和試驗試劑，所述試驗試劑包含(i)至少一個特異性結(jié)合IgM抗體的受體Rl，(ii)至少一個特異性結(jié)合要差別化檢測的IgM抗體的受體R2,其中R2攜帶報道基團(tuán)，(iii)任選地，至少一個特異性結(jié)合干擾IgM抗體的受體R3，和(iv)任選地，特異性結(jié)合IgG抗體的受體R4，(b)允許形成下迷復(fù)合物(i)包含R1、所述要差別化檢測的IgM抗體和R2的復(fù)合物，所迷復(fù)合物攜帶報道基團(tuán)，(ii)任選地，包含R3和所述干擾IgM抗體的復(fù)合物，從而消除所述干擾IgM抗體與R2的干擾結(jié)合，(iii)任選地，包含R4和所迷干擾IgG抗體的復(fù)合物，從而消除所述干擾IgG抗體與R2的干擾結(jié)合，和(c)測定通過R2結(jié)合到所迷要差別化檢測的IgM抗體上的所迷報道基團(tuán)，作為所迷樣品中所述IgM抗體的度量。所述試驗可以以雙抗原夾心測定形式或如上所述的間接形式進(jìn)行。在雙抗原夾心形式中，受體Rl可以是多聚體抗原，其特異性結(jié)合待測IgM抗體。在間接試驗形式中，受體Rl可以是特異性結(jié)合任意IgM、尤其樣品中的任意人IgM的受體，例如抗-人IgM抗體。優(yōu)選地，在固相上檢測所需的IgM抗體類型的結(jié)合。為此目的，受體R1優(yōu)選地攜帶用于固定化到固相上的偶聯(lián)基團(tuán)，例如如上所述的偶聯(lián)基團(tuán)，優(yōu)選生物素。標(biāo)記的受體R2的報道基團(tuán)是如上所述的報道基團(tuán)，優(yōu)選電致化學(xué)發(fā)光基團(tuán)。當(dāng)使用干擾消除試劑即受體R3和/或R4時，它們優(yōu)選地與樣品預(yù)溫育，然后加入受體R1和/或R2。IgG干擾消除受體R4優(yōu)選地是單體受體，即包含單個表位拷貝的抗原。試驗受體R2和IgM干擾消除受體R3是多聚體受體，即包含多個表位拷貝的抗原。但是，R2和R3具有不同的有效表位密度或濃度，且因而優(yōu)先結(jié)合不同類型的IgM抗體。關(guān)于在感染、優(yōu)選原發(fā)感染的早期或急性階段產(chǎn)生的IgM抗體的差別化測定，標(biāo)記的受體R2可以包含例如至少6個、優(yōu)選至少8個和更優(yōu)選至少12個由待測IgM抗體識別的表位拷貝，最高達(dá)40個、優(yōu)選最高達(dá)30個和最優(yōu)選最高達(dá)25個表位拷貝。與試驗受體R2的表位密度或濃度相比，對"晚期"IgM抗體特異性的干擾消除受體R3的有效表位密度或濃度，可以是例如至少1/2,優(yōu)選至少1/3,和最優(yōu)選至少1/4或甚至更低。在該實施方案中，干擾消除受體R3可以包含2-8個、優(yōu)選3-6個表位拷貝。多聚體試驗受體R2優(yōu)選地是本發(fā)明第一個方面的上述融合多肽。多聚體干擾消除受體R3也可以是如上所述的融合多肽。但是，應(yīng)當(dāng)指出，在本發(fā)明的該實施方案中，也可以使用常規(guī)多聚體試驗抗原，例如通過同或異雙功能交聯(lián)劑化學(xué)交聯(lián)單體抗原或表位得到的多聚體抗原?；蛘?，多聚體抗原可以是載體分子，例如含有與其偶聯(lián)的肽表位序列的栽體多肽或多聚體肽，例如在Lee等(NatureBiotechnology23(2005),1517-1526)中所述的分支的多聚體肽，其內(nèi)容在本文中引作參考。本發(fā)明的另一個方面涉及用于差別化檢測樣品中針對病原體的IgM抗體的試驗試劑，其中所述樣品可以包含選自千擾IgM抗體和/或干擾IgG抗體的干擾抗體，其包含(i)至少一個特異性結(jié)合IgM抗體的受體Rl,(ii)至少一個特異性結(jié)合要差別化檢測的IgM抗體的受體R2，其中R2攜帶報道基團(tuán)，(iii)任選地，至少一個特異性結(jié)合干擾IgM抗體的受體R3，和(iv)任選地，特異性結(jié)合IgG抗體的受體R4。下面的附圖和實施例進(jìn)一步解釋了本發(fā)明。圖1:通過SDS-PAGE證明的Skp-p52-X4的純化。泳道1,來自Invitrogen的未染色的蛋白標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記12;泳道3,超量生產(chǎn)大腸桿菌林BL21/DE3的離液粗裂解物；泳道5,IMAC流通；泳道6,咪唑洗滌級分，泳道8，咪唑洗脫級分；泳道9,凝膠過濾(S叩erdex200)后的Skp-p52-X4。在方法部分所述的簡單的一步規(guī)程中，可以高得率地純化和重折疊Skp-p52-X4。圖2A-I:氨基酸序列(參考序列表)。具體實施方式序列表SEQIDNO.1:SlyD的氨基酸序列(AA1-165)SEQIDNO.2:FkpA的氨基酸序列(AA26-270)SEQIDNO.3:Skp的氨基酸序列(AA21-161)SEQIDNO.4:Skp-ppUL32-Xl的氨基酸序列(ppUL32=HCMVppl50，AA587-640)SEQIDNO.5:Skp-ppUL32-X4的氨基酸序列SEQIDNO.6:Skp-ppl50-Xl的氨基酸序列(ppl50=HCMVppl50,AA999-1048)SEQIDNO.7:Skp-ppl50-X4的氨基酸序列SEQIDNO.8:Skp-ppl50-Xl的氨基酸序列(p52=HCMVp52，AA254-293)SEQIDNO.9:Skp-p52的氨基酸序列，AA254-293實施例實施例l:融合多肽試驗試劑的生產(chǎn)1.材料和方法1.1.材料和試劑氯化胍(guanidinum-Cl)(GdmCl)購自NIGU(Waldkraiburg，德國)。Complete⑧無EDTA的蛋白酶抑制劑片劑、咪唑和EDTA購自RocheDiagnosticsGmbH(Mannheim,德國)，所有其它化學(xué)試劑都是分析級的，購自Merck(Darmstadt,德國)。超濾薄膜(YM10,YM30)購自Amicon(Danvers，MA，USA)、微量透析膜(VS/0.025|im)和超濾單元(biomaxultmfreefilterdevices)購自Millipore(Bedford,MA，USA)。用于過濾粗裂解物的硝酸纖維素和醋酸纖維素膜(1.2|Lim/0.45nm/0.2nm)購自Sartorius(G6ttingen,德國)。1.2表達(dá)盒的克隆從SwissProt(UniProt)數(shù)據(jù)庫得到Skp、FkpA和SlyD的序列(SkP:SwissProt登記號PI1457;FkpA:SwissProt登記號P45523;SlyD:SwissProt登記號P0A9K9)。通過PCR,從大腸桿菌林BL21(DE3)擴(kuò)增大腸桿菌Skp、FkpA和SlyD的基因，限制酶切后，連接進(jìn)pET24a表達(dá)栽體(Novagen，Madison,Wisconsin,USA)。為了防止通過二斬"建形成共價加合物，去除SlyD的富半胱氨酸的C末端部分(166-196)，且將截短的SlyD形式AA1-165(SEQIDNO.1)用作融合配偶體。為了確保靶分子的胞質(zhì)表達(dá)，省略了周質(zhì)蛋白伴侶FkpA和Skp的信號序列。因而，將FkpA形式AA26-270(SEQIDNO.2)和Skp形式AA21-16KSEQIDNO.3)用作融合多肽的模塊。如Scholz等(J.Mol.Biol.345(2005),1229-1241)所迷，設(shè)計融合蛋白的表達(dá)盒。使用QuikChange(Stratagene,LaJolla，USA)和標(biāo)準(zhǔn)的PCR技術(shù)來產(chǎn)生點突變、缺失和插入變體或限制位點。所有重組蛋白變體都含有C-末端六組氨酸標(biāo)簽，以促進(jìn)Ni-NTA-輔助的純化和重折疊。1.3融合蛋白變體的表達(dá)、純化和重折疊使用實際上相同的規(guī)程，純化所有多肽融合變體。在添加了卡那霉素(30pg/ml)的LB培養(yǎng)基中，在37'C培養(yǎng)攜帶特定pET24a表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞至OD6oo為1.5，且通過加入1mM異丙基-P-D-疏代半乳糖苦，誘導(dǎo)胞質(zhì)超表達(dá)。請導(dǎo)后3小時，通過離心(20分鐘，5000g)收獲細(xì)胞，冷凍，且在-20'C保藏。對于細(xì)胞裂解，將冷凍的沉淀重新懸浮于冷卻的50mM磷酸鈉pH8.0，7.0MGdmCl，5mM咪唑中，在水上攪拌懸浮液2小時，以完成細(xì)胞裂解。離心和過濾(硝酸纖維素膜，0.45iLim/0.2ium)后，將裂解物應(yīng)用于用包含5.0mMTCEP(三(2-羧乙基)膦)的裂解緩沖液平衡的Ni-NTA柱。使隨后的洗涂步驟適合各自的靶蛋白，且其范圍為溶于50mM磷酸鈉pH8.0，7.0MGdmCl，5.0mMTCEP中的10-25mM咪唑(SlyD和FkpA融合蛋白)至30mM咪唑(Skp融合蛋白)。應(yīng)用至少10-15體積的洗滌緩沖液。然后，將GdmCl溶液替換為50mM磷酸鈉pH7.8，100mMNaCl,10mM咪唑，5.0mMTCEP,以談導(dǎo)基質(zhì)結(jié)合的蛋白的構(gòu)象重折疊。為了避免共純化蛋白酶的再活化，將蛋白酶抑制劑混合物(cocktail)(Complete無EDTA，Roche)包含在重折疊緩沖液中。在過夜反應(yīng)中，應(yīng)用共15-20柱體積的重折疊緩沖液。然后，通過用3-5柱體積的50mM磷酸鈉pH7.8，100mMNaCl，40mM咪唑洗滌，取出TCEP和Complete戀無EDTA的抑制劑混合物。然后，用在相同緩沖液中的250mM咪唑，洗脫天然蛋白。通過Schagger和vonJagow(Anal.Biochem.166(1987)，368-379)所述的Tricine-SDS-PAGE，評判含有蛋白的級分的純度，并合并。最后，3t蛋白進(jìn)4亍大小4非阻層片斤(SuperdexHiLoad，AmershamPharmacia),合并含有蛋白的級分，且在Amiconcell(YM10)中濃縮。生產(chǎn)了下述Skp融合多肽Skp-ppUL32-Xl(SEQIDNO.4)和Skp-ppUL32-X4(SEQIDNO.5)這些融合多肽包含Skp融合模塊和人巨細(xì)胞病毒(HMCV)表位ppUL32的1個(XI)或4個(X4)拷貝。該表位對應(yīng)著HCMV大結(jié)構(gòu)磷蛋白ppl50(UniprotIDP08318)的氨基酸587-640。Skp-ppl50-Xl(SEQIDNO.6)和Skp-pp150-X4(SEQIDNO.7)這些融合多肽包含Skp融合模塊和HMCVppl50表位的l個(XI)或4個(X4)拷貝，該表位對應(yīng)著HCMVpp"0的氨基酸999-1048。Skp-p52國Xl(SEQIDNO.8)和Skp-p52-X4(SEQIDNO.9)這些融合多肽包含Skp融合模塊和HMCVp52表位的1個(XI)或4個(X4)拷貝，該表位對應(yīng)著HCMV聚合酶輔助蛋白p52(UniprotIDP16790)的氨基酸254-293。1.4分光鏡測量使用UvikonXL雙光束分光光度計，進(jìn)行蛋白濃度測量。使用Pace等(ProteinSci.4(1995)，2411-2423)所迷的程序，測定摩爾消光系數(shù)(￡280)。1.5釕部分與融合蛋白的偶聯(lián)用N-羥基-琥珀酰亞胺激活的釕標(biāo)記，在約10mg/ml的蛋白濃度，修飾融合蛋白的賴氨酸s-氨基。依賴于各自融合蛋白，標(biāo)記蛋白摩爾比范圍是2:1至7:1。反應(yīng)緩沖液是150mM磷酸鉀(pH8.0),50mM氯化鉀，ltnMEDTA。反應(yīng)在室溫進(jìn)行10分鐘，且通過加入緩沖的L-賴氨酸至終濃度10mM,終止反應(yīng)。為了避免標(biāo)記的水解滅活，在無水DMSO(seccosolvquality,Merck,德國)中制備各自儲備溶液。研究的所有融合蛋白都良好耐受在反應(yīng)緩沖液中最高達(dá)20%的DMSO濃度。偶聯(lián)反應(yīng)后，通過使粗蛋白綴合物穿過凝膠過濾柱(Superdex200HiLoad),去除未反應(yīng)的游離標(biāo)記和有才幾溶劑。1.6蛋白伴侶融合蛋白的免疫反應(yīng)性將蛋白伴侶融合模塊用于檢測針對來自HMCV的抗原p52和ppl50的IgM抗體，它們在發(fā)作CMV感染時在人血清中大量產(chǎn)生。使用ili-捕獲形式(即，捕獲總IgM集合，并通過特異性的抗-IgMIgG固定化到固相上)，在自動化的Elecsys2010分析儀中挑戰(zhàn)免疫反應(yīng)性。在Elecsys^免疫測定中的信號檢測基于電致化學(xué)發(fā)光。將生物素-綴合的IgM捕獲抗體固定化到鏈霉抗生物素蛋白-包被的磁珠表面上，而信號傳遞抗原攜帶絡(luò)合的釕陽離子作為發(fā)光部分。在有抗-p52/抗-ppl50IgM抗體存在下，生色的釕絡(luò)合物被橋接在固相上，并在鉑電極激發(fā)后發(fā)出620nm光。信號輸出按任意的光單位計算。就它們作為￡^03乂3@抗原的用途而言，濃縮研究中的可溶p52/ppl50融合蛋白，并用N-羥基-琥珀酰亞胺激活的釕部分修飾，如上面Scholz等(2005)所述。蛋白伴侶融合變體在免疫測定測量中的濃度是約20-100ng/ml。使用至少5份陰性血清作為對照。為了使假陽性結(jié)果最小化，將化學(xué)聚合的未標(biāo)記的蛋白伴侶模塊加入樣品中，作為抗干擾物質(zhì)。2.結(jié)果2.1高表達(dá)得率在BL21(DE3)大腸桿菌林中大量超表達(dá)Skp、FkpA、SlyD和它們的融合變體。由于高合成速率，靶蛋白作為內(nèi)含體部分地積累在大腸桿菌胞質(zhì)中。基質(zhì)偶聯(lián)的重折疊成為以非常高的得率使Skp、FkpA、SlyD和它們的融合變體復(fù)性的備選方法。基本上，復(fù)性規(guī)程遵循為SlyD融合蛋白開發(fā)的方法(Scholz等(2005)，同上；Scholz等,Biochemistry45(2006)，20-33)。在偶聯(lián)的純化和重折疊規(guī)程后，從1g大腸桿菌濕細(xì)胞可以得到超過20mg耙蛋白。作為實例，通過SDS-PAGE證明的Skp-p52-X4的純化如圖1所示。實施例2:CMVIgM試驗開發(fā)了測定針對CMV的IgM抗體的試^^。該試驗允許區(qū)分急性/早期原發(fā)感染階段和晚期感染階段或復(fù)發(fā)性感染。檢測試劑包含復(fù)合物，每個復(fù)合物包含3個單位的融合多肽，每個融合多肽包含三聚化結(jié)構(gòu)域Skp和4個用釕(聯(lián)吡啶)3(BPRu)標(biāo)記的CMV表位(UL32或150)。因而，檢測試劑的多聚體分子包含12個表位拷貝。該試驗在沒有或有干擾消除試劑存在下進(jìn)行，所述干擾消除試劑即單體IgG干擾消除試劑lyD-X，其中X是UL32或150表位，二聚體或四聚體IgM干擾消除試劑(FkpA-X)2和(FkpA-X2)2,其中FkpA是二聚化結(jié)構(gòu)域，且X是表位UL32或ppl50，和三聚體或六聚體IgM千擾消除試劑(Skp-X)3和(Skp-X2)3，其中Skp是三聚化結(jié)構(gòu)域，且X是UL32或ppl50表位。1.材料和方法1.1組分緩沖液B1變體1:50mMMES緩沖液pH6.5，150mMNaCl;1mMEDTA，0.1°/0甲基異p塞峻6同(methylisothiazolone)和oxypyrione,prolidocanol和0.2%牛血清清蛋白(BSA)1mg/L生物素化的單克隆Mab-抗人IgM。變體2:^口變體1+2mg/LSlyD-pp(UL32)xl和2mg/mlSlyD-pp(150)xl變體3:如變體1+2mg/LFkpA-pp(UL32)xl和2mg/mlFkpA-pp(150)xl變體4::i口變體1+2mg/LSkp-pp(UL32)xl和2mg/mlSkp-pp(150)xl緩沖液B250mMMES緩沖液pH6.5，150mMNaCl;1mMEDTA,0.10/。甲基異噻唑酮和oxypyrione,prolidocanol和0.2%牛血清清蛋白(BSA)。B2中的免疫組分釕化(mthenylated)的CMV抗原。40ng/mlSkp-(ppl50)x4-BPRu和40ng/mlSkp-(UL32)x4-BPRu2.Elecsys2010儀器上的試驗程序10fal稀釋的血清樣品(用ElecsysDiluentUniversal1:20稀釋)+75pi緩沖液Bl。溫育9分鐘時間后，加入75緩沖液B2和40pi鏈霉抗生物素蛋白包被的珠子。9分鐘后，將混合物運輸至測量室，并測量ECL信號。3.結(jié)果試驗結(jié)果如表1和2所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>4.結(jié)果分析對來自未感染的個體，來自患急性感染患者和感染后患者的血清，進(jìn)行基于所述^捕獲形式的免疫測定。在表1中總結(jié)了結(jié)果。第一列(變體1)闡明了在沒有任何干擾消除試劑或猝滅模塊下得到的信號。用CMV-陰性人血清得到的計數(shù)是約700，且在陰性和陽性血清之間存在清楚的區(qū)別。第二列(變體2)顯示了在有單體猝滅模塊SlyD-X存在下得到的信號。如殘余信號強(qiáng)度(按％計)所證實的，SlyD-X的猝滅作用對于急性血清和感染后血清均是可忽略的。這與期望相一致，因為SlyD-X作為單體不能有效地與多價IgM分子相互作用。第三列(變體3)顯示了在有二聚體猝滅模塊FkpA-X存在下得到的信號。殘余信號強(qiáng)度證實了可忽略的FkpA-X對急性血清的猝滅作用，和顯著的FkpA-X對感染后血清的猝滅作用。該發(fā)現(xiàn)反映了與SlyD-X相比，F(xiàn)kpA-X的更高的表位(X)密度。顯然，F(xiàn)kpA-X與來自CMV感染后的成熟IgM分子顯著地相互作用，但是它與來自急性CMV感染的未成熟的早期IgM分子相當(dāng)弱地相互作用。在倒數(shù)第二列(變體4)中，突出了三聚體干擾消除試劑Skp-X的猝滅作用。在急性血清中發(fā)現(xiàn)了有些信號猝滅，但是在感染后血清中觀察到高得多的信號猝滅。這指示著猝滅模塊Skp-X與早期和晚期IgM分子的相互作用。因為Skp-X與晚期IgM分子的相互作用遠(yuǎn)高于與早期IgM分子的相互作用，所以指示急性感染的早期IgM抗體的差別化檢測是可能的?？傊琒lyD-X、FkpA-X和Skp-X確實與針對表位X的IgM分子相互作用，從而猝滅信號n-捕獲測定，其中Skp-X4用作信號傳導(dǎo)抗原。相對猝滅效率按照SlyD-X<FkpA-X<Skp-X的次序遞增，這與有效表位密度相對應(yīng)。成熟的IgM分子(來自感染后)的猝滅效率高，且未成熟的IgM分子(來自急性感染)的猝滅效率相當(dāng)?shù)?。我們的發(fā)現(xiàn)使得能清楚地區(qū)分早期和晚期感染，例如病毒感染。通過使用標(biāo)記的具有高表位密度的檢測試劑例如Skp-X4檢測模塊(12個表位拷貝)和未標(biāo)記的具有更低SlyD-X(1個表位拷貝)、FkpA-X(2個表位拷貝)或Skp-X(3個表位拷貝)類型的表位密度的猝滅模塊，可以區(qū)分早期和晚期感染，這在臨床上是重要的。迄今為止，這樣的區(qū)分在不同IgM級分之間還是不可能的，但是已經(jīng)通過進(jìn)行IgG親合力試驗進(jìn)行了嘗試簡而言之，在沒有和有非變性濃度的離液劑例如脲或氯化胍存在下，檢測IgG。離液劑優(yōu)先降低未成熟的("早期")IgG分子的結(jié)合，但是它僅僅微弱影響成熟的、高親和力("晚期")IgG分子的結(jié)合性質(zhì)。在有和沒有離液劑存在下的信號高度比，產(chǎn)生高親和力(離液劑-抗性的)IgG分子的分?jǐn)?shù)。親合力試驗中高百分比反映了高親和力IgG分子的優(yōu)勢分?jǐn)?shù)，而低百分比反映了低親和力(早期)IgG分子的優(yōu)勢分?jǐn)?shù)。因而，親合力試驗中高百分比指示著晚期感染，而低百分比指示著早期感染。表1和2中的最后一列總結(jié)了急性和感染后血清的結(jié)果，它們進(jìn)行了商業(yè)的IgG親合力測定(RADIM)。結(jié)果清楚表明，急性血清表現(xiàn)出低殘余信號(<20%),而感染后血清表現(xiàn)出高殘余信號(>60%)。這些結(jié)果與本發(fā)明的猝滅方法非常一致。這是值得注意的，因為本發(fā)明的方法聚焦在IgM分子的差別化檢測，而親合力測定通常聚焦在IgG分子的差別化檢測。通過不同方法得到的信息是互補(bǔ)的未成熟的免疫球蛋白(伴隨著早期免疫應(yīng)答)導(dǎo)致IgG親合力測定中的高猝滅(最后一列)，但是導(dǎo)致本發(fā)明的Skp-X抑制測定中的相當(dāng)?shù)外?倒數(shù)第二列)。成熟的免疫球蛋白(伴隨著感染后或復(fù)發(fā)性感染)導(dǎo)致IgG親合力測定中的低猝滅(最后一列)，但是導(dǎo)致本發(fā)明的Skp-X抑制測定中的相當(dāng)高的猝滅。未成熟的免疫球蛋白(伴隨著急性或早期感染)導(dǎo)致IgG親合力測定中的高猝滅，但是導(dǎo)致本發(fā)明的Skp-X抑制測定中的低猝滅。因而，每當(dāng)區(qū)分感染的早期和晚期階段和檢測感染的早期階段是重要的時候，本發(fā)明的差別化檢測IgM分子的方法為診斷領(lǐng)域添加了有價值的信息。序列表<110>RocheDiagnosticsGmbHF.Hoffmann-LaRocheAG<120〉病原體原發(fā)感染的檢測<130〉39814PEP<140〉EP07008124<141〉2007-04-20<160>9<170>Patentlnversion3.3<210>1<211〉165<212>PRT<213>人工的<220><223>SlyD<220〉<221>MISC一FEATURE<222〉(1)..(165)<223>SlyD(1-165)<400〉1MetLysValAlaLysAspLeuValValSerLeuAlaTyrGinValArg151015ThrGluAspGlyValUuValAspGluSerProValSerAlaProLeu202530AspTyrLeuHisGlyHisGlySerLeulieSerGlyLeuGluThrAla354045LeuGluGlyHisGluValGlyAspLysPheAspValAlaValGlyAla505560AsnAspAlaTyrGlyGinTyrAspGluAsnLeuValGinArgValPro65707580LysAspValPheMetGlyValAspGluLeuGinValGlyMetArgPhe859095LeuAlaGluThrAspGinGlyProValProValGlulieThrAlaVal100105110GluAspAspHisValValValAspGlyAsnHisMetLeuAlaGlyGin115120125AsnLeuLysPheAsnValGluValValAlalieArgGluAlaThrGlu130135140GluGluLeuAlaHisGlyHisValHisGlyAlaHisAspHisHisHis145150155160AspHisAspHisAsp165<210〉2<211>245<212>PRT<213>人工的<220><223>FkpA<220><221>MISC一FEATURE<222>(1)..(245)<223〉FkpA(26-270)<400>2AlaGluAlaAlaLysProAlaThrAlaAlaAspSerLysAlaAlaPhe151015LysAsnAspAspGinLysSerAlaTyrAlaLeuGlyAlaSerLeuGly202530ArgTyrMetGluAsnSerLeuLysGluGinGluLysLeuGlylieLys354045LeuAspLysAspGinLeulieAlaGlyValGinAspAlaPheAlaAsp505560LysSerLysLeuSerAspGinGlulieGluGinThrLeuGinAlaPhe65707580GluAlaArgValLysSerSerAlaGinAlaLysMetGluLysAspAla859095AlaAspAsnGluAlaLysGlyLysGluTyrArgGluLysPheAlaLys100105110GluLysGlyValLysThrSerSerThrGlyLeuValTyrGinValVal115120125GluAlaGlyLysGlyGluAlaProLysAspSerAspThrValValVal130135140AsnTyrLysGlyThrLeulieAspGlyLysGluPheAspAsnSerTyr145150155160ThrArgGlyGluProLeuSerPheArgUuAspGlyVallieProGly165170175TrpThrGluGlyLeuLysAsnlieLysLysGlyGlyLyslieLysLeu180185190VallieProProGluLeuAlaTyrGlyLysAlaGlyValProGlylie195200205ProProAsnSerThrLeuValPheAspValGluLeuLeuAspValLys210215220ProAlaProLysAlaAspAlaLysProGluAlaAspAlaLysAlaAla225230235240AspSerAlaLysLys245<210〉3<211〉141<212〉PRT<213〉人工的<220〉<223〉Skp<220〉<221>MISC一FEATURE<222〉(1)..(141)<223〉Skp(21-161)〈400〉3AlaAspLyslieAlalieValAsnMetGlySerUuPheGinGinVal151015AlaGinLysThrGlyValSerAsnThrUuGluAsnGluPheLysGly202530ArgAlaSerGluLeuGinArgMetGluThrAspLeuGinAlaLysMet354045LysLysLeuGinSerMetLysAlaGlySerAspArgThrLysLeuGlu505560LysAspValMetAlaGinArgGinThrPheAlaGinLysAlaGinAla65707580PheGluGinAspArgAlaArgArgSerAsnGluGluArgGlyLysLeu859095ValThrArglieGinThrAlaValLysSerValAlaAsnSerGinAsp100105110lieAspLeuValValAspAlaAsnAlaValAlaTyrAsnSerSerAsp115120125ValLysAsplieThrAlaAspValLeuLysGinValLys130135140<210>4<211>230<212>PRT<213>人工的<220><223〉Skp-ppUL32-Xl<220><221>MISC一FEATURE<222〉(1)..(230)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage35</formula>GlySerGlyGlyGlyAlaGlyAlaGlyAlaAlalieLeuThrProThr165170175ProValAsnProSerThrAlaProAlaProAlaProThrProThrPhe180185190AlaGlyThrGinThrProValAsnGlyAsnSerProTrpAlaProThr195200205AlaProLeuProGlyAspMetAsnProAlaAsnGlyGlyGlyLeuGlu210215220HisHisHisHisHisHis225230<210>5<211>400<212>PRT<213〉人工的<220〉<223>Skp-ppUL32-X4<220〉<221>MISC—FEATURE<222〉(l)..(400)<223〉Skp-ppUL32-X4(ppUL32=ppl50,587-640)<400〉5MetAlaAspLyslieAlalieValAsnMetGlySerLeuPheGinGin151015ValAlaGinLysThrGlyValSerAsnThrLeuGluAsnGluPheArg202530GlyArgAlaSerGluLeuGinArgMetGluThrAspLeuGinAlaLys354045MetLysLysLeuGinSerMetLysAlaGlySerAspArgThrLysLeu505560GluLysAspValMetAlaGinArgGinThrPheAlaGinLysAlaGin65707580AlaPheGluGinAspArgAlaArgArgSerAsnGluGluArgGlyLys859095LeuValThrArglieGinThrAlaValLysSerValAlaAsnSerGin100105110AsplieAspLeuValValAspAlaAsnAlaValAlaTyrAsnSerSer115120125AspValLysAsplieThrAlaAspValLeuLysGinValLysGlyGly130135140GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGly145150155160GlySerGlyGlyGlyAlaGlyAlaGlyAlaAlalieLeuThrProThr165170175ProValAsnProSerThrAlaProAlaProAlaProThrProThrPhe180185190AlaGlyThrGinThrProValAsnGlyAsnSerProTrpAlaProThr195200205AlaProLeuProGlyAspMetAsnProAlaAsnGlyGlyGlyAlaGly210215220AlaGlyAlaAlalieLeuThrProThrProValAsnProSerThrAla225230235240ProAlaProAlaProProThrPheAlaGlyThrGinThrProValAsn245250255GlyAsnSerProTrpAlaProThrAlaProLeuProGlyAspMetAsn260265270ProAlaAsnGlyGlyGlyAlaGlyAlaGlyAlaAlalieLeuThrPro275280285ThrProValAsnProSerThrAlaProAlaProAlaProThrProThr290295300PheAlaGlyThrGinThrProValAsnGlyAsnSerProTrpAlaPro305310315320ThrAlaProLeuProGlyAspMetAsnProAlaAsnGlyGlyGlyAla325330335GlyAlaGlyAlaAlalieUuThrProThrProValAsnProSerThr340345350AlaProAlaProAlaProThrProThrPheAlaGlyThrGinThrPro355360365ValAsnGlyAsnSerProTrpAlaProThrAlaProLeuProGlyAsp370375380MetAsnProAlaAsnGlyGlyGlyLeuGluHisHisHisHisHisHis385390395400<210>6<211〉226<212>PRT<213>人工的〈220〉<223>Skp-ppl50-Xl<220><221〉MISC_FEATURE<222>(1)..(226)<223>Skp-ppl50-Xl(ppl50999-1048)<400>6MetAlaAspLyslieAlalieValAsnMetGlySerUuPheGinGin151015ValAlaGinLysThrGlyValSerAsnThrLeuGluAsnGluPheArg202530GlyArgAlaSerGluLeuGinArgMetGluThrAspLeuGinAlaLys354045MetLysLysLeuGinSerMetLysAlaGlySerAspArgThrLysLeu505560GluLysAspValMetAlaGinArgGinThrPheAlaGinLysAlaGin65707580AlaPheGluGinAspArgAlaArgArgSerAsnGluGluArgGlyLys859095LeuValThrArglieGinThrAlaValLysSerValAlaAsnSerGin100105110AsplieAspLeuValValAspAlaAsnAlaValAlaTyrAsnSerSer115120125AspValLysAsplieThrAlaAspValLeuLysGinValLysGlyGly130135140GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGly145150155160GlySerGlyGlyGlyMetLysThrVal/UaPheAspLeuSerSerPro165170175GinLysSerGlyTbrGlyProGinProGlySerAlaGlyMetGlyGly180185l恥AlaLysThrProSerAspAlaValGinAsnlieLeuGinLyslieGlu195200205LyslieLysAsnThrGluGluGlyGlyGlyLeuGluHisHisHisHis210215220HisHis225<210〉<211〉<212〉<213>7386PRT人工的<220〉<223>Skp-pp50-X4<220><221〉MISC—FEATURE<222〉(1)..(386)<223〉Skp-ppl50-X4(ppl50999-1048)<400>7MetAlaAspLyslieAlalieValAsnMetGlySerLeuPheGinGin151015ValAlaGinLysThrGlyValSerAsnThrLeuGluAsnGluPheArg202530GlyArgAlaSerGluLeuGinArgMetGluThrAspLeuGinAlaLys354045MetLysLysLeuGinSerMetLysAlaGlySerAspArgThrLysLeu505560GluLysAspValMetAlaGinArgGinThrPheAlaGinLysAlaGin65707580AlaPheGluGinAspArgAlaArgArgSerAsnGluGluArgGlyLys859095LeuValThrArglieGinThrAlaValLysSerValAlaAsnSerGin100105110AsplieAspLeuValValAspAlaAsnAlaValAlaTyrAsnSerSer115120125AspValLysAsplieThrAlaAspValUuLysGinValLysGlyGly130135140GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGly145150155160GlySerGlyGlyGlyMetLysThrValAlaPheAspUuSerSerPro165170175GinLysSerGlyThrGlyProGinProGlySerAlaGlyMetGlyGly180185190AlaLysThrProSerAspAlaValGinAsnlieLeuGinLyslieGlu195200205LyslieLysAsnThrGluGluGlyGlyGlyMetLysThrValAlaPhe210215220AspLeuSerSerProGinLysSerGlyThrGlyProGinProGlySer225230235240AlaGlyMetGlyGlyAlaLysThrProSerAspAlaValGinAsnlie245250255LeuGinLyslieGluLyslieLysAsnThrGluGluGlyGlyGlyMet260265270LysThrValAlaPheAspLeuSerSerProGinLysSerGlyThrGly275280285ProGinProGlySerAlaGlyMetGlyGlyAlaLysThrProSerAsp290295300AlaValGinAsnlieUuGinLyslieGluLyslieLysAsnThrGlu305310315320GluGlyGlyGlyMetLysThrValAlaPheAspLeuSerSerProGin325330335LysSerGlyThrGlyProGinProGlySerAlaGlyMetGlyGlyAla340345350LysThrProSerAspAlaValGinAsnlieLeuGinLyslieGluLys355360365lieLysAsnThrGluGluGlyGlyGlyLeuGluHisHisHisHisHis370375380HisHis385<210〉8<211>216<212>PRT<213>人工的<220><223>Skp-p52-XI<220〉<221>MISC一FEATURE<222>(1)..(216)<223〉Skp-p52-Xl(p52254-293)<400>8MetAlaAspLyslieAlalieValAsnMet.GlySerLeuPheGinGin151015ValAlaGinLysThrGlyValSerAsnThrLeuGluAsnGluPheArg202530GlyArgAlaSerGluLeuGinArgMetGluThrAspLeuGinAlaLys354045MetLysLysLeuGinSerMetLysAlaGlySerAspArgThrLysLeu505560GluLysAspValMetAlaGinArgGinThrPheAlaGinLysAlaGin65707580AlaPheGluGinAspArgAlaArgArgSerAsnGluGluArgGlyLys859095LeuValThrArglieGinThrAlaValLysSerValAlaAsnSerGin100105110AsplieAspLeuValValAspAlaAsnAlaValAlaTyrAsnSerSer115120125AspValLysAsplieThrAlaAspValUuLysGinValLysGlyGly130135140GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGly145150155160GlySerGlyGlyGlyValAlaSerArgAsnGlyLeuPheAlaValGlu165170175AsnPheLeuThrGluGluProPheGinArgGlyAspProPheAspLys180185190AsnTyrValGlyAsnSerGlyLysSerArgGlyGlyGlyGlyGlyGly195200205LeuGluHisHisHisHisHisHis210215<210><211><212〉<213>9345PRT人工的<220><223>Skp-p52-X4<220><221〉<222〉<223〉MISC一FEATURE(345)Skp-p52-X4(p52254-293)<400>9MetAlaAspLyslieAlalieValAsnMetGlySerUuPheGinGin151015ValAlaGinLysThrGlyValSerAsnThrUuGluAsnGluPheArg202530GlyArgAlaSerGluLeuGinArgMetGluThrAspLeuGinAlaLys354045MetLysLysLeuGinSerMetLysAlaGlySerAspArgThrLysLeu505560GluLysAspValMetAlaGinArgGinThrPheAlaGinLysAlaGin65707580AlaPheGluGinAspArgAlaArgArgSerAsnGluGluArgGlyLys859095LeuValThrArglieGinThrAlaValLysSerValAlaAsnSerGin100105110AsplieAspLeuValValAspAlaAsnAlaValAlaTyrAsnSerSer115120125AspValLysAsplieThrAlaAspValLeuLysGinValLysGlyGly130135140GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGly145150155160GlySerGlyGlyGlyValAlaSerArgAsnGlyLeuPheAlaValGlu165170175AsnPheLeuThrGluGluProPheGinArgGlyAspProPheAspLys180185190AsnTyrValGlyAsnSerGlyLysSerArgGlyGlyGlyGlyGlyGly195200205ValAlaSerArgAsnGlyLeuPheAlaValGluAsnPheUuThrGlu210215220GluProPheGinArgGlyAspProPheAspLysAsnTyrValGlyAsn225230235240SerGlyLysSerArgGlyGlyGlyGlyGlyGlyValAlaSerArgAsn245250255GlyLeuPheAlaValGluAsnPheLeuThrGluGluProPheGinArg260265270GlyAspProPheAspLysAsnTyrValGlyAsnSerGlyLysSerArg275280285GlyGlyGlyGlyGlyGlyValAlaSerArgAsnGlyLeuPheAlaVal290295300GluAsnPheLeuThrGluGluProPheGinArgGlyAspProPheAsp305310315320LysAsnTyrValGlyAsnSerGlyLysSerArgGlyGlyGlyGlyGly325330335GlyLeuGluHisHisHisHisHisHis34034權(quán)利要求1.融合多肽，其包含(i)至少一個多聚化結(jié)構(gòu)域，和(ii)來自病原體的表位區(qū)段的多個拷貝。2.權(quán)利要求1的多肽，其中所述多聚化結(jié)構(gòu)域是二聚化結(jié)構(gòu)域、三聚化結(jié)構(gòu)域或四聚化結(jié)構(gòu)域。3.權(quán)利要求1-2中任一項的多肽，其中所述多聚化結(jié)構(gòu)域是原核或真核蛋白伴侶，優(yōu)選不依賴于ATP的蛋白伴侶。4.權(quán)利要求1-3中任一項的多肽，其中所迷多聚化結(jié)構(gòu)域選自來自大腸桿菌的FkpA、Skp和SecB,或來自其它原核生物的直向同源物。5.權(quán)利要求1-4中任一項的多肽，其包含所述含有表位的片段的至少2個、優(yōu)選2-10個和更優(yōu)選2、3、4、5或6個拷貝。6.權(quán)利要求1-5中任一項的多肽，其中表位區(qū)段的長度是5-120、優(yōu)選15-50個氨基酸。7.權(quán)利要求1-6中任一項的多肽，其中所述表位區(qū)段被間隔序列隔開。8.權(quán)利要求7的多肽，其中所述間隔序列的長度是l-10個氨基酸，且優(yōu)選包含甘氨酸和/或絲氨酸殘基。9.權(quán)利要求1-8中任一項的多肽，其中所述表位區(qū)段包含被所迷病原體感染的早期或急性階段產(chǎn)生的抗體特異性識別的表位，尤其被所述病原體原發(fā)感染的早期或急性階段產(chǎn)生的抗體特異性識別的表位。10.權(quán)利要求1-8中任一項的多肽，其中所述表位區(qū)段包含被所述病原體感染的晚期階段或感染后產(chǎn)生的抗體特異性識別的表位。11.權(quán)利要求1-8中任一項的多肽，其中所述表位區(qū)段包含被所述病原體持續(xù)或復(fù)發(fā)性感染中產(chǎn)生的抗體特異性識別的表位。12.權(quán)利要求1-11中任一項的多肽，其中所迷包含表位的片段來自病毒、細(xì)菌或原生動物病原體。13.權(quán)利要求1-12中任一項的多肽，其中所述病原生物選自(i)皰滲病毒例如人單純皰滲病毒1和2(HHV1和HHV2)、水痘-帶狀皰滲病毒(HHV3)、EB病毒(HHV4/EBV)或人巨細(xì)胞病毒(HHV5)和人皰滲病毒6、7和8;(ii)風(fēng)滲病毒；(iii)肝炎病毒例如曱型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV);(iv)副粘病毒例如麻滲病毒和腮腺炎病毒；(v)弓形蟲屬生物和(vi)疏螺旋體屬生物。14.權(quán)利要求13的多肽，其中所迷病原體選自與妊娠危險有關(guān)的病原體，尤其人巨細(xì)胞病毒、鼠弓形蟲和風(fēng)滲病毒。15.權(quán)利要求1-14中任一項的多肽，其攜帶至少一個報道和/或偶聯(lián)基團(tuán)。16.權(quán)利要求15的多肽，其攜帶生物素偶聯(lián)基團(tuán)。17.權(quán)利要求15的多肽，其攜帶電致化學(xué)發(fā)光報道基團(tuán)，尤其釘報道基團(tuán)，或半抗原報道基團(tuán)，尤其洋地黃毒苷報道基團(tuán)。18.權(quán)利要求1-17中任一項的融合多肽，其作為多聚體存在。19.編碼權(quán)利要求1-17中任一項的多肽的核酸分子。20.權(quán)利要求19的核酸，其中編碼相同表位區(qū)段的其部分具有在遺傳密碼簡并范圍內(nèi)的不同核苷酸序列。21.表達(dá)載體，其包含與表達(dá)控制序列可操作地連接的至少一個權(quán)利要求19或20的核酸。22.用權(quán)利要求19或20的核酸分子或權(quán)利要求21的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。23.制備權(quán)利要求1-17中任一項的融合多肽的方法，其包含下述步驟(i)提供權(quán)利要求22的宿主細(xì)胞；(ii)在表達(dá)融合多肽的條件下，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，和(iii)回收所述融合多肽。24.制備權(quán)利要求18的多聚體融合多肽的方法，其包含在適合形成多聚體的條件下，結(jié)合多個單體融合多肽。25.權(quán)利要求1-18中任一項的融合多肽作為檢測試劑在檢測樣品中的抗體的方法中的用途。26.權(quán)利要求25的用途，其中所述抗體是IgM抗體。27.權(quán)利要求26的用途，其用于IgM抗體的差別化測定。28.權(quán)利要求26或27中任一項的用途，其中所述抗體是在病原體感染、尤其原發(fā)感染的早期或急性階段中產(chǎn)生的IgM抗體。29.權(quán)利要求1-18中任一項的融合多肽作為干擾消除試劑在檢測樣品中的抗體的方法中的用途。30.權(quán)利要求29的用途，其中所迷抗體是IgG抗體。31.用于檢測樣品中的抗體的試驗試劑試劑盒，其包含至少一種權(quán)利要求1-18中任一項的融合多肽和其它試驗組分。32.權(quán)利要求31的試驗試劑，其中所述融合多肽是檢測試劑。33.權(quán)利要求31的試驗試劑，其中所述融合多肽是干擾消除試劑。34.檢測樣品中針對病原體的抗體的方法，其包含下述步驟(i)溫育所述樣品和試驗試劑，所述試驗試劑包含至少一種權(quán)利要求1-18中任一項的融合多肽和其它試驗組分，和(H)通過評價樣品組分與所述試驗試劑的反應(yīng)，測定所迷抗體在所述樣品中的存在和/或濃度。35.權(quán)利要求34的方法，其中所述試驗試劑包含檢測試劑和至少一種千擾消除試劑；且步驟(ii)包含測定所需樣品組分與檢測試劑的反應(yīng)，其中用至少一種干擾消除試劑捕獲不需要的樣品組分。36.權(quán)利要求34或35的方法，其中所述待測抗體是在原發(fā)感染的早期或急性階段中產(chǎn)生的IgM抗體，且所述試驗試劑包含至少一種權(quán)利要求1-18中任一項的融合多肽，其攜帶報道和/或偶聯(lián)基團(tuán)。37.權(quán)利要求36的方法，其中所述試驗試劑還包含用于捕獲IgG抗體的干擾消除試劑，和/或用于捕獲在感染晚期和/或復(fù)發(fā)性感染中產(chǎn)生的IgM抗體的干擾消除試劑。38.權(quán)利要求34-37中任一項的方法，其中所迷試驗試劑包含攜帶報道基團(tuán)的第一種融合多肽和攜帶用于固定化到固相上的偶聯(lián)基團(tuán)的第二種融合多肽，且其中通過用第一種和第二種融合多肽形成復(fù)合物、并檢測所迷固相上的所述復(fù)合物，來測定抗體。39.權(quán)利要求34-37中任一項的方法，其中所迷試驗試劑包含攜帶用于固定化到固相上的偶聯(lián)基團(tuán)的融合多肽和攜帶報道基團(tuán)的識別待測抗體的受體，且其中通過用融合多肽和受體在所述固相上形成復(fù)合物，來測定抗體。40.權(quán)利要求34-37中任一項的方法，其中所述試驗試劑包含攜帶報道基團(tuán)的融合多肽和攜帶用于固定化到固相上的偶聯(lián)基團(tuán)的識別待測抗體的受體，且其中通過用融合多肽和受體在所述固相上形成復(fù)合物，來測定抗體。41.差別化檢測樣品中針對病原體的IgM抗體的方法，其中所述樣品可以包含選自千擾IgM抗體和/或干擾IgG抗體的干擾抗體，所述方法包含下述步驟U)溫育所述樣品和試驗試劑，所述試驗試劑包含(i)至少一個特異性結(jié)合IgM抗體的受體Rl，(ii)至少一個特異性結(jié)合要差別化檢測的IgM抗體的受體R2,其中R2攜帶報道基團(tuán)，(iii)任選地，至少一個特異性結(jié)合干擾IgM抗體的受體R3，和(iv)任選地，特異性結(jié)合IgG抗體的受體R4，(b)允許形成下述復(fù)合物(i)包含R1、所述要差別化檢測的IgM抗體和R2的復(fù)合物，所述復(fù)合物攜帶報道基團(tuán)，(ii)任選地，包含R3和所述千擾IgM抗體的復(fù)合物，從而消除所述干擾IgM抗體與R2的干擾結(jié)合，(iii)任選地，包含R4和所述千擾IgG抗體的復(fù)合物，從而消除所述干擾IgG抗體與R2的干擾結(jié)合，和(c)測定通過R2結(jié)合到所述要差別化;險測的IgM抗體上的所述報道基團(tuán)，作為所述樣品中所迷IgM抗體的度量。42.權(quán)利要求41的方法，其中所述受體R4是單體受體。43.權(quán)利要求41-42中任一項的方法，其中所述受體R2和R3是具有不同有效表位密度或濃度的多聚體受體。44.權(quán)利要求4卜43中任一項的方法，其中所述待測IgM抗體是在感染、優(yōu)選原發(fā)感染的早期或急性階段產(chǎn)生的IgM抗體，且其中所迷干擾IgM抗體是在感染晚期或感染后產(chǎn)生的IgM抗體，和/或在持續(xù)或復(fù)發(fā)性感染中產(chǎn)生的IgM抗體。45.權(quán)利要求44的方法，其中所述受體R2是多聚體受體，其包含待測IgM抗體識別的至少6個拷貝、優(yōu)選至少8個和更優(yōu)選至少12個表位拷貝。46.權(quán)利要求44或45的方法，其中所迷受體R3是多聚體受體，其有效表位密度或濃度為受體R2的表位密度或濃度的至少1/2。47.權(quán)利要求41-46中任一項的方法，其中所述受體R1攜帶用于固定化到固相上的偶聯(lián)基團(tuán)。48.權(quán)利要求41-46中任一項的方法，其中所述受體R3和R4如果存在則與樣品預(yù)溫育，然后加入受體R1和/或R2。49.權(quán)利要求41-48中任一項的方法，其中所述受體R2是權(quán)利要求1-18中任一項的融合多肽。50.用于差別化檢測樣品中針對病原體的IgM抗體的試驗試劑，其中所述樣品可以包含選自干擾IgM抗體和/或干擾IgG抗體的干擾抗體，其包含(i)至少一個特異性結(jié)合IgM抗體的受體Rl,(ii)至少一個特異性結(jié)合要差別化檢測的IgM抗體的受體R2,其中R2攜帶報道基團(tuán)，(iii)任選地，至少一個特異性結(jié)合千擾IgM抗體的受體R3，和(iv)任選地，特異性結(jié)合IgG抗體的受體R4。全文摘要本發(fā)明涉及病原體原發(fā)感染的檢測。本發(fā)明涉及適合用作病原體感染、尤其病原體原發(fā)感染的檢測中的試驗抗原的融合蛋白。另外，本發(fā)明涉及用于檢測和差別化測定抗體、尤其由病原生物感染產(chǎn)生的IgM抗體的方法。此外，提供了用于實施這些方法的試驗試劑。文檔編號C12N15/63GK101289513SQ200810091588公開日2008年10月22日申請日期2008年4月21日優(yōu)先權(quán)日2007年4月20日發(fā)明者C·肖爾茨,E·法茨,P·沙斯米特,U·斯米特申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司