專利名稱：：定性、定量檢測藍(lán)舌病毒的引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用分子生物學(xué)方法對病毒進(jìn)行定性、定量檢測的引物和探針，特別是涉及用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-timefluorescentquantificationPCR，real-timeFQPCR)技術(shù)對藍(lán)舌病毒進(jìn)行定性、定量檢測的引物和TaqMan探針。
背景技術(shù)：
：藍(lán)舌病是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)確認(rèn)的15種A類動(dòng)物疾病之一，受到了全世界有關(guān)國家的特別關(guān)注。藍(lán)舌病最早發(fā)生于南非(19世紀(jì)后期)，進(jìn)入20世紀(jì)后，該病在世界各地陸續(xù)發(fā)生或查出該病病毒。我國自1979年在云南師宗縣首次發(fā)生該病以來，又先后在其它地區(qū)多次發(fā)生。藍(lán)舌病毒(bluetonguevirus,BTV)是感染家養(yǎng)及野生反芻動(dòng)物的蟲媒病毒。BTV是呼腸孤病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)的代表成員，迄今已發(fā)現(xiàn)25個(gè)BTV血清型(DaviesFG，MuugaiJN，PiniA.VetMicrobiol1992;31:25-32)，其中在美國查出6個(gè)血清型(BTV2，10，11，13、17及24)，在我國査出1個(gè)血清型(BTV10)。BTV基因組含10個(gè)節(jié)段的雙鏈RNA(dsRNA)，按大中小分片段1-3為長片段，片段4-6為中長片段，片段7-10為短片段。該10個(gè)節(jié)段的dsRNA分別編碼7個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VPl、VP2、VP3、VP4、VP5、VP6、VP7)和3個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NS3)。其中NSl由片段6(segment6，S6)編碼翻譯，屬中長大小的dsRNA片段，是與BTV復(fù)制有關(guān)的一種非結(jié)構(gòu)蛋白。WangLF等的研究表明，NSl基因(又稱S6)在BTV血清群的10個(gè)節(jié)段基因中最為保守(WangLF，Diorh，0sburnBI.NucleicAcidRes1989;17:8002)。Jonathan等提出BTVNSl基因與其它環(huán)狀病毒屬交叉反應(yīng)最小(JonathanBK，GaryAG,DavidAA,KarlAA&KathryanMM，AmJVetRes,54(1993)2021)?？筛鶕?jù)發(fā)病癥狀、流行病學(xué)和病理剖檢變化對藍(lán)舌病進(jìn)行假定診斷，確診則必須依靠病毒的分離和鑒定或特異性血清學(xué)試驗(yàn)。國際通用的診斷方法是采用瓊脂免疫擴(kuò)散、熒光抗體或補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測特異性抗體。中和試驗(yàn)、競爭性ELISA、間接ELISA也可用于檢測特異性抗體。此外，PCR技術(shù)可用于該病毒的基因檢測。PCR技術(shù)作為新型的基因檢測手段，具有快速、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，已成為病毒檢測方法發(fā)展的必然趨勢。PCR技術(shù)自1989年開始應(yīng)用以來，不僅在分子生物學(xué)領(lǐng)域成為常規(guī)的方法和手段，而且在遺傳性疾病的診斷、病原體的檢測、法醫(yī)學(xué)標(biāo)本的鑒定等多方面得到了廣泛的應(yīng)用。并且該項(xiàng)技術(shù)不斷得到改進(jìn)。1996年，美國AppliedBiosystems公司推出了實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-timefluorescentquantificationPCR，real-timeFQPCR)技術(shù)，該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記來進(jìn)行定量，不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、無污染(無需使用溴化乙淀)、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)。該技術(shù)是將DNA探針連接熒光試劑，待此DNA探針與PCR產(chǎn)物結(jié)合后，通過檢測熒光光量，并用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行輔助分析，進(jìn)行量化計(jì)算，靈敏度為O.1%。定量PCR不僅可以應(yīng)用在基礎(chǔ)研究、臨床檢測，還可以在海關(guān)及食品衛(wèi)生檢疫方面發(fā)揮重要的作用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性熒光探針(TaqMan探針)，探針只與模板特異結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)位于兩條引物之間，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程。目前常用的Taqraan熒光探針為寡核苷酸，其5'端標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán)(R印orter，R)，如FAM、VIC等，3'端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)(Quencher,Q)，如TAMRA等。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，故檢測不到熒光；在PCR擴(kuò)增過程中，Taq酶的5'—3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)。在PCR擴(kuò)增過程中，每經(jīng)過一個(gè)PCR循環(huán)，熒光信號(hào)也和目的片段一樣，有一個(gè)同步指數(shù)增長的過程，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后檢測一次熒光強(qiáng)度，整個(gè)反應(yīng)結(jié)束后，便可得到一條擴(kuò)增曲線，由已知濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品的擴(kuò)增曲線可以得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線以及未知模板的擴(kuò)增曲線可對未知模板進(jìn)行定量分析。但是，目前尚沒有專門用于藍(lán)舌病毒基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù)，因?yàn)闆]有合適的引物和特異性熒光探針。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一對用于對藍(lán)舌病毒(BTV)進(jìn)行定性、定量檢測的引物。本發(fā)明所提供的引物，其上游引物具有序列表中的SEQIDNa:1，下游引物具有序列表中的SEQIDN2:2。將上游引物命名為P(NS1-1)，序列表中的SEQIDN2:1由21個(gè)堿基組成，該序列位于BTVNS1基因(又稱S6基因)自5，端第10-30堿基;將下游引物命名為P(NS1-2)，SEQIDNa:2由21個(gè)堿基組成，該序列為BTVNS1基因自5，端第110-130位堿基的反向互補(bǔ)序列。所述NS1基因指含有5'端非編碼區(qū)核苷酸序列的全基因。由上述引物衍生的引物序列也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述衍生序列是指在SEQIDNa:l和/或SEQIDNa:2的基礎(chǔ)上經(jīng)過一至十個(gè)堿基的取代、缺失或添加得到的引物序列。上述引物既適用于藍(lán)舌病毒各血清型的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測中，也可用于該病毒的常規(guī)PCR檢測技術(shù)中，其檢測的對象是BTV的NS1基因。若以待測樣品經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA為模板，在上述引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中有121bp大小的條帶，則樣品中含有BTV。本發(fā)明還提供了用于對藍(lán)舌病毒進(jìn)行定性、定量檢測的TaqMan探針。本發(fā)明所提供的TaqMan探針，可具有序列表中SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的DNA序列；所述探針為經(jīng)過熒光標(biāo)記的，其5'端標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)。所述報(bào)告熒光基團(tuán)可為FAM、VIC等，熒光淬滅基團(tuán)可為TAMRA、MGB等。為防止PCR擴(kuò)增時(shí)被延伸，所述探針的3'端要經(jīng)過磷酸化處理。將具有序列表中SEQIDNO:3的TaqMan探針命名為T叫ManProbel(NS1)，序列表中的SEQIDN2:3由25個(gè)堿基組成，該序列為BTVNS1基因自5'端第70-94位堿基的反向互補(bǔ)序列；將具有序列表中SEQIDNO:4的TaqMan探針命名為TaqManProbe2(NSl)，序列表中的SEQIDNa:4由23個(gè)堿基組成，該序列為BTVNS1基因自5，端第72-94位堿基。上述TaqMan探針序列的衍生序列也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述衍生序列是指在SEQIDNq:3或SEQIDNs:4的基礎(chǔ)上，在序列的5'端和/或3，端再添加、減少一個(gè)或多個(gè)堿基得到的序列。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種檢測藍(lán)舌病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測藍(lán)舌病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，可包括用于對藍(lán)舌病毒進(jìn)行定性、定量檢測的引物和TaqMan探針。本發(fā)明提供了用于對藍(lán)舌病毒進(jìn)行定性、定量檢測的引物和TaqMan探針，通過提取待測樣品的總RNA，并通過逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù)，可達(dá)到準(zhǔn)確定量待測標(biāo)本中藍(lán)舌病毒RNA的目的。本發(fā)明所提供的引物及探針可用于臨床及科研中對感染藍(lán)舌病的動(dòng)物中的藍(lán)舌病毒RNA進(jìn)行定性及定量分析，對判斷藍(lán)舌病的發(fā)生、復(fù)發(fā)，治療效果評價(jià)及病情的動(dòng)態(tài)觀察具有重要意義。本發(fā)明將在動(dòng)物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1為BTV-3、5、8、10、11、21、22、(A)樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖2為菌落PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖3為陽性克隆質(zhì)粒pGEM-T120的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖4A為不同稀釋度的pGEM-T120標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖4B為6種BTV血清型樣品的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖5為檢測BTV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線以及6種BTV血清型的樣品在標(biāo)準(zhǔn)曲線上的位點(diǎn)圖6為2種其它BTV血清型樣品的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所用引物均由三博公司合成，所用TaqMan探針由上海生工合成，所有序列測定工作均由華大公司完成。實(shí)施例l、用于對藍(lán)舌病毒(BTV)進(jìn)行定性、定量檢測的引物及TaqMan探針的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中8個(gè)血清型BTV的NSl基因序列，利用DNAStar軟件對該8個(gè)血清型BTV的NS1基因進(jìn)行序列比對，選取NS1基因5'端的最保守區(qū)域序列作為檢測序列。由于該8個(gè)血清型BTVNSl基因中有6個(gè)血清型BTVNSl基因序列(GenBankAccessionNo.AY462225、M97762、NC—006025、X15891、X56735、Y00422)包括較長的5，非編碼區(qū)序列，利用DNAStar軟件對該6個(gè)血清型/株BTVNSl基因序列進(jìn)行比對，然后根據(jù)比對結(jié)果設(shè)計(jì)引物及TaqMan探針，序列如下上游引物P(NS1-1):5，-GTTCTCTAGTTGGCAACCACC-3，(序列表中SEQIDNO:1)，Tm為57°C;下游引物P(NS1-2):5，-GTGACTGCAAGTCCATTGAGG-3，(序列表中SEQIDNO:2)，Tm為57°C。TaqManProbel(NSl):5，F(xiàn)AM-AGTTCTCGTGGCATTTGCGTAATCC-TAMRA3，(序列表中SEQIDNO:3)，Tm為67°C。TaqManProbe2(NSl):5，F(xiàn)AM-ATTACGCAAATGCCACGAGAACT-TAMRA3，(序列表中SEQIDNO:4)，Tm為62°C。將上游引物命名為P(NS1-1)，序列表中的SEQIDNa:1由21個(gè)堿基組成，該序列位于BTVNS1基因(又稱S6基因)自5'端第10-30堿基；將下游引物命名為P(NS1-2)，SEQIDNa:2由21個(gè)堿基組成，該序列為BTVNSl基因自5'端第110-130堿基的反向互補(bǔ)序列。所述NS1基因指含有5'端非編碼區(qū)核苷酸序列的全基因。將具有序列表中SEQIDNO:3的TaqMan探針命名為TaqManProbel(NS1)，序列表中的SEQIDN2:3由25個(gè)堿基組成，該序列為BTVNS1基因自5'端第70-94位堿基的反向互補(bǔ)序列。將具有序列表中SEQIDNO:4的TaqMan探針命名為TaqManProbe2(NS1)，序列表中的SEQIDN2:4由23個(gè)堿基組成，該序列為BTVNS1基因自5，端第72-94位堿基。將上述TaqMan探針的5，端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3，端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)TAMRA，并將探針的3'端進(jìn)行磷酸化處理。實(shí)施例2、用本發(fā)明的引物對藍(lán)舌病毒進(jìn)行BTV的常規(guī)PCR檢測1、BTV樣品的處理選用經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的BTV、血漿及組織中的8個(gè)血清型(分別為BTV3、BTV5、BTV8、BTVIO、BTVll、BTV21、BTV22、BTV(A)型)的BTV作為待測BTV樣品。用下述方法對經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的BTV樣品進(jìn)行處理先接種BTV至BHK-21細(xì)胞，在37'C的C02溫箱中培養(yǎng)至細(xì)胞病變達(dá)80%以上，然后在無菌條件下將病變細(xì)胞移入滅菌離心管中，8000rpm離心30min，在無菌條件下將上清移入另一離心管中暫置于室溫下，將細(xì)胞沉淀反復(fù)凍融三次后加入上清，吹打混勻，8000rpm離心30min，取上清用于BTVRNA的提取。血漿及組織中的BTV樣品無需進(jìn)行處理。2、BTVRNA的提取上述BTV樣品各取300u1，用Body-fluidviralDNA/ViralRNAMini-pr印試劑盒(V-Gene)并參照試劑盒說明書提取RNA。3、反轉(zhuǎn)錄分別以步驟2提取的不同BTV樣品的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成其cDNA，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為取BTVRNA9ul，加下游特異性引物P(NS1-2)2ul(50pg/ul)，混勻，97。C水浴5min，迅速置于冰水上5min，再在冰盒上加入M-MLV緩沖液4u1、dNTPs(2.5mMeach)4u1(TaKaRa)、M-MLVRT1u1(TaKaRa)、RNasin0.5u1(TaKaRa)，混勻，42。C反應(yīng)lh。4、常規(guī)PCR檢測分別以步驟3反轉(zhuǎn)錄合成的不同BTV樣品的cDNA為模板，在本發(fā)明引物P(NS1-1)和P(NS1-2)的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25ulPCR反應(yīng)體系為IOXPCR緩沖液2.5ul，d證s(2.5mMeach)2ul，P(NSl-l)O.5u1(50pg)，P(NS1—2)0.5u1(50pg)，cDNA5ul，Taq酶lul(TaKaRa)，ddH2013.5ul。PCR反應(yīng)條件為:先94°C5min;然后94°C45s，45°C45s，72°Clmin，共35個(gè)循環(huán)；最后72°C7min，4。C終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物各6u1進(jìn)行2.5X瓊脂糖凝膠電泳檢測(70V電泳30rain)，檢測結(jié)果如圖1所示(泳道M:MarkerDL2000，泳道A:BTV3，泳道B:BTV5，泳道C:BTV8，泳道D:BTVIO，泳道E:BTVll，泳道F:BTV21，泳道G:BTV22，泳道H:BTV(A))，結(jié)果經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的8個(gè)血清型的BTV樣品(BTV-3、5、8、10、11、21、22、(A))經(jīng)PCR擴(kuò)增均得到了121bp的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，表明本發(fā)明的引物可用于藍(lán)舌病毒的常規(guī)PCR檢測。實(shí)施例3、用本發(fā)明的引物及TaqMan探針進(jìn)行BTV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-1iraeFQPCR)檢測1、BTV的培養(yǎng)及處理選用經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的BTV作為待測BTV樣品，并用與實(shí)施例2中相同的方法對經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的BTV樣品進(jìn)行處理。2、BTVRNA的提取取步驟1獲得的BTV樣品300u1，用與實(shí)施例2中相同的方法提取RNA。3、反轉(zhuǎn)錄以步驟2提取的BTV樣品的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成其cDNA，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件與實(shí)施例2中相同。4、real-timeFQPCR標(biāo)準(zhǔn)品的制備(1)BTV-5的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收取實(shí)施例2獲得的檢測樣品BTV5的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物50u1，對其進(jìn)行2.5%瓊脂糖凝膠電泳(70V電泳30min)，在紫外燈下切取121bp的目的條帶，然后用WizardSVGelandPCRClean-upSystem(Promega)并參照試劑盒說明書對該目的片斷進(jìn)行回收及純化。(2)連接將步驟(1)回收的121bp的目的片斷與pGEM-TEasyVector進(jìn)行連接，連接體系及條件為回收產(chǎn)物8iU，2XT4DNA連接酶緩沖液10ul，pGEM-TEasyVector1u1(Proraega)，T4DNA連接酶1u1(Promega)，混勻，16。C反應(yīng)2h后，4。C放置12-24h。(3)轉(zhuǎn)化取步驟(2)的連接產(chǎn)物20u1，加入100u1用CaCl2法制備的DH5a感受態(tài)細(xì)胞，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰水上放置30min,然后42"C熱激2min，再迅速置冰水上5min，加入800u1LB液體培養(yǎng)基，37。C搖床培養(yǎng)lh，6000rpm離心5min，棄約800y1上清，用剩余上清吹打懸浮沉淀，并將菌懸液涂布于LB抗性選擇平板(含氨芐青霉素(A即)50mg/L，50mg/mLX-gal16ul，200mg/mLIPTG4ul)上，在37。C下培養(yǎng)12-24h。(4)菌落PCR檢測隨機(jī)挑取在LB抗性選擇平板上長出的3個(gè)白斑進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件與實(shí)施例2中的常規(guī)PCR所用的相同。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6u1，對其進(jìn)行2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(70V電泳30rain)，檢測結(jié)果如圖2所示(泳道M:MarkerDL2000,泳道A:菌落l,泳道B:菌落2，泳道C:菌落3)，結(jié)果其中1個(gè)克隆(菌落l)經(jīng)PCR擴(kuò)增出現(xiàn)了121bp的目的條帶。(5)提取陽性克隆的質(zhì)粒挑取步驟(4)經(jīng)初步鑒定的陽性單克隆，將其接種于含50mg/LAmp的LB液體培養(yǎng)基中，在37"C、300rpm下?lián)u床培養(yǎng)14h，然后用高純度質(zhì)粒提取試劑盒(法特捷)提取質(zhì)粒，將該質(zhì)粒命名為pGEM-T120。取提取的質(zhì)粒pGEM-T1205y1，對其進(jìn)行2.5^瓊脂糖凝膠電泳檢測(70V電泳30min)，檢測結(jié)果如圖3所示(泳道M:MarkerDL2000，泳道A和泳道B:pGEM-T120)，質(zhì)粒pGEM-T120的條帶大小約為3kb，與預(yù)期結(jié)果相符。(6)測序?qū)y帶有pGEM-T120的重組菌命名為DH5a(pGEM-T120)，取DH5a(pGEM-T120)菌液進(jìn)行測序，結(jié)果pGEM-T120所攜帶擴(kuò)增片斷具有序列表中SEQIDN2:5的核苷酸序列，表明pGEM-T120所攜帶的121bp的擴(kuò)增片斷與BTVNS1基因中的待擴(kuò)增序列(BTVNS1基因自5'端第10-130位堿基)完全一致，構(gòu)建的質(zhì)粒序列正確。(7)pGEM-T120的濃度測定取pGEM-T120原液20ul，稀釋至100u1ddH20中，用紫外分光光度計(jì)測定0D26。值，結(jié)果測得pGEM-T120原液的濃度為31.7yg/mL，1u1pGEM-T120原液含9X109個(gè)拷貝。5、用TaqManProbel(NSl)對BTV樣品進(jìn)行real-timeFQPCR檢測(l)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線將pGEM-T120原液按IOX系列稀釋為104、105、106、107個(gè)拷貝進(jìn)行real-timeFQPCR檢測，25u1反應(yīng)體系為10XPCR緩沖液2.5u1，dNTPs(2.5mMeach)2yl，P(NSl-1)1ti1(50pg)，P(NS1-2)1y1(50pg)，TaqManProbel(NS1)0.5y1(25pg)，pGEM-T1201u1，Taq酶1n1(TaKaRa)，MgCl"25mM)2.5iU(P簡ega)，ddH2013.5u1。反應(yīng)條件為先94。C3min;然后94°C30s，45°C45s，72°C20s，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果各稀釋度的pGEM-T120均能產(chǎn)生熒光信號(hào)，Ct值分別為29.63、24.83、21.06、18,08，擴(kuò)增曲線見圖4A，定量數(shù)據(jù)見表l，由擴(kuò)增曲線得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.933，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5(Y=-3.933X+45.257)。表l不同稀釋度pGEM-T120以及BTV-5、8、10、21、22、(A)樣品熒光定量PCR的定量數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(2)BTV樣品的real-tiraeFQPCR檢測首先對6個(gè)BTV血清型的待測樣品(BTV5、BTV8、BTVIO、BTV21、BTV22、BTV(A))進(jìn)行real-timeFQPCR檢測，除模板(由RNA反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA)夕卜，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件與步驟(1)相同，擴(kuò)增曲線見圖4B，定量數(shù)據(jù)見表l，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上的位點(diǎn)見圖6，其Ct值依次為22.50、35.92、32.98、26.24、28.18、28.07，擴(kuò)增起始濃度拷貝數(shù)依次為5.58X105、1.73X102、1.03X103、6.03X104、2.OOXIO4、2.12X104。然后對另外2個(gè)BTV血清型樣品(BTV3、BTV11)用相同方法進(jìn)行rea1-timeFQPCR檢測，擴(kuò)增曲線見圖6，其Ct值依次為22.20、19.37，擴(kuò)增起始拷貝數(shù)依次為7.21X105、3.85X106。此外，用TaqManProbe2(NS1)對上述BTV樣品進(jìn)行real-timeFQPCR檢測，結(jié)論相同，表明本發(fā)明的TaqManProbel(NSl)和TaqManProbe2(NS1)均可用于BTV的real-timeFQPCR檢測。序列表<160〉5〈210〉1〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列<220〉<223>〈400>1gttctctagttggcaaccacc<210〉2〈211〉21<212〉DNA<213〉人工序列〈220〉<223><400>2gtgactgcaagtccattgagg〈210〉3〈211〉25<212>DNA〈213〉人工序列<220〉<223><400>3agttctcgtggcatttgcgtaatcc〈210〉4<211〉23<212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉4attacgc33atgccacgagaact23<210〉5<211>121〈212〉DNA<213〉藍(lán)舌病毒(bluetonguevirus,BTV)〈400〉gttctctagttggcaaccaccaaacatggagcgctttttgagaaaatacaacatcagtggggattacgcaaatgccacgagaacttttttggctatttcacctcaatggacttgcagtca權(quán)利要求1.用于對藍(lán)舌病毒進(jìn)行定性、定量檢測的引物，其上游引物由序列表中的SEQID№1表示，下游引物由序列表中的SEQID№2表示。2、權(quán)利要求l所述引物的衍生序列。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的衍生序列，其特征在于所述衍生序列是在SEQIDN2:1和/或SEQIDNa:2的基礎(chǔ)上經(jīng)過一至十個(gè)堿基的取代、缺失或添加得到的引物序列。4、檢測藍(lán)舌病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，包括權(quán)利要求1所述的用于對藍(lán)舌病毒進(jìn)行定性、定量檢測的引物。全文摘要本發(fā)明公開了用于對藍(lán)舌病毒進(jìn)行定性、定量檢測的引物。該引物的上游引物具有序列表中的SEQID№1，下游引物具有序列表中的SEQID№2。本發(fā)明所提供的引物可用于臨床及科研中對感染藍(lán)舌病的動(dòng)物中的藍(lán)舌病毒RNA進(jìn)行定性及定量分析，對判斷藍(lán)舌病的發(fā)生、復(fù)發(fā)，治療效果評價(jià)及病情的動(dòng)態(tài)觀察具有重要意義。本發(fā)明將在動(dòng)物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。文檔編號(hào)C12Q1/70GK101280343SQ200810094049公開日2008年10月8日申請日期2006年5月16日優(yōu)先權(quán)日2006年5月16日發(fā)明者尹惠瓊,章金剛申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所