專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種活性乳酸乳球菌制品的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種乳酸乳球菌制品的制備方法，特別是涉及一種可高效低成本的表達(dá)苯丙氨酸解氨酶的活性乳酸乳球菌制品的制備方法。
背景技術(shù)：
：苯丙氨酸(phenylalanine,phe)是人體必須氨基酸的一種，正常人從飲食中攝入及體內(nèi)再循環(huán)利用的苯丙氨酸，除少部分被直接利用外，大部分在肝臟的苯丙氨酸羥化酶(phenylalaninehydroxylase,PAH)的作用下轉(zhuǎn)化成為酪氨酸后被利用?；加谐Ｈ旧w隱性遺傳病——苯丙酮尿癥(phenylketonuria,PKU)的患者，由于苯丙氨酸羥化酶基因缺陷，導(dǎo)致肝臟的PAH酶活性降低或缺如，無(wú)法將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化成為酪氨酸，致使苯丙氨酸通過(guò)其他途徑轉(zhuǎn)化為苯丙酮酸、苯乙酸、苯乳酸等。這些非正常代謝產(chǎn)物在血、腦脊液和其他組織中大量積累，對(duì)各種組織特別是腦組織造成不可逆損傷。PKU患者的主要臨床表現(xiàn)是智力低下，癲癇發(fā)作和黑色素減少。目前國(guó)際上通用的治療PKU方法是低苯丙氨酸飲食控制療法。該方法需從患兒一出生起即給予低苯丙氨酸特制奶粉和食物，同時(shí)嚴(yán)格限制正常食物的攝入，并且根據(jù)各生長(zhǎng)發(fā)育階段和個(gè)體的差異隨時(shí)調(diào)整飲食控制量，直至智力發(fā)育基本成熟，g卩17-18歲。由于苯丙氨酸在日常飲食中普遍、大量存在，飲食控制難度極大且容易造成患兒其它必需氨基酸缺乏引起體質(zhì)下降、生長(zhǎng)發(fā)育遲滯等副作用。而人工合成的低苯丙氨酸食品品種少、口感差、價(jià)格昂貴，實(shí)際應(yīng)用中患者由于常年無(wú)法食用正常飲食而極其痛苦，少有能堅(jiān)持飲食控制十幾年者，因此極大地影響了治療質(zhì)量。國(guó)際上80年代初就開(kāi)始研究酶法治療PKU，主要是采用逆轉(zhuǎn)錄病毒和重組腺病毒載體介導(dǎo)的方法，來(lái)實(shí)現(xiàn)PAH在PKU模型小鼠的肝細(xì)胞表達(dá)。主要問(wèn)題是g移效率低，免疫原性強(qiáng)，外源基因在細(xì)胞中只能短期表達(dá)，同時(shí)存在安全性隱患，因此至今未見(jiàn)用于臨床的報(bào)道。苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanineammonia-lyase，PAL)廣泛存在于各種綠色植物和少數(shù)微生物中，它可以催化苯丙氨酸脫氨生成肉桂酸，因此有希望口服該酶治療PKU。由于植物和酵母等生產(chǎn)的天然PAL量極少，提取成本很高，因此通過(guò)基因工程方法獲取大量PAL成為研究的重點(diǎn)?！吨袊?guó)病理生理雜志》2000年16巻第1期第12頁(yè)公布了一種水稻苯丙氨酸解氨酶基因在大腸桿菌BL21DE3中的表達(dá)方法，融合蛋白His6—rPAL主要以包涵體形式存在，誘導(dǎo)7小時(shí)后逸高峰，表達(dá)蛋白量占菌體總蛋白量的35.43%。由于大腸桿菌為人體致病菌，其活菌禁止直接口服應(yīng)用。但該菌超聲破碎后提取的粗酶比活性很低，僅為0.46U/g。原因可能是PAL在生物體外極不穩(wěn)定。中國(guó)專(zhuān)利02117216.1公布了"一種治療苯酮尿癥的藥物及其制造方法與應(yīng)用"技術(shù)，將苯丙氨酸脫氨酶基因轉(zhuǎn)入腸道正常菌中表達(dá)有活性的PAL酶，通過(guò)口服轉(zhuǎn)基因工程菌，利用PAL酶在消化道內(nèi)將phe轉(zhuǎn)化為肉桂酸，從而降低食物來(lái)源中phe進(jìn)入血液的量，達(dá)到治療疾病的同時(shí)保持較正常飲食的目的?！渡锕こ虒W(xué)報(bào)》2002年18巻第6期第713頁(yè)公布了利用上述技術(shù)在乳酸乳球菌(丄./ac&)NICE系統(tǒng)表達(dá)歐芹PAL的結(jié)果，其使用翻譯融合型載體p。(NZ8048-PAL)和轉(zhuǎn)錄融合型載體p(NZ8048-PAL)在乳酸乳球菌中表達(dá)的歐芹PAL，表達(dá)量分別占總蛋白的5.16%和2.76%。該技術(shù)的明顯缺陷在于表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)率很低，乳酸乳球菌的產(chǎn)量也低，因此成本極高，限制了其實(shí)際應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種高效低成本的表達(dá)苯丙氨酸解氨酶的活性乳酸乳球菌制品的制備方法。該發(fā)明克服了上述缺點(diǎn)，采用了高效表達(dá)的菌種和發(fā)酵培養(yǎng)條件，提高了產(chǎn)率、產(chǎn)為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明釆用的技術(shù)方案，包括菌種的構(gòu)建(質(zhì)粒構(gòu)建、連接、轉(zhuǎn)化、篩選)、配制發(fā)酵培養(yǎng)基、菌種活化、接種發(fā)酵、收菌和干燥工藝過(guò)程為了提高歐芹PAL基因在乳酸乳球菌中的表達(dá)效率，本發(fā)明在菌種構(gòu)建過(guò)程中采用了乳酸乳球菌偏愛(ài)密碼子1)質(zhì)粒構(gòu)建以質(zhì)粒pET23b-PAL中PAL基因片段為模板，將歐芹PAL上密碼子全部改變?yōu)槿樗崛榍蚓珢?ài)密碼子，并進(jìn)行人工合成得到全長(zhǎng)2.2kb的PALcDNA(PAL311);2)連接將PALT與適當(dāng)表達(dá)載體相連接形成重組表達(dá)載體；3)轉(zhuǎn)化將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)的乳酸乳球菌(L/M^);4)篩選篩選獲得高效表達(dá)菌株采用本發(fā)明技術(shù)可使表達(dá)效率大幅提高，使PAL蛋白表達(dá)達(dá)到總蛋白量12%以上。為了提高表達(dá)苯丙氨酸解氨酶的乳酸乳球菌的產(chǎn)量，本發(fā)明在發(fā)酵過(guò)程中采用了添加氫氧化鈉和鹽酸的方法自動(dòng)平衡調(diào)節(jié)pH值，使pH值維持在6.5-7.5，避免了乳酸乳球菌發(fā)酵過(guò)程中因乳酸產(chǎn)物積累，pH過(guò)酸對(duì)發(fā)酵的抑制作用，延長(zhǎng)了菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期一倍以上，使表達(dá)苯丙氨酸解氨酶的乳酸乳球菌的產(chǎn)量明顯提高。為了進(jìn)一步提高表達(dá)苯丙氨酸解氨酶的乳酸乳球菌的產(chǎn)量，本發(fā)明還采用了經(jīng)優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，1L培養(yǎng)基中含有蛋白胨5-30g，酵母提取物2.5-15g，乳糖或葡萄糖5-30g，MgS04.7H200.2-0.5g，MnS04.H200.05國(guó)0.1g，NaAc.3H203.3g，KH2P042g，Tween-800.5-5ml，pH值6.5-7.5。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是提供適當(dāng)?shù)奶荚?、氮源及合理的?氮比例，在培養(yǎng)基中添加促進(jìn)工程菌生長(zhǎng)的微量元素MgS04、MnS04及對(duì)表達(dá)產(chǎn)物有利的穩(wěn)定劑Tween-80，在保證充分發(fā)酵所需能量的同時(shí)，避免酸性產(chǎn)物的大量堆積，減少原材料浪費(fèi)，降低了成本。因乳酸乳球菌發(fā)酵最適pH值為6.0-6.5，而PAL酶保存最適pH值為7.5-9.5，為了減少發(fā)酵過(guò)程中PAL酶活力的損失，本發(fā)明采用將發(fā)酵pH值維持在6.5-7.5，溫度維持在25-40°C，發(fā)酵時(shí)間控制在6-30小時(shí)，使得發(fā)酵充分的同時(shí)PAL酶活力得到最佳保護(hù)。為減少外源基因PAL過(guò)早表達(dá)對(duì)乳酸乳球菌生長(zhǎng)的不利影響，本發(fā)明采用當(dāng)發(fā)酵液光齊度OD值在0.3-0.6時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)劑為乳鏈菌素(Nisin)，誘導(dǎo)劑終濃度為3.75-50ng/ml;為在收菌后保持乳酸乳球菌的活菌率同時(shí)有利于PAL酶的保存，本發(fā)明采用將發(fā)酵液it速離心脫水并用pH值為8.0-8.8的磷酸鹽或硼酸鹽緩沖液洗滌2-3次，收集菌體，25-60'C烘干6-72小時(shí)得活菌粉。本發(fā)明的特點(diǎn)是釆用乳酸乳球菌偏愛(ài)密碼子，提高苯丙氨酸解氨酶在基因工程菌中的表達(dá)效率；通過(guò)對(duì)pH值進(jìn)行調(diào)控，使pH維持在6.5-7.5之間，延長(zhǎng)乳酸乳球菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)間，并有利于保護(hù)PAL表達(dá)產(chǎn)物的活性；對(duì)培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化，找到最適于工程菌生長(zhǎng)的碳源、氮源及其比例；在培養(yǎng)基中添加促進(jìn)工程菌生長(zhǎng)的微量元素及對(duì)表達(dá)產(chǎn)物有利的穩(wěn)定劑；在菌體密度達(dá)到0.3-0.6時(shí)使用最佳誘導(dǎo)濃度誘導(dǎo)，使得誘導(dǎo)表達(dá)量和菌體得率達(dá)到最佳平衡；屏棄凍干等高能耗的活菌保存方法，使用簡(jiǎn)便易行、節(jié)能環(huán)保的干燥方式同樣達(dá)到良好的保存效果。采用本發(fā)明的技術(shù)，乳酸乳球菌發(fā)酵體系中菌體密度提高IOO倍，活菌得率大于10UCFU/ml，PAL表達(dá)量大于12%;所得菌體具有高效轉(zhuǎn)化苯丙氨酸生成肉桂酸的能力，PAL酶比活性大于50U/g;所得菌粉穩(wěn)定性好，在4'C保存6個(gè)月，活菌數(shù)仍可達(dá)101C)CFU/g以上，并且PAL酶比活性無(wú)明顯降低；發(fā)酵成本降低2/3。因此利用本發(fā)明可方便地大量提供低成本的PAL用于PKU治療。具體實(shí)施例方式實(shí)施例一高效表達(dá)苯丙氨酸脫氨酶的基因工程乳酸乳球菌制備1、以質(zhì)粒pET23b-PAL中PAL基因片段為模板，將歐芹PAL上密碼子全部改變?yōu)槿樗崛榍蚓珢?ài)密碼子，并進(jìn)行人工合成得到PAL"t，所用的引物為T(mén)l:5'-GAGAACGGTAACGGTGCAACTAC國(guó)3'，T2:5'-GCTCTAGAGCATGTCAGTTAAC-3'。T2含XbaI酶切位點(diǎn)；2、PAL^經(jīng)T4DNA聚合酶處理后，再用XbaI酶切，得到具有乳酸乳球菌偏愛(ài)密碼子的cDNA片段；3、用NcoI酶切表達(dá)載體pNZ8149,并與具有乳酸乳球菌偏愛(ài)密碼子的cDNA片段連接;4、用上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)的乳酸乳球菌；5、篩選被轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌中的高效表達(dá)菌株；6、配制發(fā)酵培養(yǎng)基，各組分的含量均為重量體積百分比，即g/L:蛋白胨5g，酵母提取物2.5g，乳糖5g，MgS04.7H200.25g，MnS04.H200.05g，NaAc.3H2O3.3g,KH2P042g，Tween-800.5ml，其余為水，pH值7.0;7、將菌種進(jìn)行常規(guī)活化，活化種子液按l:50比例接種發(fā)酵培養(yǎng)基；8、發(fā)酵溫度為3(TC，發(fā)酵時(shí)間為18小時(shí)；9、當(dāng)發(fā)酵液光密度OD值在0.3時(shí)用乳鏈菌素進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)劑終濃度為7.5ng/ml;10、發(fā)酵過(guò)程中采用添加氫氧化鈉和鹽酸的方法調(diào)節(jié)pH值，使pH值維持在6.5-7.5之間；11、發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液經(jīng)高速離心(8000rpm/分，離心20分鐘)脫水并用pH8.0的O.lmol/L磷酸鹽緩沖液洗滌3次，收集菌體，60'C烘干，4X:密封避光保存。實(shí)施例二本發(fā)明中乳酸乳球菌表達(dá)PAL酶活力測(cè)定將實(shí)施例一收集的菌體用pH8.8的0.1mol/L硼酸鹽緩沖液(含有10mM苯丙氨酸)配制成lmg/ml懸液，3(TC反應(yīng)1小時(shí)，分別在0，15，30，45，60分鐘收集反應(yīng)上清液，用分光光度法測(cè)定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物肉桂酸的生成量，并計(jì)算出菌體中PAL酶的比活。實(shí)施例三本發(fā)明治療苯丙酮尿癥的藥效學(xué)鑒定給基因缺陷苯丙酮尿癥模型小鼠詞喂本發(fā)明實(shí)施例一中得到的菌體，用法為每日單次R服，0.5g/只，連續(xù)7天，結(jié)果表明，用藥小鼠血液中苯丙氨酸水平均明顯低于對(duì)照鼠，兩組有顯著性差異(PO.Ol)。實(shí)施例四本發(fā)明不同制備工藝的產(chǎn)量、產(chǎn)率比較表1中配方1為常規(guī)乳酸菌培養(yǎng)基M17，配方2為實(shí)施例一中優(yōu)化培養(yǎng)基配方表1、不同培養(yǎng)培養(yǎng)基和pH值產(chǎn)量比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2中培養(yǎng)基為經(jīng)本發(fā)明優(yōu)化的培養(yǎng)基配方，發(fā)酵條件均為經(jīng)本發(fā)明優(yōu)化的培養(yǎng)條件。表2、不同誘導(dǎo)劑濃度產(chǎn)量比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求1、一種利用微生物菌株制備活性乳酸乳球菌制品的方法，其制備過(guò)程包括如下步驟1)質(zhì)粒構(gòu)建以質(zhì)粒pET23b-PAL中PAL基因片段為模板，將歐芹PAL上密碼子全部改變?yōu)槿樗崛榍蚓珢?ài)密碼子，并進(jìn)行人工合成得到全長(zhǎng)2.2kb的PALcDNA(PALart)；2)連接將PALart與適當(dāng)表達(dá)載體相連接形成重組表達(dá)載體；3)轉(zhuǎn)化將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)的乳酸乳球菌(L.lactis)；4)篩選篩選獲得高效表達(dá)菌株5)配制發(fā)酵培養(yǎng)基6)菌種活化7)接種發(fā)酵8)誘導(dǎo)9)收菌10)干燥其特征是在質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程中使用了乳酸乳球菌偏愛(ài)密碼子。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用微生物菌株制備活性乳酸乳球菌制品的方法，其特征是所述發(fā)酵培養(yǎng)基1L中含有蛋白胨5-30g,酵母提取物2.5-15g，乳糖或葡萄糖5-30g，MgS04.7H200.2-0.5g，MnS04.H200.05-0.1g，NaAc.3H203.3g，KH2P042g，Tween-800.5-5ml,pH值6.5-7.5。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用微生物菌株制備活性乳酸乳球菌制品的方法，其特征是所述發(fā)酵過(guò)程中采用添加氫氧化鈉和鹽酸的方法自動(dòng)平衡調(diào)節(jié)pH值，使pH值維持在6.5-7.5之間。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用微生物菌株制備活性乳酸乳球菌制品的方法，其特征是所述誘導(dǎo)條件為當(dāng)發(fā)酵液光密度OD值在0.3-0.6時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)劑為乳鏈菌素(Nisin)，誘導(dǎo)劑終濃度為3.75-50ng/ml。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用微生物菌株制備活性乳酸乳球菌制品的方法，其特征是所述發(fā)酵溫度為25-3(TC，發(fā)酵時(shí)間為6-30小時(shí)。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用微生物菌株制備活性乳酸乳球菌制品的方法，其特征是所述收菌過(guò)程，采用高速離心脫水并用適當(dāng)緩沖液洗滌2-3次收集菌體。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用微生物菌株制備活性乳酸乳球菌制品的方法，其特征是干燥采用25-6(TC烘干6-72小時(shí)。8、根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種利用微生物菌株制備活性乳酸乳球菌制品的方法，其特征是所述適當(dāng)緩沖液為pH8.0-8.8的磷酸鹽或硼酸鹽緩沖液中的一種。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種活性乳酸乳球菌制品的制備方法，包括菌種的構(gòu)建(質(zhì)粒構(gòu)建、連接、轉(zhuǎn)化、篩選)、配制發(fā)酵培養(yǎng)基、菌種活化、接種發(fā)酵、收菌和干燥工藝過(guò)程，本方法采用了高表達(dá)的菌株、優(yōu)化的培養(yǎng)基配方，為延長(zhǎng)菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期采用了pH調(diào)控等方法，最終使發(fā)酵體系中菌體密度提高100倍，活菌得率大于10¹¹CFU/ml，PAL蛋白表達(dá)量大于12％；所得菌體具有高效轉(zhuǎn)化苯丙氨酸生成肉桂酸的能力，PAL酶比活性大于50U/g；所得菌粉穩(wěn)定性好，在4℃保存6個(gè)月，活菌數(shù)仍可達(dá)10¹⁰CFU/g以上，并且PAL酶比活性無(wú)明顯降低；發(fā)酵成本降低2/3。因此利用本發(fā)明可方便地大量提供低成本的PAL用于PKU治療。文檔編號(hào)C12R1/225GK101586111SQ200810098008公開(kāi)日2009年11月25日申請(qǐng)日期2008年5月22日優(yōu)先權(quán)日2008年5月22日發(fā)明者劉金毅,孫儉波,春牛,程永慶,高天星申請(qǐng)人:北京三元基因工程有限公司;北京畢艾歐科技發(fā)展有限責(zé)任公司