專利名稱：微生物轉(zhuǎn)化油脂生產(chǎn)飽和及不飽和α,ω-二羧酸的方法
微生物轉(zhuǎn)化油脂生產(chǎn)飽和及不飽和a , w-二羧酸的方法技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉及微生物轉(zhuǎn)化油脂生產(chǎn)飽和及不飽和a， "一二羧酸， 尤其是轉(zhuǎn)化油脂中的油酸、油酸甲酯和油醇生產(chǎn)9烯一十八碳二元酸(A9DC18) 的方法。
背景技術(shù)：
長鏈二元酸是合成香料、尼龍工程塑料、熱熔膠、涂料、潤滑油、 樹脂和醫(yī)藥等的重要原料。飽和及不飽和長鏈二元酸分別是化工上合成麝香型 香料和靈貓香等名貴香料的重要原料。過去4種名貴的動物香料(麝香、龍誕 香、靈貓香、海貍香)只能從野生動物身上獲得，例如麝香只能從麝貓、麝鹿 等的睪丸中取得，極其昂貴。如今天然麝香中具有生理活性的主要有效成分一 一麝香酮(即3-甲基環(huán)十五酮)可以用十五碳二元酸(DC15)進(jìn)行合成，而靈貓 香可以用9烯一十八碳二元酸進(jìn)行化學(xué)合成。而長鏈二元酸在自然界不單獨(dú)不 存在，化工上難以合成，陳遠(yuǎn)童等從20世紀(jì)90年代以來，先后獲得用微生物 發(fā)酵石油正烷烴生產(chǎn)長鏈二元酸的7項(xiàng)國家發(fā)明專利。并已形成大規(guī)模工業(yè)生 產(chǎn)。但是，石油是一種不可再生資源，根據(jù)國家的戰(zhàn)略需求，科學(xué)家們正在研 究以油脂(可再生資源)為原料，代替石油正垸烴，進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)飽和 及不飽和長鏈二元酸的方法和工藝。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所用的菌株為熱帶假絲酵母(Candida tr叩icalis) ou-3， 是以一株氧化正垸烴生產(chǎn)混合二元酸的熱帶假絲酵母(參見《微生物學(xué)報》20 (1): 88 93， 1980)為出發(fā)菌株，通過硝基胍、亞硝酸、紫外線和N+注入等 多種誘變方法，經(jīng)過多次反復(fù)誘變篩選培育出來的，能從油脂中的各種飽和及 不飽和脂肪酸、脂肪酸酯和脂肪醇，尤其是從油酸、油酸甲酯和油醇生產(chǎn)相應(yīng) 鏈長的二元酸。熱帶假絲酵母(Candida trcjpicalis) ou-3 (以下簡稱ou-3)已于2008年5月14日保藏在北京朝陽區(qū)大屯路甲3號中國科學(xué)院微生物研究 所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNO. 2496。 ou-3的生理特征如下一、 糖類的發(fā)酵葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麥芽糖+，乳糖-。二、 同化葡萄糖+，半乳糖+，山梨糖-，蔗糖+，麥芽糖+，纖維二糖+，海藻 糖+，乳糖-，密二糖-，棉子糖-，松二糖+，菊芋糖-，可溶性淀粉+，木糖+， L-阿戊糖+， D-阿戊糖-，核糖-，鼠李糖-，a-甲基葡萄糖苷+，甘油+，乙醇+，赤鮮醇-，甘露醇+，肌醇-，核糠醇+，半乳糖醇-，葡萄糖醇+,檸檬酸鈉-,丁 二酸鈉+，乳酸鈣-。三、 生長素的需要生物素++，維生素B,++，維生素B2+，維生素B6+，維生素 B12+，葉酸+，煙酸+，泛酸+，肌醇+，對氨基苯甲酸+。四、 其它硝酸鹽-，凍化牛奶-，熊果酸分解-，凝固牛fh，油脂,。 形態(tài)特征奶油白色，皺褶型，菌落為蛋糕狀和桃酥狀。培養(yǎng)特征在麥芽汁液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，假菌絲多而長；在垸烴種子培養(yǎng)基 培養(yǎng)時，有一定數(shù)量的短假菌絲；而在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵時，大部分是單個橢圓細(xì)胞。本發(fā)明的種子培養(yǎng)基(1) 10Be'糖度的麥芽汁加2%瓊脂制成的固體斜面；(2) 10Be'糖度的麥芽汁液體培養(yǎng)基；(3) 種子培養(yǎng)基包含:KH2P04 6 12g/L，酵母膏3 8g/L，玉米漿3 8 g/L， 蔗糖10 30g/L，自來水配置，自然pH。培養(yǎng)種子的過程為取一接種環(huán)ou-3酵母菌體，涂布在麥芽汁固體斜面上 ((H5X180試管，每支裝6 7mL培養(yǎng)基，滅菌后放成斜面)，于28 30'C培養(yǎng)40小時。取一支上述培養(yǎng)好的ou-3菌種全部刮入裝有30mL麥芽汁種子培養(yǎng) 基的250mL三角瓶中，于28 3(TC 220轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)40 48小時， 作為搖瓶發(fā)酵種子或取兩支上述培養(yǎng)好的ou-3斜面菌種全部刮入裝有500mL培 養(yǎng)基的5000mL三角瓶中，于200轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床28 3(TC培養(yǎng)44 48小時， 作為一級種子罐的種子。用本發(fā)明的ou-3菌株轉(zhuǎn)化油脂生產(chǎn)長鏈二元酸，特別是9烯一十八碳二元 酸的具體方法是把培養(yǎng)好的經(jīng)過鏡檢，沒有雜菌的菌種液接入pH5. 5 9. 0, 最好是6. 0 8. 0的含有10 30。/。(v/v)的油醇、油酸或油酸甲酯和90 70%(v/v) 發(fā)酵培養(yǎng)基的混合液中。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為堿金屬磷酸鹽4 12g/L，最好 為6 10 g/L，氯化鈉0. 5 2. 5 g/L，最好為1. 0 2. Og/L，硝酸鹽5 15g/L, 最好是6 10g/L，吐溫60 2 5g/L，最好是2~3g/L，尿素l 4g/L，最好是 1.5 2. 5g/L，蔗糖15 30g/L，丙烯酸0. 5 3g/L及一些其他公知的營養(yǎng)源， 在p服.0 7. 5下將上述混合物在25 34°C ，最好在27 31。C通氣發(fā)酵72 170 小時。第一階段，體系pH控制在6.0 6.8，以菌體生長為主，同時生產(chǎn)一定數(shù) 量的二元酸；第二階段，體系pH控制7.0 8.0之間，以發(fā)酵產(chǎn)酸為主，也生 長部分菌體；第三階段，只產(chǎn)酸，不長菌體。從72小時開始，每天補(bǔ)加一定量 的油醇等，使發(fā)酵液中油醇濃度始終〉5% (v/v)，堿金屬磷酸鹽可從KH2P0,或 NaH2P04中選一種。發(fā)酵結(jié)束后，進(jìn)行破乳分層，上層殘油回收再用，放出中間清液，下層菌 體層再處理一次或壓濾；合并清液，加入適量活性炭在85 9(TC脫色30分鐘， 除去活性炭后，脫色液加熱至70 80°C ，加HC1或H2S(X至pH3進(jìn)行酸化結(jié)晶， 冷卻至3(TC，壓濾，空氣吹干，烘干，得白色二元酸。用本發(fā)明的ou-3菌株和發(fā)酵方法，可生產(chǎn)Cu U的各種單一飽和及不飽和二元酸。其中在16L發(fā)酵罐，從油醇轉(zhuǎn)化生產(chǎn)A9DU時，發(fā)酵144小時，產(chǎn)酸量 達(dá)110. 5g/L。具體完成方式 實(shí)例1.(1) 取一接種環(huán)ou-3菌種，涂布在巾15X180大試管麥芽汁固體斜面上，30x:培養(yǎng)兩天。(2) 取上述菌種一支，接入裝有30mL麥芽汁種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中， 于3(TC在220轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)46小時。(3) 在裝有15mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，接入3. 5mL上述種子液，在 220轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)搖床上發(fā)酵4天，每24小時用Na0H調(diào)一次pH至7. 5 8. 0。發(fā) 酵培養(yǎng)基中含KH2P04 8g/L， KN0:, 4g/L,吐溫60 3g/L,酵母膏2g/L，玉米漿 2, 5g/L, NaCl lg/L,尿素1. 8g/L,蔗糖20g/L,丙烯酸lg/L，油醇150mL/L，自來水 配制，pH7. 1， 110。C滅菌30分鐘。發(fā)酵結(jié)束后，用6mo1 HC1調(diào)pH至3。用有 機(jī)溶劑萃取，先除去殘存原料油，再用乙醚提取二元酸，除去乙醚，得白色結(jié) 晶，用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定，計算二元酸含量。結(jié)果A9DU產(chǎn)量為55. lg/L。 實(shí)例2.按照實(shí)例1的方法，只是原料用月桂酸，結(jié)果DC,2產(chǎn)量為46. 5g/L。 實(shí)例3.按照實(shí)例1的方法，只是原料用棕櫚油酸，結(jié)果9烯一十六碳二元酸(A90(^) 產(chǎn)量為43g/L。實(shí)例4.按照實(shí)例1的方法，只是原料用芥酸(13-二十二烯酸)，結(jié)果A'3-二十二 碳烯二酸(A'3DC22)產(chǎn)量為17.2g/L。 實(shí)例5.(1) 種子培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法和發(fā)酵培養(yǎng)基同實(shí)例1。(2) 把2. 5L培養(yǎng)兩天，0D (X30， 620nm)為0. 81 pH 4.2，健壯，無雜 菌種液接入裝有IOL發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)121'C滅菌40分鐘的16L發(fā)酵罐中，29±1 °C 650轉(zhuǎn)/分，罐壓1.0kg/cm2，通氣量l: 1。開始時，油醇1.5L， 30小時內(nèi)， 體系pH控制在7. 0以下，菌體迅速生長，同時產(chǎn)生6. 5g/L A9DC18，然后體系 pH在7.0 8. 0，繼續(xù)發(fā)酵，到67小時，產(chǎn)酸量達(dá)到25. lg/L， 70小時后每天 補(bǔ)加一定量油醇，使發(fā)酵液中油醇濃度始終〉5% (v/v)。發(fā)酵144小時，產(chǎn)酸 量達(dá)110.5g/L。發(fā)酵結(jié)束后，進(jìn)行破乳分層，回收上層殘余油醇，下層菌體層 通過壓濾，除去菌體，合并清液，加入0.6 0.7%活性炭9(TC脫色20分鐘， 壓濾除去活性炭，脫色清液加熱后加入濃H2S04至pH3，冷卻至室溫，壓濾，空 氣吹干，固形物經(jīng)烘干，得白色A9DCw產(chǎn)品。油醇轉(zhuǎn)化率為82.1%，后處理總 收率達(dá)到84. 5%。
權(quán)利要求
1、一種利用微生物轉(zhuǎn)化油脂生產(chǎn)飽和及不飽和α，ω-二羧酸的方法，其特征在于(1)把用一株熱帶假絲酵母ou-3(Candida tropicalis)培養(yǎng)成的種母液接入pH值為5.5～9.0含有5～30％(v/v)的油脂和95～70％(v/v)發(fā)酵培養(yǎng)基的混合液中。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為堿金屬磷酸鹽4～12克/升，氯化鈉0.5～2.5克/升，蔗糖20～50克/升，硝酸鹽5～15克/升，尿素1～4克/升，吐溫2～5克/升，丙烯酸0.5～3g/L及其他營養(yǎng)源。(2)上述混合液在26～34℃下轉(zhuǎn)化48～160小時，然后將生產(chǎn)的α，ω-二羧酸進(jìn)行分離純化。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于混合液中的油脂為植物油或動物脂肪。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基的混合液中，所說油脂為植物油。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所說植物油包括(但不限于)大豆油、花生油、 棉籽油、蓖麻油、亞麻油等。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1和4所述的方法，其特征在于微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)二元酸的原料為植物油中所 含10 18個碳原子的直鏈脂肪酸及其酯類和醇。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1和5所述的方法，微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)二元酸的原料是油酸、油酸甲酯和油醇， 尤其是油醇。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是發(fā)酵混合液的溫度控制在26 32°C， pH值為6. 58.5。
8、熱帶假絲酵母(C朋o7A trc^icah's)CGMCC No. 2496菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用微生物轉(zhuǎn)化油脂生產(chǎn)飽和及不飽和α、ω-二羧酸的方法，特別是生產(chǎn)9烯-十八碳二元酸(/Δ⁹DC₁₈)的方法。所用微生物為ou-3突變菌株，屬于熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)。其特點(diǎn)是在微生物菌種接入含有油醇、油酸或油酸甲酯為基質(zhì)的培養(yǎng)基后，第一階段，控制體系以菌體生長為主，也轉(zhuǎn)化油脂生產(chǎn)二元酸；第二階段，控制反應(yīng)系統(tǒng)，以產(chǎn)酸為主，也生長部分菌體；第三階段，控制系統(tǒng)只產(chǎn)酸，不長菌體。本方法用于轉(zhuǎn)化油醇生產(chǎn)9烯-十八碳二元酸(Δ⁹DC₁₈)時，在16L發(fā)酵罐中，轉(zhuǎn)化144小時，Δ⁹DC₁₈的產(chǎn)量達(dá)到110.5g/L。
文檔編號C12P7/64GK101270374SQ200810098019
公開日2008年9月24日 申請日期2008年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月23日
發(fā)明者傅深展, 悅 席, 郝秀珍, 陳遠(yuǎn)童 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所