專利名稱：檢測(cè)核酸鏈和物質(zhì)間結(jié)合或相互作用的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及才企測(cè)4亥酸鏈(4企測(cè)用4亥酸鏈，detecting nucleic acid )
更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及能夠檢測(cè)特定物質(zhì)或者物質(zhì)間的結(jié)合或相 互作用的檢測(cè)核酸鏈，并且還涉及物質(zhì)之間的結(jié)合或相互作用的檢 測(cè)方法。
皆景技術(shù)
檢測(cè)蛋白質(zhì)、有機(jī)小分子、核酸、多聚復(fù)合物(多聚配合物)、 細(xì)胞、細(xì)胞組織、金屬離子、微生物、病毒等的技術(shù)在各種領(lǐng)域的 研究、開(kāi)發(fā)等中擔(dān)負(fù)非常重要的角色。如今，檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)在各 種領(lǐng)域，例如，諸如特定疾病的i貪斷、藥物開(kāi)發(fā)、食品等的衛(wèi)生控 制、以及環(huán)境污染的凈化和恢復(fù)中正在進(jìn)4亍。
在它們之中，允許在底物(基外反，substrate)的表面(界面) 等上發(fā)生物質(zhì)間的相互作用或反應(yīng)，并通過(guò)物理方法、光學(xué)方法等 檢測(cè)它的技術(shù)，近年來(lái)尤其得到發(fā)展。這些技術(shù)已作為重要的技術(shù)， 在諸如疾病的診斷、化合物(例如藥物)的篩選、法醫(yī)學(xué)、遺傳信息的綜合分析、生物物質(zhì)(biosubstance)的功能分析、蛋白質(zhì)組 (proteome)分析、以及活體內(nèi)相互作用的分析的領(lǐng)域中得到越來(lái) 越多的應(yīng)用。
作為4企測(cè)技術(shù)，JP-A-08-333398公開(kāi)了 一種使用特異性地識(shí)別 尿中皮質(zhì)醇(一種激素)的多克隆抗體或單克隆抗體的免疫測(cè)定方 法；JP-A-2007-000009公開(kāi)了 一種用于通過(guò)使用對(duì)雙鏈核酸特異的 降解酶而簡(jiǎn)易且準(zhǔn)確地;險(xiǎn)測(cè)靶核酸分子的方法；JP-A-2006-133098 公開(kāi)了 一種蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法，該方法通過(guò)在分離介質(zhì)中插入有源 電極(活性電極)，通過(guò)其使蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行電泳，以氧化該蛋白 質(zhì)的官能團(tuán)，并測(cè)量所產(chǎn)生的電流來(lái)沖企測(cè)蛋白質(zhì)的有無(wú)； JP-A-2002-296274公開(kāi)了 一種用于檢測(cè)宮頸涂片標(biāo)本中瘤細(xì)胞及其 前體的方法，該方法通過(guò)用抗體或核酸探:4十同時(shí)染色并4企測(cè)至少兩 種不同的分子標(biāo)記物(該分子標(biāo)記物表示基因表達(dá)中的疾病相關(guān)的 變化)而進(jìn)行才僉測(cè)；以及JP-A-2006-262775 ^Hf了一種樣t生物細(xì)胞 的才企測(cè)方法，其特征在于通過(guò)使發(fā)光增感劑(luminescence sensitizer )與微生物細(xì)胞樣品接觸來(lái)增加待被;微生物細(xì)胞發(fā)射的熒 光強(qiáng)度。
這里，對(duì)與本發(fā)明有關(guān)的"適體"進(jìn)4于描述。術(shù)語(yǔ)"適體"意 指具有允許核酸分子或肽特異性地結(jié)合于特定物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、 有機(jī)小分子、核酸、多聚復(fù)合物、細(xì)胞、細(xì)胞組織、金屬離子、微 生物、病毒等的功能的核酸分子或肽。"適體"可不受限制地與任 何對(duì)象(object)結(jié)合，并允許以高親和性(親和力)和高特異性 結(jié)合于對(duì)象。其易于大量合成，并且其作用機(jī)制簡(jiǎn)單。因此，其可 廣泛地應(yīng)用于諸如結(jié)構(gòu)蛋白組學(xué)、輩巴分析、靶確認(rèn)(target validation )、以及藥凈勿開(kāi)發(fā)的4頁(yè)i或中。
由于上述原因，近年來(lái)正在進(jìn)行各種適體的l支術(shù)開(kāi)發(fā)。例如， JP-A-2006-320289 ^>開(kāi)了 一種RNA適體，其特異性地結(jié)合于來(lái)自異常朊病毒蛋白質(zhì)(mSAF)的原纖維(fibril),并可用于朊病毒病 的診斷、治療或預(yù)防；以及JP-A-2007-082543公開(kāi)了一種抑制大腸 桿菌釋放因子的RNA適體。

發(fā)明內(nèi)容
上述的物質(zhì)4企測(cè)方法都具有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。例如，它們中的每一 個(gè)都涉及一個(gè)或多個(gè)問(wèn)題，因?yàn)樗贿m于小分子的沖企測(cè)，如果^f品 為痕量時(shí)它不能4企測(cè)，和/或它要求特殊的步驟以避免物質(zhì)的失活。 因此，仍有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的空間。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種新型的檢測(cè)核酸鏈，其又可提 供一種至今未知的物質(zhì)4企測(cè)方法。
目的而進(jìn)行了廣泛的研究。結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人從根本上改變了 傳統(tǒng)方法中已實(shí)踐的測(cè)量揮:針或耙(目標(biāo)物，target)本身的變化的 》見(jiàn)念，并已找到一種新方法，該方法能夠通過(guò)設(shè)計(jì)制造一種不同于 適體或耙的物質(zhì)，在適體與靶的結(jié)合上發(fā)生變化，并測(cè)量那種變化 來(lái)才企測(cè)革巴。
因而，在本發(fā)明的第一個(gè)方面中，提供了一種^^測(cè)核酸鏈，該 沖企測(cè)核酸鏈包括具有能夠起適體作用的第一石成基序列區(qū)的第一核 酸鏈，以及具有第二堿基序列區(qū)的第二核酸鏈，該第二石咸基序列區(qū) 與第一堿基序列區(qū)互補(bǔ)并與第一堿基序列區(qū)形成互補(bǔ)鏈，其中，檢 測(cè)核酸鏈i殳計(jì)成使得當(dāng)預(yù)定的物質(zhì)與第一石咸基序列區(qū)相互作用時(shí)， 第一堿基序列區(qū)和第二堿基序列區(qū)形成的互補(bǔ)鏈解離(離解， dissociate)為單鏈。對(duì)于用于4企測(cè)第一石咸基序列區(qū)和第二石咸基序列區(qū)形成的互補(bǔ) 鏈解離為單鏈的方法不作特別限制。然而，作為實(shí)例，可以設(shè)計(jì)為 使得檢測(cè)核酸鏈包括探針。
在探針具有提供表明第 一堿基序列區(qū)和第二堿基序列區(qū)形成
的互補(bǔ)鏈解離為單鏈的^r測(cè)信號(hào)的功能的情況下，對(duì)于探針的位 置、功能等沒(méi)有特別限制。例如，探針可以是保持在檢測(cè)核酸鏈的 第二核酸鏈上并能夠產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)的物質(zhì)。具體的實(shí)例可包括電介 質(zhì)和熒光物質(zhì)。
4罙4十也可由兩種或兩種以上物質(zhì)構(gòu)成。示例性的纟笨針可以為一 種包括標(biāo)記在第二核酸鏈上的熒光物質(zhì)，和標(biāo)記在第一核酸鏈上并 能在第一堿基序列區(qū)和第二堿基序列區(qū)形成的互補(bǔ)鏈存在時(shí)猝滅 熒光物質(zhì)的猝滅劑的探針。
在本發(fā)明的第二個(gè)方面中，還提供了一種通過(guò)至少使用上述的 才全測(cè)核酸鏈而用于4企測(cè)在能夠起適體作用的第一》咸基序列區(qū)與預(yù) 定物質(zhì)間的相互作用的方法。
在上述方法中，第一核酸鏈可在其一端固定于固相表面上。
對(duì)于第一石咸基序列區(qū)與預(yù)定物質(zhì)之間的結(jié)合或相互作用的檢 測(cè)方法沒(méi)有特別限制。然而，例如，第一石成基序列區(qū)與予貞定物質(zhì)之 間的結(jié)合或相互作用可以通過(guò)測(cè)量由保持在第二核酸鏈上的電介 質(zhì)可獲得的介電常數(shù)的變化并檢測(cè)互補(bǔ)鏈解離為單鏈而檢測(cè)。
第 一堿基序列區(qū)與預(yù)定物質(zhì)之間的結(jié)合或相互作用還可以通 過(guò)測(cè)量沖企測(cè)核酸鏈的重量變化并沖企測(cè)互#卜鏈解離為單鏈而才僉測(cè)。此外，第一石咸基序列區(qū)與預(yù)定物質(zhì)之間的結(jié)合或相互作用還可以通過(guò)測(cè)量來(lái)自插入劑(其結(jié)合或吸附于在^r測(cè)核酸鏈中第一石咸基 序列區(qū)與第二堿基序列區(qū)形成的互補(bǔ)鏈上并能夠發(fā)射熒光)的熒光 強(qiáng)度的降低并檢測(cè)互補(bǔ)鏈解離為單鏈而檢測(cè)?，F(xiàn)在，將對(duì)關(guān)于本發(fā)明的特定4支術(shù)術(shù)語(yǔ)進(jìn)行描述。如本文中所 4吏用的術(shù)語(yǔ)"適體"意指核酸分子或肽，其具有允許該核酸分子或 肽特異性地結(jié)合于諸如蛋白質(zhì)、有機(jī)小分子、核酸、多聚復(fù)合物、 細(xì)胞、細(xì)胞組織、金屬離子、微生物、病毒等特定物質(zhì)的功能。如本文中所^吏用的術(shù)語(yǔ)"揮:針"包4舌所有其每一個(gè)均可以:探測(cè)(acquire)用于4企測(cè)預(yù)定物質(zhì)的4企測(cè)信號(hào)的物質(zhì)。實(shí)例可以包括電 介質(zhì)、具有期望重量的J朱(bead)、熒光物質(zhì)、；故射性物質(zhì)、插入劑 等。如本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"猝滅劑"意指一種物質(zhì)，其為激發(fā)能 吸4欠劑(excitation energy absorber)并具有承卩制4卩近的熒光4勿質(zhì)發(fā) 射熒光的功能。如本文中所-使用的術(shù)語(yǔ)"插入劑"意指一種結(jié)合于雙《連核酸中 的互補(bǔ)鏈部位(位點(diǎn)，site)以發(fā)射熒光等的物質(zhì)。實(shí)例可包括「 "POPO-l"(商標(biāo)名，分子4笨針(Molecular Probes ) />司的產(chǎn)品)、 "TOTO-3"(商標(biāo)名，Invitrogen公司的產(chǎn)品)、"SYBRTM GREEN I" (Invitrogen 司的產(chǎn)品)、"PICOGREEN "(分子4笨針 (Molecular Probes )公司的產(chǎn)品)、以及Hoechst 33258。根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)核酸鏈的應(yīng)用，使得可以不考慮預(yù)定物質(zhì)的 尺寸、數(shù)量、種類等而對(duì)預(yù)定物質(zhì)進(jìn)行簡(jiǎn)單并準(zhǔn)確的4企測(cè)。而且， 根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)核酸鏈可將預(yù)定物質(zhì)的活性降低最小化，并因此不需要進(jìn)行用于抑制活性降低的任何附加的步驟。此外，根據(jù)本發(fā) 明的檢測(cè)核酸鏈可以以高精度檢測(cè)物質(zhì)間的結(jié)合或相互作用?；?的分析、預(yù)定物質(zhì)與適體結(jié)合后的功能分析或物質(zhì)的篩選，并預(yù)期其可對(duì)i者如疾病的i貪斷、化合物(例如，藥物)的篩選、法醫(yī)學(xué)、遺 傳信息的綜合分析、生物物質(zhì)的功能分析、蛋白質(zhì)組分析、活體內(nèi) 相互作用的分析、食品等的衛(wèi)生控制、以及環(huán)境污染的凈化與恢復(fù) 的所有領(lǐng)域作出貢獻(xiàn)。


圖1A和圖1B為根據(jù)本發(fā)明第一方面的第一實(shí)施例的4企測(cè)核 酸鏈和根據(jù)本發(fā)明第二方面的第 一實(shí)施例的用該才企測(cè)核酸鏈來(lái)檢 測(cè)物質(zhì)的方法的示意圖；圖2A-圖2C是根據(jù)本發(fā)明第一方面的第二實(shí)施例的檢測(cè)核酸 鏈和才艮據(jù)本發(fā)明第二方面的第二實(shí)施例的用該;險(xiǎn)測(cè)核酸鏈來(lái)4企測(cè)物質(zhì)的方法的示意圖；圖3A和圖3B是根據(jù)本發(fā)明第一方面的第三實(shí)施例的才企測(cè)核 酸鏈和才艮據(jù)本發(fā)明第二方面的第三實(shí)施例的用該才企測(cè)核酸4連來(lái)檢 測(cè)物質(zhì)的方法的示意圖；圖4A和圖4B是才艮據(jù)本發(fā)明第一方面的第四實(shí)施例的4企測(cè)核 酸鏈和才艮據(jù)本發(fā)明第二方面的第四實(shí)施例的用該才全測(cè)核酸鏈來(lái)檢 測(cè)物質(zhì)的方法的示意圖；圖5A和圖5B是才艮據(jù)本發(fā)明第二方面的第五實(shí)施例的用于枱r 測(cè)預(yù)定物質(zhì)間相互作用的方法的示意圖；圖6A和圖6B是根據(jù)本發(fā)明第二方面的第六實(shí)施例的用于檢 測(cè)予貞定物質(zhì)間沖目互4乍用的方法的示意圖；以及圖7A 圖7C是根據(jù)本發(fā)明第二方面的第七實(shí)施例的，如用于 適體的功能分析、預(yù)定物質(zhì)在其與適體結(jié)合后的功能分析或物質(zhì)的具體實(shí)施方式
在下文中，將參照附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行描述。然而， 應(yīng)當(dāng)注意，在下文中將描述的實(shí)施例僅以舉例方式示出了本發(fā)明的 代表性實(shí)施例，并且本發(fā)明的范圍不應(yīng)狹窄地解釋為下述實(shí)例。首先，將參照?qǐng)D1A和圖1B，對(duì)根據(jù)本發(fā)明第一方面的第一實(shí) 施例的4企測(cè)核酸鏈Nl，以及根據(jù)本發(fā)明第二方面的第一實(shí)施例的 用檢測(cè)核酸鏈Nl來(lái)4全測(cè)預(yù)定物質(zhì)4的方法進(jìn)行描述。粗略地描述，根據(jù)本發(fā)明第一方面的第一實(shí)施例的檢測(cè)核酸鏈 Nl至少i殳置有第一4亥酸鏈11和第二核酸鏈21。第一核酸鏈11具有起適體作用的石咸基序列區(qū)A，作為第一石威 基序列區(qū)。在圖1A和圖1B中，第一核酸鏈11在其一端固定于固 相表面S(例如多朱等；這在下文中同樣適用)上，雖然其并不限于 這樣的固定形式。如隨后將參照?qǐng)D4A和圖4B所描述的，其可以是 一種自由形式(游離形式)。關(guān)于將第一核酸鏈ll在其一端固定于 固相表面S上，對(duì)用于其固定的方法沒(méi)有特別限制，并且已知的方 法均可使用。示例性的是抗生物素蛋白-生物素結(jié)合和偶聯(lián)反應(yīng)(例 如，重氮偶聯(lián)反應(yīng))。第二核S史鏈21具有與石威基序列區(qū)A互補(bǔ)的堿基序列區(qū)B，作 為第二堿基序列區(qū)。在圖1A和圖1B中，示出了與整個(gè)石威基序列區(qū) A互補(bǔ)的堿基序列區(qū)，作為堿基序列區(qū)B的一個(gè)實(shí)例。然而，石咸基 序列區(qū)B并不限于這樣的堿基序列區(qū)，且如圖2A~圖2C中所示， 堿基序列區(qū)B可與長(zhǎng)于堿基序列區(qū)A的堿基序列區(qū)互補(bǔ)。此夕卜，堿 基序列區(qū)B可以與如圖3A和圖3B中所描述的堿基序列區(qū)A的至 少一部分互#卜。在圖1A和圖1B中，第二核酸鏈21在其相反端用探針，即電 介質(zhì)31進(jìn)行修飾。然而，無(wú)須預(yù)先用揭:針對(duì)第二核酸鏈21進(jìn)行修 飾。例如，可在才全測(cè)前不久施加{務(wù)飾、標(biāo)記(labeling)等。雖然優(yōu) 選能夠探測(cè)物理或化學(xué)檢測(cè)信號(hào)的物質(zhì)，但是對(duì)探針的類型沒(méi)有特 別限制。除電介質(zhì)31以外，可以使用所有已知的4笨針，例如具有 已知重量的珠、熒光物質(zhì)、放射性物質(zhì)以及插入劑。這是根據(jù)本發(fā)明第一方面的第一實(shí)施例的檢測(cè)核酸鏈Nl，其 中以上描述的第 一核酸鏈11和第二核酸鏈21以雙鏈形式存在。在圖1A和圖1B中，數(shù)字4指代特異性地結(jié)合至石威基序列區(qū)A 的預(yù)定物質(zhì)。在預(yù)定物質(zhì)是與堿基序列區(qū)A (其起適體作用)特異 性地結(jié)合或相互作用的物質(zhì)的情況下，對(duì)可^皮4企測(cè)的預(yù)定物質(zhì)4沒(méi) 有特別限制。實(shí)例可包括蛋白質(zhì)、有機(jī)小分子、核酸、多聚復(fù)合物、 細(xì)月包、細(xì)月包組織、金屬離子、樣i生物、病毒等。在反應(yīng)或相互作用的位置，準(zhǔn)備檢測(cè)核酸鏈Nl用于反應(yīng)或相 互作用(參見(jiàn)圖1A)。當(dāng)預(yù)定物質(zhì)4充滿(填充，charge)那里時(shí)， 堿基序列區(qū)A和預(yù)定物質(zhì)4彼此結(jié)合，以便當(dāng)預(yù)定物質(zhì)4與堿基序 列區(qū)A之間的結(jié)合性比預(yù)定物質(zhì)4與堿基序列B之間的結(jié)合性更具 優(yōu)勢(shì)時(shí)，導(dǎo)致第二核酸鏈21的解離(如圖1B中所示)。結(jié)合性的強(qiáng)度可以通過(guò)改變堿基序列區(qū)A或B的長(zhǎng)度和/或GC含量進(jìn)行調(diào) 整。由于第二核酸鏈21其上攜帶用于其修飾(modification)的電 介質(zhì)31，因此當(dāng)?shù)诙怂徭?1解離時(shí)，固相表面上的介電常數(shù)顯 著變化。因此，預(yù)定物質(zhì)4可通過(guò)用表面等離子體共振傳感器 (surface plasmon resonance sensor, SPR4專感器)等須'J量介電常凄t的變^:而4企測(cè)。當(dāng)?shù)诙怂徭?1上攜帶的用于其修飾的探針是具有期望重量的珠時(shí)，預(yù)定物質(zhì)4還可以通過(guò)按照石英晶體孩么量天平法(QCM 法)等測(cè)量重量變化而4企測(cè)。與通常使用的探針核酸不同，將根據(jù)本發(fā)明第一方面的第一實(shí) 施例的4企測(cè)核酸鏈N1^殳計(jì)為，使得僅形成雙鏈的第一核酸鏈11中 的堿基序列區(qū)A與預(yù)定物質(zhì)4結(jié)合或相互作用，而形成雙鏈的其他 核酸《連，即，第二核酸鏈21，同時(shí)解離。因此，無(wú)須在預(yù)定物質(zhì)4 上進(jìn)行標(biāo)記等。此外，預(yù)定物質(zhì)4的4企測(cè)可通過(guò)測(cè)量解離的第二核 酸鏈21的變化，而非測(cè)量預(yù)定物質(zhì)4本身的變化來(lái)實(shí)施。從而， 即使當(dāng)預(yù)定物質(zhì)4是小分子或?yàn)楹哿繒r(shí)，也可以以高靈敏度4企測(cè)預(yù) 定物質(zhì)4。接下來(lái)，將參照?qǐng)D2A~圖2C,對(duì)才艮據(jù)本發(fā)明第一方面的第二 實(shí)施例的檢測(cè)核酸鏈N2和根據(jù)本發(fā)明第二方面的第二實(shí)施例的用 該才企測(cè)核酸鏈N2 4企測(cè)預(yù)定物質(zhì)4A的方法進(jìn)4于描述。才艮據(jù)本發(fā)明第一方面的第二實(shí)施例的檢測(cè)核酸鏈N2是以這樣 的形式，即作為第二核酸鏈22中的第二堿基序列區(qū)的堿基序列區(qū)D 與作為第一堿基序列區(qū)的堿基序列區(qū)互補(bǔ)地形成雙鏈，堿基序列區(qū) D長(zhǎng)于第一核酸鏈12中的堿基序列區(qū)C。此外，作為示例性探針的熒光物質(zhì)32標(biāo)記于第二核酸鏈22的一端。對(duì)熒光物質(zhì)32的類 型沒(méi)有特別限制。然而，例如，可使用任何已知的熒光物質(zhì)，例如 諸如Cy3或Cy5的焚光染料或諸如熒光素酶或GEP的熒光蛋白。與圖1A和圖1B中所示的第一實(shí)施例相類似，在反應(yīng)或相互 作用的位置準(zhǔn)備4企測(cè)核酸鏈N2用于反應(yīng)或相互作用(參見(jiàn)圖2A )。 當(dāng)預(yù)定物質(zhì)4A充滿那里時(shí)，堿基序列區(qū)C和預(yù)定物質(zhì)4A彼此結(jié) 合乂人而導(dǎo)致第二核酸鏈22的解離(如圖2B所示)。預(yù)定物質(zhì)4A可通過(guò)對(duì)反應(yīng)或相互作用的位置進(jìn)4亍洗滌，然后 確定是否經(jīng)予貞定》皮長(zhǎng)的熒光-敫發(fā)光(fluorescence excitation light)而 發(fā)射出熒光來(lái)檢測(cè)。具體地描述，當(dāng)存在與堿基序列區(qū)C結(jié)合或相 互作用的預(yù)定物質(zhì)4A時(shí)，第二核酸鏈解離^f吏得如圖2C中所示，第 二核酸鏈22通過(guò)隨后的洗滌-故除去，并且即4吏當(dāng)照射預(yù)定波長(zhǎng)的 熒光激發(fā)光時(shí)也不發(fā)射熒光。當(dāng)不存在與堿基序列區(qū)C結(jié)合或相互 作用的預(yù)定物質(zhì)4A時(shí)，第二核酸鏈22不發(fā)生解離，且4企測(cè)核酸鏈 N2保持雙鏈形式。由于檢測(cè)核酸鏈N2不會(huì)經(jīng)洗滌而被除去，因此 當(dāng)照射預(yù)定波長(zhǎng)的熒光激發(fā)光時(shí)發(fā)射出熒光。接下來(lái)參照?qǐng)D3A和圖3B,在下文中將對(duì)根據(jù)本發(fā)明第一方面 的第三實(shí)施例的#企測(cè)核酸鏈N3和才艮據(jù)本發(fā)明第二方面的第三實(shí)施 例的用該4企測(cè)核酸鏈N3 4企測(cè)預(yù)定物質(zhì)4B的方法進(jìn)4于描述。才艮據(jù)本發(fā)明第一方面的第三實(shí)施例的4企測(cè)核酸鏈N3以這樣的 形式，即作為第二核酸鏈23中的第二堿基序列區(qū)的堿基序列區(qū)F 與作為第一核酸鏈13中的第一堿基序列區(qū)的堿基序列區(qū)E的一部 分互補(bǔ)地形成雙鏈。使用作為探針的是由熒光物質(zhì)331和能夠猝滅 該熒光物質(zhì)331的猝滅劑332所構(gòu)成的探針。它被這樣設(shè)計(jì)，即熒 光物質(zhì)331凈皮標(biāo)記至第二核酸鏈23的一端，而猝滅劑332 #:標(biāo)記 至第 一核酸鏈13的 一端，使得只要形成雙鏈即可捽滅熒光物質(zhì)331 。與圖1A和圖IB以及圖2A-圖2C中所示的實(shí)施例相類似， 在反應(yīng)或相互作用的位置中準(zhǔn)備檢測(cè)核酸鏈N3用于反應(yīng)或相互作 用，其中熒光物質(zhì)331處于猝滅狀態(tài)(參見(jiàn)圖3A)。當(dāng)預(yù)定物質(zhì)4B 充滿那里時(shí)，石咸基序列區(qū)E和預(yù)定物質(zhì)4B彼此結(jié)合以使第二核酸 鏈23解離(如圖3B所示)。第一核酸鏈13與第二核酸鏈23;f皮此解離后，熒光物質(zhì)331和 猝滅劑332彼此分開(kāi)，使得熒光物質(zhì)331即將發(fā)射熒光。因此，對(duì) 經(jīng)預(yù)定波長(zhǎng)的熒光激發(fā)光而產(chǎn)生的熒光放射進(jìn)行測(cè)量，使得可以檢 測(cè)予貞定物質(zhì)4B。如第三實(shí)施例中的猝滅劑的使用可產(chǎn)生以下優(yōu)點(diǎn)，即不再需要 如在圖2A~圖2C所示的第二實(shí)施例中所進(jìn)行的洗滌步驟。以下將參照?qǐng)D4A和圖4B,對(duì)根據(jù)本發(fā)明第一方面的第四實(shí)施 例的沖企測(cè)核酸鏈N4和才艮據(jù)本發(fā)明第二方面的第四實(shí)施例的用該沖企 測(cè)核酸鏈N4來(lái)檢測(cè)預(yù)定物質(zhì)4C的方法進(jìn)行描述。根據(jù)第四實(shí)施例的才僉測(cè)核酸鏈N4不固定在任何固相表面上， 而是以自由(游離)狀態(tài)存在。作為示例性的探針，使用插入劑34 并將其結(jié)合或吸附在石威基序列區(qū)G (作為第一核酸鏈14中的第一 石成基序列區(qū))與石咸基序列區(qū)H (作為第二核酸鏈24中的第二石咸基 序列區(qū))形成的互4卜鏈上。與圖1A和圖1B、圖2A~圖2C以及圖3A和圖3B中戶斤示的 實(shí)施例相類似，在反應(yīng)或相互作用的位置中準(zhǔn)備4企測(cè)核酸《連N4用 于反應(yīng)或相互作用(參見(jiàn)圖4A)。當(dāng)預(yù)定物質(zhì)4C充滿那里時(shí)，石咸 基序列區(qū)G與預(yù)定物質(zhì)4C 4皮此結(jié)合從而導(dǎo)致第二核酸鏈24的解 離(如圖4B中所示)。第一核酸鏈14與第二核酸鏈24彼此解離后，插入劑34也解 離。因此，在預(yù)定波長(zhǎng)的熒光激發(fā)光等的照射下，測(cè)量熒光放射的 減少偵J尋可以;險(xiǎn)測(cè)預(yù)定物質(zhì)4C。圖5A和圖5B示出了4艮據(jù)本發(fā)明第二方面的第五實(shí)施例的用 于才企測(cè)予貞定物質(zhì)4a、 4b之間的相互〗乍用的方法。在該第五實(shí)施例 中，將使用圖1A和圖1B中所示的沖企測(cè)核酸鏈N1作為檢測(cè)核酸鏈 進(jìn)行描述。然而，第五實(shí)施例并不限于使用4企測(cè)核酸鏈N1。例如， 也可才艮據(jù)需要，使用上述才艮據(jù)第 一至第四實(shí)施例的4企測(cè)核酸鏈中的 任意一種。圖5A和圖5B中以標(biāo)號(hào)4a示出的預(yù)定物質(zhì)，只要其4安原才羊存 在就不能結(jié)合至石威基序列區(qū)A。然而，當(dāng)它與其他j子貞定物質(zhì)4b相 互作用時(shí)，其性能改變， -使得其可結(jié)合至石咸基序列區(qū)A。在反應(yīng)或相互作用的位置中，準(zhǔn)備檢測(cè)核酸鏈Nl與預(yù)定物質(zhì) 4a用于反應(yīng)或相互作用(參見(jiàn)圖5A)。當(dāng)預(yù)定物質(zhì)4b充滿那里時(shí)， 預(yù)定物質(zhì)4a與預(yù)定物質(zhì)4b之間發(fā)生相互作用。然后，如此相互作 用的預(yù)定物質(zhì)4a、 4b結(jié)合至堿基序列區(qū)A從而導(dǎo)致第二核酸鏈21 的解離。由于第二核酸鏈21于其上攜帶電介質(zhì)31用于其修飾，因此當(dāng) 第二核酸鏈21解離時(shí)，固相表面上的介電常數(shù)顯著改變。因此， 預(yù)定物質(zhì)4a和予貞定物質(zhì)4b之間的相互作用可通過(guò)例如〗吏用表面等 離子體傳感器(SPR傳感器)等測(cè)量介電常數(shù)的變化而檢測(cè)。圖6A和圖6B為根據(jù)本發(fā)明第二方面的第六實(shí)施例的用于檢 測(cè)預(yù)定物質(zhì)4與結(jié)合抑制物質(zhì)5之間的相互作用的方法的示意圖。 在該第六實(shí)施例中，還將使用圖1A和圖1B中所示的4全測(cè)核酸鏈 Nl作為4企測(cè)核酸鏈而進(jìn)4于描述。然而，第六實(shí)施例并不限于4吏用檢測(cè)核酸鏈Nl。例如，也可根據(jù)需要使用上述根據(jù)第一至第四實(shí) 施例的檢測(cè)核酸鏈中的任意一種。在圖6A中，結(jié)合抑制物質(zhì)5抑制預(yù)定物質(zhì)4與堿基序列區(qū)A 之間的結(jié)合。當(dāng)結(jié)合抑制物質(zhì)5從預(yù)定物質(zhì)4解離，或結(jié)合抑制物 質(zhì)5的功能在特定作用下喪失時(shí)，預(yù)定物質(zhì)4結(jié)合至堿基序列區(qū)A 乂人而導(dǎo)致第二核酸鏈21的解離。由于第二核酸鏈21于其上攜帶電介質(zhì)31用于其修飾，因此當(dāng) 第二核酸鏈21解離時(shí)，固相表面上的介電常數(shù)顯著改變。因此， 結(jié)合抑制物質(zhì)5從預(yù)定物質(zhì)4上解離或結(jié)合抑制物質(zhì)5的功能障礙 (functional failure)可以通過(guò)例4口^f吏用表面等離子體傳感器(SPR 傳感器)等測(cè)量介電常凄史的變化而4全測(cè)。根據(jù)第六實(shí)施例的方法可用于諸如結(jié)合抑制物質(zhì)5的功能抑制 劑的篩選。當(dāng)預(yù)定物質(zhì)4以以下?tīng)顟B(tài)存在，即，通過(guò)結(jié)合抑制物質(zhì) 5抑制預(yù)定物質(zhì)4結(jié)合于檢測(cè)核酸鏈Nl,尤其是石咸基序列區(qū)A (如 圖6A中所示)，然后供入一種未示出的能夠作為用于結(jié)合抑制物質(zhì) 5的功能抑制劑的物質(zhì)以抑制結(jié)合抑制物質(zhì)5的功能時(shí)，該預(yù)定物 質(zhì)結(jié)合至石咸基序列區(qū)A。這種結(jié)合導(dǎo)致第二核酸鏈21的解離，使 得固相表面上的介電常凄t顯著改變。由前述內(nèi)容容易地理解，才艮據(jù) 本發(fā)明第一方面的第一實(shí)施例的檢測(cè)核酸鏈Nl可用于結(jié)合抑制物 質(zhì)5的功能抑制劑的篩選。述的功能分析等。在下文中，將參照?qǐng)D7A~圖7C對(duì)這樣的應(yīng)用的 一個(gè)實(shí)例進(jìn)行描述。圖7A~圖7C示出了才艮據(jù)本發(fā)明第二方面的第七實(shí)施例、如用 于適體功能的分析、預(yù)定物質(zhì)結(jié)合于適體后的功能的分析或物質(zhì)的篩選的用于4企測(cè)物質(zhì)間結(jié)合或相互作用的方法。在該第七實(shí)施例中，還將4吏用圖1A和圖1B中所示的檢測(cè)核酸鏈N1，作為4企測(cè)核 酸鏈進(jìn)4于描述。然而，第七實(shí)施例并不限于4吏用一企測(cè)核酸鏈Nl。 例如，也可根據(jù)需要，使用上述根據(jù)第一至第四實(shí)施例的檢測(cè)核酸 鏈中的任意一種。如上所述，在反應(yīng)或相互作用的位置中準(zhǔn)備才企測(cè)核酸鏈Nl用 于反應(yīng)或相互作用(參見(jiàn)圖7A)。當(dāng)預(yù)定物質(zhì)4c充滿那里時(shí)，預(yù) 定物質(zhì)4c和堿基序列區(qū)A彼此結(jié)合從而導(dǎo)致第二核酸鏈21的解離 (如圖7B中所示)。此時(shí)，預(yù)定物質(zhì)4c結(jié)合至石咸基序列區(qū)A (其 起適體作用)可首先通過(guò)測(cè)量介電常lt等的變化而i正實(shí)。適體設(shè)置有與各種物質(zhì)結(jié)合以影響它們的作用的功能。當(dāng)預(yù)定 物質(zhì)4c (其通常不與，例如物質(zhì)61進(jìn)行任何相互作用)與適體(石咸 基序列區(qū)A)結(jié)合后能夠與物質(zhì)61相互作用時(shí)，該適體(堿基序 列區(qū)A)則^皮i人為具有將預(yù)定物質(zhì)4c改變?yōu)榭梢耘c物質(zhì)61相互作 用的物質(zhì)4d的功能。雖然還不知道預(yù)定物質(zhì)4c在與其適體結(jié)合后將提供什么功能， 但根據(jù)第七實(shí)施例的方法使得可以進(jìn)行由預(yù)定物質(zhì)4c與適體(堿 基序列區(qū)A)結(jié)合而獲得的物質(zhì)4d的功能分析。如果可以確定預(yù) 定物質(zhì)4c在其與適體U咸基序列區(qū)A)結(jié)合后能夠與物質(zhì)61相互 作用(如圖7C中所示)，則由預(yù)定物質(zhì)4c結(jié)合至適體(堿基序列 區(qū)A)而產(chǎn)生的物質(zhì)4d^皮i人為具有如允i午其與物質(zhì)61相互作用的 這樣的性能。此外，上述方法原理的4吏用還使;得可以進(jìn)4亍由預(yù)定物質(zhì)4c與 適體(堿基序列區(qū)A)的相互作用而可獲得的物質(zhì)61的篩選。在上述應(yīng)用中，物質(zhì)61與物質(zhì)4c之間相互作用的存在與否可 通過(guò)傳統(tǒng)已知的方法而確定。由于通過(guò)物質(zhì)61與物質(zhì)4d之間相互 作用重量發(fā)生改變，因此該相互作用可通過(guò)石英晶體微量天平法 (QCM法)等來(lái)才企測(cè)。該相互作用也可通過(guò)將標(biāo)記物質(zhì)(例如熒 光物質(zhì)、》文射性物質(zhì)或插入劑)結(jié)合或吸附在物質(zhì)61或物質(zhì)4d上 的方法，或者通過(guò)如PRET原理中，物質(zhì)間的相互作用可導(dǎo)致來(lái)自 物質(zhì)61或物質(zhì)4d本身的熒光的顏色等發(fā)生變化的方法而得到4企 測(cè)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以根據(jù)設(shè)計(jì)要求和其它因素進(jìn) 行各種變更、組合、子組合以及改變，只要它們?cè)谒綑?quán)利要求或 其等同物的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)核酸鏈，包括第一核酸鏈，所述第一核酸鏈具有能夠起適體作用的第一堿基序列區(qū)，以及第二核酸鏈，所述第二核酸鏈具有第二堿基序列區(qū)，所述第二堿基序列區(qū)與所述第一堿基序列區(qū)互補(bǔ)并與所述第一堿基序列區(qū)形成互補(bǔ)鏈，其中，所述檢測(cè)核酸鏈這樣設(shè)計(jì)，使得當(dāng)預(yù)定物質(zhì)與所述第一堿基序列區(qū)相互作用時(shí)，所述第一堿基序列區(qū)和第二堿基序列區(qū)形成的所述互補(bǔ)鏈解離為單鏈。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)核酸鏈，進(jìn)一步包括可用于檢測(cè)所 述第一和第二互補(bǔ)石威基序列區(qū)形成的所述互補(bǔ)鏈離解為所述 單鏈的探針。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)核酸鏈，其中，所述探針是保持在 所述第二核酸鏈上并可以產(chǎn)生4企測(cè)信號(hào)的物質(zhì)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)核酸鏈，其中，所述物質(zhì)是電介質(zhì)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)核酸鏈，其中，所述物質(zhì)是熒光物 質(zhì)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)核酸鏈，其中，所述探針包括熒光物質(zhì)，所述熒光物質(zhì)標(biāo)記在所述第二核酸鏈上，以及猝滅劑，所述猝滅劑標(biāo)記在所述第一核酸鏈上并能夠在 所述第 一堿基序列區(qū)和第二堿基序列區(qū)形成的所述互4卜鏈存 在時(shí)猝滅所述熒光物質(zhì)。
7. —種通過(guò)至少使用根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)核酸鏈，檢測(cè)能 夠起適體作用的第 一堿基序列區(qū)與預(yù)定物質(zhì)之間的相互作用 的方法。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述第一核酸鏈的一端固 定在固相表面上。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，通過(guò)測(cè)量可由保持在所述 第二核酸鏈上的電介質(zhì)獲得的介電常H的變化來(lái)4全測(cè)所述互 補(bǔ)鏈解離為所述單鏈。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，通過(guò)測(cè)量所述檢測(cè)核酸鏈 的重量的變化來(lái)檢測(cè)所述互補(bǔ)鏈解離為所述單鏈。
11. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，通過(guò)測(cè)量來(lái)自結(jié)合或吸附 在所述檢測(cè)核酸鏈中的所述第 一堿基序列區(qū)和第二堿基序列 區(qū)的所述互補(bǔ)鏈上并能夠發(fā)射焚光的插入劑的焚光強(qiáng)度的降 低來(lái)檢測(cè)所述互補(bǔ)鏈解離為所述單鏈。
全文摘要
本文公開(kāi)了一種檢測(cè)核酸鏈，該檢測(cè)核酸鏈包括第一核酸鏈，其具有能夠起適體作用的第一堿基序列區(qū)，以及第二核酸鏈，其具有第二堿基序列區(qū)，該第二堿基序列區(qū)與第一堿基序列區(qū)互補(bǔ)且與第一堿基序列區(qū)形成互補(bǔ)鏈，其中，所述檢測(cè)核酸鏈這樣設(shè)計(jì)，使得當(dāng)預(yù)定物質(zhì)與第一堿基序列區(qū)相互作用時(shí)，第一和第二堿基序列區(qū)形成的互補(bǔ)鏈解離為單鏈。本發(fā)明還公開(kāi)了一種檢測(cè)物質(zhì)間結(jié)合或相互作用的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101307360SQ200810098110
公開(kāi)日2008年11月19日 申請(qǐng)日期2008年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月14日
發(fā)明者上野雅嗣, 渡部祐己 申請(qǐng)人:索尼株式會(huì)社