專利名稱：一種從發(fā)芽咖啡豆中提取α-半乳糖苷酶的方法
一種從發(fā)芽咖啡豆中提取oc-半乳糖苷酶的方法技術領域一種從發(fā)芽咖啡豆中提取a-半乳糖苷酶的方法，涉及酶制劑技術領域。
技術背景a-半乳糖苷酶(a-D-Galactosidase; EC 3.2.1.22)廣泛地存在于植物、動物及 微生物組織中，來源于綠咖啡豆的a-半乳糖苷酶具有將半乳糖基直接轉(zhuǎn)移到環(huán) 糊精上的功能，得到帶有半乳糖基的分支環(huán)糊精，而其它來源的oi-半乳糖苷酶 沒有此功能。因此，綠咖啡豆來源的cc-半乳糖苷酶得到廣泛的關注和研究?，F(xiàn)有的綠咖啡豆來源的a-半乳糖苷酶存在比酶活和產(chǎn)量較低的問題，導致 國際市場上綠咖啡豆來源的a-半乳糖苷酶價格昂貴，限制了此酶的實際應用研 究。為了解決此問題，有學者研究了綠咖啡豆ot-半乳糖苷酶的克隆和功能性表 達，并且在酵母(Pichia pastoris)上高效表達和純化綠咖啡豆來源的a-半乳糖 苷酶，期望得到更多的a-半乳糖苷酶。這些研究提供了獲得綠咖啡豆(x-半乳糖 苷酶的新途徑，但均未獲得滿意的結(jié)果。因此，本發(fā)明以發(fā)芽咖啡豆為原料，提取得到a-半乳糖苷酶，具有更高的 比酶活，對于解決現(xiàn)有問題十分必要。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是以發(fā)芽咖啡豆為原料，提供一種提取a-半乳糖苷酶的加工 方法，所得a-半乳糖苷酶具有較高的比酶活，有利于此酶的應用研究。本發(fā)明的技術方案 一種從發(fā)芽咖啡豆中提取(X-半乳糖苷酶的方法，選用 發(fā)芽咖啡豆為原料，經(jīng)粉碎、粗提、硫酸銨沉淀、陰離子柱層析和凝膠柱層析 工序制得a-半乳糖苷酶，工藝條件為(1) 原料選取飽滿的咖啡豆種子(Coffea arabica小種粒)，沙床培養(yǎng)發(fā) 芽50 70d后，選取己經(jīng)發(fā)芽的咖啡豆種子，洗凈發(fā)芽咖啡豆種子表面沙粒，吸 干發(fā)芽咖啡豆種子表面水分，作為提取cc-半乳糖苷酶的原料；(2) 粉碎將發(fā)芽咖啡豆放入-4(TC冷藏箱中冷凍20~24h，取出，用微粉 碎機粉碎，使物料粒度達到孔徑0.25mm試驗篩篩上物《30。/。質(zhì)量百分數(shù)；粉碎 粒度過粗，導致提取得率降低。(3) 粗提將粉碎后的物料放入提取液中，提取液中含氯化鈉質(zhì)量濃度 0.5%~1%,發(fā)芽咖啡豆粉與提取液的料液質(zhì)量比1:4 1:5，提取溫度4'C,攪拌速 度100~200r/min，提取時間25 60min;提取結(jié)束后，將混合物放入離心管中， 冷凍離心，離心溫度4。C，離心速度15 000 20 000Xg，離心時間2 5min，得上清粗酶液；(4) 硫酸銨沉淀向粗酶液中添加硫酸銨粉末，緩慢攪拌，最終達到質(zhì)量濃度50%~60%飽和硫酸銨濃度，4。C靜置24 36h，冷凍離心，離心溫度4。C， 離心速度10 000 15 000xg，離心時間2 5min，冷凍離心結(jié)束后，取出沉淀物；(5) 陰離子柱層析將得到的沉淀物溶解在25 50mmol/L、 pH 6 6.5的 Tris-HCl緩沖液中，上DEAE-Sepharose陰離子交換柱層析，洗脫液為 0.3 0.5mol/LNaCl溶液；洗脫下來的目的蛋白冷凍干燥，溫度-4(TC，真空度《 12Pa，干燥時間24 48h，得到酶粉；(6) 凝膠柱層析經(jīng)陰離子交換柱純化得到的酶粉溶解于0.3 0.5mol/L、 pH 5 6的磷酸緩沖液中，上Sepharose CL-6B凝膠柱層析進行純化，洗脫液為 0.3~0.5mol/L、 pH5 6的磷酸緩沖液，洗脫下目的蛋白進行冷凍干燥，溫度-40 。C，真空度《12Pa，千燥時間24 48h，得到酶粉，即為a-半乳糖苷酶酶粉。本發(fā)明的有益效果以發(fā)芽咖啡豆為原料，經(jīng)過上述工藝得到的cc-半乳糖 苷酶的比酶活明顯高于綠咖啡豆來源的(x-半乳糖苷酶的比酶活，使(x-半乳糖苷 酶得到更加廣泛的應用，特別是在低聚糖轉(zhuǎn)糖苷方面的應用。本發(fā)明制得的ot-半乳糖苷酶的比酶活達到13~15U/mg，目前商品酶(綠咖啡豆來源的a-半乳糖 苷酶)的比酶活為10U/mg，前者明顯高于后者(同一條件下測定比酶活)。本 發(fā)明采用的發(fā)芽咖啡豆容易獲得，工藝中采用的粗提，硫酸銨沉淀，陰離子柱 層析，凝膠柱層析等方法皆為常規(guī)方法，簡單實用，適合于規(guī)模生產(chǎn)。生產(chǎn)成 本較低，無污染排放，對環(huán)境友好。
具體實施方式
實施例1原料沙床培養(yǎng)發(fā)芽60d的咖啡豆種子20g。加工工藝粉碎(物料粒度 0.25mm孔徑試驗篩篩上物《30。/。質(zhì)量百分數(shù))；粗提(提取液0.5% 1% NaCl 溶液，料液比1:5，提取溫度4"，攪拌速度200r/min，提取時間45min，離心 溫度4'C，離心速度15 000xg，離心時間3min);硫酸銨沉淀(55%飽和硫酸銨 濃度)；陰離子柱層析:DEAE-Sepharose陰離子交換層析柱，30mmol/L的Tris-HCl 緩沖液，0.5mol/LNaCl溶液洗脫；凝膠柱層析Sepharose CL-6B凝膠層析柱， 0.5mol/L的磷酸緩沖液洗脫；冷凍干燥溫度-4(TC，真空度《12Pa，干燥時間 36h，得到a-半乳糖苷酶，比酶活為13U/mg。
權(quán)利要求
1. 一種從發(fā)芽咖啡豆中提取α-半乳糖苷酶的方法，其特征是選用發(fā)芽咖啡豆為原料，經(jīng)粉碎、粗提、硫酸銨沉淀、陰離子柱層析和凝膠柱層析工序制得α-半乳糖苷酶，工藝條件為(1)原料選取飽滿的咖啡豆種子，沙床培養(yǎng)發(fā)芽50～70d后，選取已經(jīng)發(fā)芽的咖啡豆種子，洗凈發(fā)芽咖啡豆種子表面沙粒，吸干發(fā)芽咖啡豆種子表面水分，作為提取α-半乳糖苷酶的原料；(2)粉碎將物料放入-40℃冷藏箱中冷凍20～24h，取出，用微粉碎機粉碎，使物料粒度達到孔徑0.25mm試驗篩篩上物≤30％質(zhì)量百分數(shù)；(3)粗提將粉碎后的物料放入提取液中，提取液中含氯化鈉質(zhì)量濃度0.5％～1％，發(fā)芽咖啡豆粉與提取液的料液質(zhì)量比1∶4～1∶5，提取溫度4℃，攪拌速度100～200r/min，提取時間25～60min；提取結(jié)束后，將混合物放入離心管中，冷凍離心，離心溫度4℃，離心速度15 000～20 000×g，離心時間2～5min，得上清粗酶液；(4)硫酸銨沉淀向粗酶液中添加硫酸銨粉末，緩慢攪拌，最終達到質(zhì)量濃度50％～60％飽和硫酸銨濃度，4℃靜置24～36h，冷凍離心，離心溫度4℃，離心速度10 000～15 000×g，離心時間2～5min，冷凍離心結(jié)束后，取出沉淀物；(5)陰離子柱層析將得到的沉淀物溶解在25～50mmol/L、pH 6～6.5的Tris-HCl緩沖液中，上DEAE-Sepharose陰離子交換柱層析，洗脫液為0.3～0.5mol/L NaCl溶液；洗脫下來的目的蛋白冷凍干燥，溫度-40℃，真空度≤12Pa，干燥時間24～48h，得到酶粉；(6)凝膠柱層析經(jīng)陰離子交換柱純化得到的酶粉溶解于0.3～0.5mol/L、pH 5～6的磷酸緩沖液中，上Sepharose CL-6B凝膠柱層析進行純化，洗脫液為0.3～0.5mol/L、pH5～6的磷酸緩沖液，洗脫下目的蛋白進行冷凍干燥，溫度-40℃，真空度≤12Pa，干燥時間24～48h，得到酶粉，即為α-半乳糖苷酶酶粉。
全文摘要
一種從發(fā)芽咖啡豆中提取α-半乳糖苷酶的方法，涉及酶制劑技術領域。本發(fā)明以發(fā)芽咖啡豆為原料，經(jīng)粉碎、粗提、硫酸銨沉淀、陰離子柱層析、凝膠柱層析等工序，控制料液比、提取溫度、攪拌速度、提取時間、硫酸銨濃度、陰離子柱層析的緩沖液和洗脫液的濃度、凝膠柱層析的緩沖液濃度等條件，制得α-半乳糖苷酶。所得α-半乳糖苷酶的比酶活高于綠咖啡豆來源的商品α-半乳糖苷酶的比酶活，本發(fā)明方法制得的α-半乳糖苷酶能夠獲得更加廣泛的應用，特別是在低聚糖轉(zhuǎn)糖苷方面的應用研究。
文檔編號C12N9/40GK101280294SQ20081010027
公開日2008年10月8日 申請日期2008年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月9日
發(fā)明者徐學明, 沈汪洋, 謝正軍, 趙建偉, 金征宇 申請人:江南大學