專利名稱：五價重組人乳頭瘤病毒疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人乳頭瘤病毒感染的預(yù)防和治療領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及
五價(HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33)重組人乳頭瘤病毒聯(lián)合
疫苗及其應(yīng)用。
背暴按術(shù)
子宮頸癌(Cervical Cancer)每年直接造成約超過30萬成年女性死亡(國 際衛(wèi)生組織資料)，成為世界范圍內(nèi)僅次于乳腺癌的威脅婦女生命健康的第二 號殺手。科學(xué)研究證實，導(dǎo)致宮頸陴的罪魁禍?zhǔn)资且环N名為人乳頭瘤病毒 (Human Papill(MMvirus，簡稱H+V)的DNA致癌病毒。該病毒主要通過兩 性接觸傳染，專性侵染人體上皮細(xì)l胞特別是生殖器官，部分病毒攜帶者在反 復(fù)感染后表現(xiàn)出多種臨床癥狀。女性受高危險型(HPV16、 HPV18等)病毒感 染后，小部分患者由最初的宮頸細(xì)胞學(xué)異常，發(fā)展成I - III的宮頸內(nèi)皮細(xì)胞 瘤樣變(CIN I-III )和浸潤性宮頸癌變(ICC)，最終發(fā)展成致命的子宮頸癌。 部分低危險型(HPV6、 HPV11)病毒感染可導(dǎo)致男女兩性生殖器官部位的尖銳 濕疣。
最新研究表明HPV除了直接導(dǎo)致宮頸癌，還與支氣管肺癌、直腸癌、口
腔癌和皮膚癌有重大關(guān)系。根據(jù)國際衛(wèi)生組織冊O(shè)的有關(guān)資料，除了導(dǎo)致官 頸癌，HPV感染還可能解釋60。/。的皮膚癌，60%的食管癌，50%的肺癌、50 %的乳腺癌、25%的口腔癌等人類重大癌癥。
HPV病毒在長期的進(jìn)化中形成了上百種變異類型，其中HPV16、 HPV18等 13種高危險型確認(rèn)能夠?qū)е聦m頸癌癥。HPV6、 HPV11等低危險型是造成男女 生殖部位尖銳濕疣的關(guān)鍵病原體。為獲得良好的療效，能同時預(yù)防多種HPV 型感染的多價疫苗成為發(fā)展方向。

發(fā)明內(nèi)容
3(一) 要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明的目的之一是提供五價(HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和 HPV33)重組人乳頭瘤病毒聯(lián)合疫苗；本發(fā)明的另一目的是提供該重組人乳
頭瘤病毒疫苗在制備藥物中的應(yīng)用。
(二) 技術(shù)方案
本發(fā)明所述的五價重組人乳頭瘤病毒聯(lián)合疫苗，它包括活性成分以及佐 劑、可藥用的賦型劑、穩(wěn)定劑等輔料，其特征在于所述的活性成分包括重組 HPV的L1蛋白五聚體，所述HPV型為HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和 HPV33。
所述輔料中的佐劑包括鋁鹽、3-0-去?；瘑瘟姿犷愔?3D-MPL)、脂質(zhì)
A衍生物。
所述輔料中的賦型劑包括生理鹽水及其它藥物上可接受的賦型劑。
所述輔料中的穩(wěn)定劑包括基于磷酸鹽的生理緩沖液。
所述HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33的Ll蛋白五聚體含量 均為20-50yg/支疫苗。
本發(fā)明所述的疫苗還可包括HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33 的L2蛋白、其它能與HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33蛋白五聚 體結(jié)合的蛋白，例如HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33的E6/E7蛋 白。
一種生產(chǎn)所述疫苗的方法，它包括如下步驟
(1) 表達(dá)、分離、純化重組HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33
的L1蛋白五聚體；
(2) 將所得L1蛋白五聚體與輔料混合制劑，得到五價重組人乳頭瘤病 毒疫苗。
其中，表達(dá)、分離、純化重組HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33 的Ll蛋白五聚體的具體方法參見專利PCT/CN2008/000314 、 CN200810055700.5，得到純度均為95%以上的Ll蛋白五聚體。
4本發(fā)明公開了所述疫苗在制備用于預(yù)防和/或治療由HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33引起的感染和疾病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還公開了所述疫苗在制備用于預(yù)防和/或治療由于抗體交叉反應(yīng) 而由HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33以外的其它一種或多種HPV 型引起的感染和疾病的藥物中的應(yīng)用。
前述的感染和疾病包括子宮頸癌、尖銳濕疣、乳腺癌、支氣管肺癌、直 腸癌、食道癌、咽癌、口腔癌、皮膚癌及其它與HPV密切相關(guān)的疾病。
優(yōu)選地，所述的感染和疾病是尖銳濕疣和子宮頸癌。
本發(fā)明所述的疫苗可釆用多種方法作用于人體，包括肌肉和皮下注射。
該疫苗在能引發(fā)對L1蛋白免疫反應(yīng)的有效劑量范圍內(nèi)使用。用于增強(qiáng)免疫反
應(yīng)的復(fù)合物的特定劑量依照Ll復(fù)合物不同而變化。 一般而言，Ll五聚體的
用量在l-5pg/Kg體重之間。上述劑量范圍并不排除更高或更低劑量的可能。
例如，具體的劑量會根據(jù)是否伴隨有其他藥物劑量而定，或取決于個人的藥
代動力學(xué)、藥物積累和代謝速率。 (三)有益效果
本發(fā)明所述的疫苗能夠預(yù)防95 %的尖銳濕疣和75 %的子宮頸癌。該疫苗 的活性成分為HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33L1蛋白的五聚體,該五 聚體與HPV Ll蛋白的VLP (類病毒顆粒，為HPV Ll蛋白的七十二聚體)具 有相同的免疫原性和抗原性，且相對于VLP而言具有結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定、工業(yè)成本 大幅降低的優(yōu)點。本發(fā)明所述的疫苗與目前已有的疫苗相比，質(zhì)量穩(wěn)定、成 本低廉，防治范圍更大。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例l五價重組人乳頭瘤病毒疫苗的制備
以下步驟中涉及的基因克隆、修飾等的操作參見PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。一、HPV6 Ll五聚體的制備
1、 克隆HPV6 Ll衣殼蛋白基因，克隆到T-Easy vector質(zhì)粒(購自美國 Promega生物試劑公司)上。
2、 修飾HPV6L1衣殼蛋白基因，并在大腸桿菌中表達(dá)將含有堿基替代 突變的載有HPV6 Ll基因插入片段的表達(dá)質(zhì)粒pGEX - 6-l通過熱激法導(dǎo)入大腸 桿菌BL21細(xì)胞之后，使用LB培養(yǎng)基(配方見《分子克隆》第三版，科學(xué)出版 社，2002年8月出版)進(jìn)行攝氏37度培養(yǎng)，菌種接入后生長12小時開始用表達(dá) 誘導(dǎo)劑IPTG (購自美國Promega公司)誘導(dǎo)，9小時后收獲細(xì)胞，細(xì)胞用Niro Soavi NS2006型高壓勻質(zhì)機(jī)在800bar下重復(fù)破碎細(xì)胞2次，顯微鏡檢査細(xì)胞破 碎率達(dá)到90%以上。
3、 HPV6L1蛋白五聚體的分離、純化上清溶液中的L1蛋白經(jīng)親和色譜 純化蛋白預(yù)裝谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂(Amersham公司生產(chǎn)的Glutathione S印harose 4 B)色譜柱，取濃度為50%的Glutathione Sepharose 4 B勻漿 放入色譜柱中(每200ml蛋白清液需要5-10ml勻漿)。用5-10倍的柱床體積的 緩沖液A(組分為50mmol/LTric-HCl， 200畫1/L NaCl， lmmol/L EDTA ， pH 8.0)洗滌樹脂，將蛋白清液加入色譜柱中，與樹脂混合均勻并在室溫下作用 20分鐘后放出濾過液，用10倍柱床體積的緩沖液A洗滌樹脂柱。用電鏡觀察純 化產(chǎn)物，得到HPV6 Ll的五聚體。
二、 釆用與前述相同的方法制備HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33 Ll蛋白 的五聚體。
三、 活性成分與輔料混合將純化的HPV16 Ll的五聚體與含有100mMNaCl 的標(biāo)準(zhǔn)磷酸緩沖液(見《分子克隆實驗指南》第三版，)通過緩沖液置換(buffer exchange,見《分子克隆實驗指南》第三版)方式混合，使得L1五聚體保存 在pH值為7. 2的磷酸緩沖液中，通過調(diào)整使得重組HPV6蛋白五聚體含量為20 lig/支疫苗、HPVll蛋白五聚體含量為20]Lig/支疫苗、HPV16蛋白五聚體含 量為40 n g/支疫苗、HPV18蛋白五聚體含量為40 |i g/支疫苗和HPV33蛋白五 聚體含量為30yg/支疫苗，制劑成為五價重組人乳頭瘤病毒疫苗，在4。C保存。實施例2五價重組人乳頭瘤病毒疫苗的制備
以下步驟中涉及的基因克隆、修飾等的操作參見PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。
一、HPV6 Ll五聚體的制備
1、 克隆HPV6 Ll衣殼蛋白基因,克隆到T-Easy vector質(zhì)粒(購自美國 Promega生物試劑公司)上。
2、 修飾HPV6L1衣殼蛋白基因，并在大腸桿菌中表達(dá)將含有堿基替代 突變的載有HPV6 Ll基因插入片段的表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6-l通過熱激法導(dǎo)入大腸 桿菌BL21細(xì)胞之后，使用LB培養(yǎng)基(配方見《分子克隆》第三版，科學(xué)出版 社，2002年8月出版)進(jìn)行攝氏37度培養(yǎng)，菌種接入后生長12小時開始用表達(dá) 誘導(dǎo)劑IPTG (購自美國Promega公司)誘導(dǎo)，9小時后收獲細(xì)胞，細(xì)胞用Niro Soavi NS2006型高壓勾質(zhì)機(jī)在800bar下重復(fù)破碎細(xì)胞2次，顯微鏡檢查細(xì)胞破 碎率達(dá)到90%以上。
3、 HPV6L1蛋白五聚體的分離、純化上清溶液中的L1蛋白經(jīng)親和色譜 純化蛋白預(yù)裝谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂(Amersham公司生產(chǎn)的Glutathione Sepharose 4 B)色譜柱，取濃度為50%的Glutathione Sepharose 4 B勾漿 放入色譜柱中(每200ml蛋白清液需要5-10ml勻漿)。用5-10倍的柱床體積的 緩沖液A(組分為50腿ol/L Trie-HC1， 200mmol/L NaCl， lmmol/L EDTA ， pH 8.0)洗滌樹脂，將蛋白清液加入色譜柱中，與樹脂混合均勻并在室溫下作用 20分鐘后放出濾過液，用10倍柱床體積的緩沖液A洗滌樹脂柱。用電鏡觀察純 化產(chǎn)物，得到HPV6 Ll的五聚體。
二、釆用與前述相同的方法制備HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33 Ll蛋白 的五聚體。
三、活性成分與輔料混合將純化的HPV16 Ll的五聚體與含有100mM NaCl的標(biāo)準(zhǔn)磷酸緩沖液(見《分子克隆實驗指南》第三版，)通過緩沖液置換 (buffer exchange,見《分子克隆實驗指南》第三版)方式混合，使得L1五聚體保存在pH值為7.2的磷酸緩沖液中，同時加入氫氧化鋁150pg，通過 調(diào)整通過調(diào)整使得重組HPV6蛋白五聚體含量為30jLig/支疫苗、HPV11蛋白五 聚體含量為20nig/支疫苗、HPV16蛋白五聚體含量為40Mg/支疫苗、HPV18 蛋白五聚體含量為20 )a g/支疫苗和HPV33蛋白五聚體含量為40 |u g/支疫苗， 制劑成為五價重組人乳頭瘤病毒疫苗，在rc保存。
實施例3五價重組人乳頭瘤病毒疫苗的制備
以下步驟中涉及的基因克隆、修飾等的操作參見PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。
一、HPV6 Ll五聚體的制備
1、 克隆HPV6 Ll衣殼蛋白基因，克隆到T-Easy vector質(zhì)粒(購自美國 Promega生物試劑公司)上。
2、 修飾HPV6L1衣殼蛋白基因，并在大腸桿菌中表達(dá)將含有堿基替代 突變的載有HPV6 Ll基因插入片段的表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6-l通過熱激法導(dǎo)入大腸 桿菌BL21細(xì)胞之后，使用LB培養(yǎng)基(配方見《分子克隆》第三版，科學(xué)出版 社，2002年8月出版)進(jìn)行攝氏37度培養(yǎng)，菌種接入后生長12小時開始用表達(dá) 誘導(dǎo)劑IPTG (購自美國Promega公司)誘導(dǎo)，9小時后收獲細(xì)胞，細(xì)胞用Niro Soavi NS2006型高壓勻質(zhì)機(jī)在800bar下重復(fù)破碎細(xì)胞2次，顯微鏡檢查細(xì)胞破 碎率達(dá)到90%以上。
3、 HPV6L1蛋白五聚體的分離、純化上清溶液中的L1蛋白經(jīng)親和色譜 純化蛋白預(yù)裝谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂Umersham公司生產(chǎn)的Glutathione S印harose 4 B)色譜柱，取濃度為50%的Glutathione Sepharose 4 B勾漿 放入色譜柱中(每200ml蛋白清液需要5-10ml勻漿)。用5-10倍的柱床體積的 緩沖液A(組分為50mmol/LTric-HC1， 200咖ol/L NaCl， l咖ol/L EDTA ， pH 8.0)洗滌樹脂，將蛋白清液加入色譜柱中，與樹脂混合均勻并在室溫下作用 20分鐘后放出濾過液，用10倍柱床體積的緩沖液A洗滌樹脂柱。用電鏡觀察純 化產(chǎn)物，得到HPV6 Ll的五聚體。二、 釆用與前述相同的方法制備HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33 Ll蛋白 的五聚體。
三、 活性成分與輔料混合將純化的HPV16 Ll的五聚體與含有100mM NaCl的標(biāo)準(zhǔn)磷酸緩沖液(見《分子克隆實驗指南》第三版，)通過緩沖液置 換(buffer exchange,見《分子克隆實驗指南》第三版)方式混合，使得 Ll五聚體保存在pH值為7. 2的磷酸緩沖液中，通過調(diào)整使得重組HPV6蛋 白五聚體含量為40jag/支疫苗、HPV11蛋白五聚體含量為40jug/支疫苗、 HPV16蛋白五聚體含量為20)ig/支疫苗、HPV18蛋白五聚體含量為20|ig/ 支疫苗和HPV33蛋白五聚體含量為30jLig/支疫苗，制劑成為五價重組人乳 頭瘤病毒疫苗，在4'C保存。
權(quán)利要求
1、五價重組人乳頭瘤病毒聯(lián)合疫苗，它包括活性成分以及佐劑、可藥用的賦型劑、穩(wěn)定劑等輔料，其特征在于所述的活性成分包括重組HPV的L1蛋白五聚體，所述HPV型為HPV6、HPV11、HPV16、HPV18和HPV33。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于所述輔料中的佐劑包括 鋁鹽、3D-MPL、脂質(zhì)A衍生物。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的疫苗，其特征在于所述輔料中的穩(wěn)定劑包括基 于磷酸鹽的生理緩沖液。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的疫苗，其特征在于所述重組HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18、 HPV33的Ll蛋白五聚體含量均為20 - 50 u g/支疫苗。
5、 一種生產(chǎn)如權(quán)利要求1-4之任一所述疫苗的方法，它包括如下步驟(1) 表達(dá)、分離、純化重組HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33 的L1蛋白五聚體；(2) 將所得L1蛋白五聚體與輔料混合制劑，得到五價重組人乳頭瘤病 毒聯(lián)合疫苗。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗在制備用于預(yù)防和/或治療由HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33引起的感染和疾病的藥物中的應(yīng)用。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗在制備用于預(yù)防和/或治療由于抗體交叉 反應(yīng)而由HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33以外的其它一種或多種 HPV型引起的感染和疾病的藥物中的應(yīng)用。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其特征在于所述的感染和疾病包括 子宮頸癌、尖銳濕疣、乳腺癌、支氣管肺癌、直腸癌、食道癌、咽癌、口腔 癌、皮膚癌及其它與HPV密切相關(guān)的疾病。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述的感染和疾病是尖銳濕 疣和子宮頸癌。
全文摘要
本發(fā)明提供了五價重組人乳頭瘤病毒疫苗，它包括活性成分以及佐劑、可藥用的賦型劑、穩(wěn)定劑等輔料，其中活性成分包括重組HPV的L1蛋白五聚體，所述HPV型為HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV33。該疫苗能夠預(yù)防95％的尖銳濕疣和75％的子宮頸癌。本發(fā)明所述的疫苗與目前已有的疫苗相比，質(zhì)量穩(wěn)定、成本低廉，防治范圍更大。
文檔編號C12N15/70GK101530614SQ20081010163
公開日2009年9月16日 申請日期2008年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月10日
發(fā)明者陳小江, 馬潤林 申請人:北京康樂衛(wèi)士生物技術(shù)有限公司