專利名稱：利用臍帶胎盤制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，尤其是利用臍帶胎盤 制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs )是近年來研究的 一個熱點(diǎn)，間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化能力，體外擴(kuò)增能力強(qiáng)，抗原 性弱，不涉及倫理道德等問題。
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是骨髓中中胚層來源的未分化細(xì)胞， 具備分化為成骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種組織細(xì)胞及高增 殖的潛能。其有以下優(yōu)勢①取材方便；②對供體健康無害；(D體外 擴(kuò)增能力強(qiáng)、不易丟失細(xì)胞表型；④不存在組織配型的問題。但是隨 著年齡的增長，骨髓中BMSCs的含量會降低，增加了分離培養(yǎng)的難度， 而且得到的細(xì)胞增殖分化的能力會降低。
近些年來，人們從臍帶、胎盤中也陸續(xù)分離出間充質(zhì)干細(xì)胞。其 具有骨髓基質(zhì)干細(xì)胞相同的特點(diǎn)，細(xì)胞的擴(kuò)增分化能力不受年齡的影 響。胎盤及臍帶來源豐富，其間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)量^L高，因此，可為臨床 應(yīng)用、組織工程提供理想的種子細(xì)胞。
許多專利申請公開了制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，例如國際專利申 請WO2005/121317中公開了從人類組織中獲得具有高均質(zhì)性細(xì)胞懸液 的間充質(zhì)纟田月包的方法；國際專利申請WO2005/045010、 WO2005/045011
4中公開了自臍帶血分離和培養(yǎng)間充質(zhì)細(xì)胞的方法；中國專利CN100344757C中公開了 一種人胎盤、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫及其構(gòu)建方法，在這些專利申請中，間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基中主要采用青霉素、鏈霉素作為抗生素，并且使用動物源性的血清、胰蛋白酶等物質(zhì)培養(yǎng)或消化細(xì)胞。由于青霉素容易導(dǎo)致過敏反應(yīng)，而鏈霉素對人體有潛在毒性，對間充質(zhì)細(xì)胞以后應(yīng)用于人類疾病的治療有潛在危險(xiǎn)。另外，在將間充質(zhì)干細(xì)胞用于人類疾病治療時(shí)，降低動物源性物質(zhì)對人類的影響也是必要的。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是 一種利用臍帶胎盤制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，所述間充質(zhì)干細(xì)胞來源于臍帶胎盤中分離培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞，在間充質(zhì)培養(yǎng)基中體外擴(kuò)增后，再冷凍保存。
所用的組織來源是人的臍帶或胎盤。
所述的制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括臍帶或胎盤的機(jī)械切割、酶消化，間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)，間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增，間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存。
所述的制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，首先將臍帶或胎盤進(jìn)行機(jī)械切割，然后使用膠原酶消化，制備成單細(xì)胞懸液。
所述的膠原酶濃度為0.01-1%,使用培養(yǎng)基配制。
所述的膠原酶濃度為0.1%,使用DMEM / F12培養(yǎng)基配制。
間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基為低胎牛血清培養(yǎng)基(胎牛血清含量^5% )。臍帶胎盤的機(jī)械切割、酶消化、間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)、體外擴(kuò)增、凍存所用液體中加的抗生素不包括青霉素及鏈霉素。
臍帶胎盤的機(jī)械切割、酶消化、間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)、體外擴(kuò)
增、凍存所用液體中加的抗生素為慶大霉素，濃度為lOOOOu/L-40000u/L，建議濃度20000u/L。
間充質(zhì)干細(xì)胞凍存所用血清為人血清。
間充質(zhì)千細(xì)胞消化傳代所用酶無動物源性。
間充質(zhì)干細(xì)胞消化傳代所用酶為TrypLE Select。
所述的利用臍帶胎盤制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括以下步驟
A、 將體外處理干凈的臍帶胎盤經(jīng)過機(jī)械切碎后，再經(jīng)過膠原酶消化為單細(xì)胞懸液，洗滌去除膠原酶殘留，之后接種于培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿或培養(yǎng)袋內(nèi)；
B、 在低胎牛血清間充質(zhì)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)數(shù)次換液、傳代后得到較純的間充質(zhì)干細(xì)胞；
C、 將獲得的間充質(zhì)細(xì)胞重懸于含人血清20%-90%的DMEM/F12培養(yǎng)基中，加入冷凍保護(hù)劑，使用程控降溫儀或非程控降溫，深低溫氣相中永久保存。
上述方法制備的間充質(zhì)干細(xì)胞可用于實(shí)驗(yàn)研究，也可在臨床上用于與造血干細(xì)胞共移植治療血液系統(tǒng)疾病或其它胂瘤的輔助治療，直接或經(jīng)基因修飾后用于治療腦血管、心血管、外周血管閉塞性疾病或其他存在供血障礙的疾病，還可用于腫瘤性及炎癥性疾病抑制血管新生，還可用于組織工程中作為種子細(xì)胞。
本發(fā)明的有益效果使用本方法制備的間充質(zhì)干細(xì)胞具有良好增
殖潛力，而且來源豐富，供者無痛苦，致敏及動物源性物質(zhì)含量少，為解決間充質(zhì)干細(xì)胞的來源及增殖能力差的問題提供了解決方法，為組織工程提供良好的種子細(xì)胞來源，可建成細(xì)胞庫，快速、反復(fù)、大量提供細(xì)胞來源。


圖1為本發(fā)明制備的間充質(zhì)干細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式
下面，結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不受限于下述實(shí)施例。
實(shí)施例l:臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞制備方法
1、 取健康足月順產(chǎn)嬰兒臍帶，用加入含慶大霉素(濃度2-4萬U/L)肝素(濃度50-200U/ml)的生理鹽水沖洗表面，去除殘留血液及可能的細(xì)菌污染，至少三次，每次更換容器及器械。
2、 機(jī)械粉碎組織，加入4 - 5倍體積的0.01-1%膠原酶消化液，37°C ,攪拌，4-12小時(shí)后收集消化液，200目濾網(wǎng)過濾，細(xì)胞懸液加入2倍體積洗滌液(DMEM/F12)洗滌兩遍，使用低胎牛血清間充質(zhì)培養(yǎng)基
(MesenPRO RSTM Medium, invitrogen)重懸沉淀后接種于培養(yǎng)瓶中，24 - 72小時(shí)后全量換液，每3天半量換液。3、 待細(xì)胞生長至80-90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代操作。棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞一次，加入TrypLE Select (invitrogen)消化5-10分鐘，加入無血清DMEM / F12終止消化，離心棄上清，再加入無血清DF12洗滌一次。沉淀用適量低胎牛血清間充質(zhì)培養(yǎng)基重懸，按l: 2-3傳代。培養(yǎng)3-4代后取樣鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞，其余細(xì)胞加入凍存液(40%DMEM/F12 50。/。人血清10%DMSO),細(xì)胞濃度106-107/ml，經(jīng)程控降溫后，置于深低溫氣相中永久保存。
4、 間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定。分為免疫表型測定及分化能力測定。
4.1、免疫表型檢測CD14， CD31， CD44， CD45， CD105, CD144,VWF, CD29, CD34， CD73， CD90， CD95， CD 106， KDR， HLA-DR。使用TrypLE Select消化體外擴(kuò)增的第3-4代的間充質(zhì)干細(xì)胞，PBS洗滌2次，分成每管含5xl()S細(xì)胞，第一管加入同型對照抗體(MouseIgGl FITC/Mouse IgGl PE， coulter) 20ul，其余管中加入其它相應(yīng)抗體20ul (或者按使用說明書規(guī)定的試劑量加入)，混勻，室溫避光靜置30分鐘，加入PBS(pH7.2 _ 7.4) 2ml，混勻，300g離心5分鐘，棄上清，加入1。/。多聚曱醛400ul，混勻，即可上機(jī)(流式細(xì)胞儀FACSCalibur， BD)檢測。細(xì)胞免疫表型為CD73、 CD105為陽性，CD31、 vWF、 KDR、 CD34、 CD45、 CD235a、 HLA-DR為陰性。
4.2細(xì)胞的成骨及成脂分化潛能及分化后鑒定
消化體外擴(kuò)增的第3-4代間充質(zhì)干細(xì)胞，以5 x 10Vcm2的密度接種于預(yù)先放置無菌消毒蓋玻片的6孔板中，制備細(xì)胞爬片，每孔加2ml上述分離培養(yǎng)基。在細(xì)胞達(dá)到60% ~70%融合時(shí)，更換誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。4.2.1成骨誘導(dǎo)分化
誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為含有l(wèi)(T7mol/L的地塞米松，10mmol/L (3-磷酸甘油，0. 05mmol / L 2-石粦酸抗壞血酸和10 % FBS的DMEM / F12培養(yǎng)液，每周換液2次，培養(yǎng)21天。取出玻片，PBS洗滌一次，70%酒精固定10分鐘，行茜素紅及范可薩染色，顯微鏡下觀察。范可薩染色可見黑色礦化物沉積，茜素紅染色見細(xì)胞漿中有大量的鈣沉積。
4.2.2成脂誘導(dǎo)分化
誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為含有10—6mol / L的地塞米松，10ug/ml胰島素，0. 5mmol/L異丁基甲基黃嘌吟(IBMX), 200umol / L消炎痛(均為Sigma公司產(chǎn)品)和10 % FBS的DMEM / F12培養(yǎng)液，每周換液2次，培養(yǎng)14天。取出玻片，PBS洗滌一次，70%酒精固定10分鐘，以油紅O染色，鏡檢?？梢娪图t-O染色呈強(qiáng)陽性。
實(shí)施例2:胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞制備方法
1 、取健康足月順產(chǎn)嬰兒胎盤，用加入含慶大霉素(濃度2-4萬U /L )肝素(50-200U/ml)的生理鹽水沖洗表面，去除殘留血液及可能的細(xì)菌污染，至少三次，每次更換容器及器械。
2、 機(jī)械粉碎組織，加入4-5倍體積的膠原酶消化液，37°C，攪拌，4-12小時(shí)后收集消化液，200目濾網(wǎng)過濾，細(xì)胞懸液加入2倍體積洗滌液
(DMEM /F12 )洗滌兩遍，使用低胎牛血清間充質(zhì)培養(yǎng)基(MesenPRORS Medium, invitrogen )重懸沉淀后接種于培養(yǎng)瓶中，24-72小時(shí)后全量換液，每3天半量換液。
3、 待細(xì)胞生長至80-90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代操作。棄去培養(yǎng)基，PBS
9洗滌細(xì)胞一次，加入TrypLETM Select (invitrogen)消化5-10分鐘，加入無血清DMEM / F 12終止消化，離心棄上清，再加入無血清DMEM / F12洗滌一次。沉淀用適量間充質(zhì)培養(yǎng)基重懸，按l: 2-3傳代。培養(yǎng)3-4代后取樣鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞，其余細(xì)胞加入凍存液(40% DMEM / F1250%人血清10%DMSO),細(xì)胞濃度106-107/1111，經(jīng)程控降溫后，置于液氮中永久保存。
4、間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定分為免疫表型測定及分化能力測定
4.1、免疫表型檢測CD14， CD31， CD44, CD45, CD105， CD144，VWF， CD29, CD34， CD73， CD90， CD95, CD106， KDR, HLA-DR。使用1%胰蛋白酶消化體外擴(kuò)增的第3-4代的間充質(zhì)干細(xì)胞，PBS洗滌2次，分成每管含5xl()S細(xì)胞，第一管加入同型對照抗體(Mouse IgGlFITC/ Mouse IgGl PE ) 20ul，其余管中加入其它相應(yīng)抗體20ul (或者按使用說明書規(guī)定的試劑量加入)，混勻，室溫避光靜置30分鐘，加入PBS2ml，混勾，300g離心5分鐘，棄上清，加入1%多聚曱醛400ul，混勻，即可上機(jī)(流式細(xì)胞儀FACSCalibur， BD)檢測。細(xì)胞免疫表型為CD73、 CD105為陽性，CD31、 vWF、 KDR、 CD34、 CD45、 CD235a、HLA-DR為陰性。
4.2細(xì)胞的成骨及成脂分化潛能及分化后鑒定
消化體外擴(kuò)增的第3-4代間充質(zhì)干細(xì)胞，以5xl()S/ci^的密度接種于預(yù)先放置無菌消毒蓋玻片的6孔板中，制備細(xì)胞爬片，每孔加2ml上述分離培養(yǎng)基。在細(xì)胞達(dá)到60% ~70%融合時(shí)，更換誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。
4.2.1成骨誘導(dǎo)分化誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為含有10 —7mol/L的地塞米^>， lOmmol /L (3-磷酸甘油，0. 05mmol/L2-磷酸抗壞血酸和10。/。胎牛血清(FBS)的DMEM-LG/F12培養(yǎng)液，每周換液2次，培養(yǎng)21天。取出玻片，PBS洗滌一次，70%酒精固定10分鐘，行茜素紅及范可薩染色，顯微鏡下觀察。范可薩染色可見黑色礦化物沉積，茜素紅染色見細(xì)胞漿中有大量的鈣沉積。
4.2.2成脂誘導(dǎo)分化
誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為含有10 —6mol / L的地塞米;^， 10ug/ml胰島素，0.5mmol/L異丁基曱基黃噤吟(IBMX), 200umol / L消炎痛(均為Sigma公司產(chǎn)品)和10 % FBS的DMEM-LG / F12培養(yǎng)液，每周換液2次，培養(yǎng)14天。取出玻片，PBS(pH7.2-7.4)洗滌一次，70%酒精固定10分鐘，以油紅O染色，鏡檢?？梢娪图t-O染色呈強(qiáng)陽性。
上述方法制備的間充質(zhì)干細(xì)胞可用于實(shí)驗(yàn)研究，也可在臨床上用于與造血干細(xì)胞共移植治療血液系統(tǒng)疾病或其它腫瘤的輔助治療，直接或經(jīng)基因修飾后用于治療腦血管、心血管、外周血管閉塞性疾病或其他存在供血障礙的疾病，還可用于肺瘤性及炎癥性疾病抑制血管新生。還可用于組織工程中作為種子細(xì)胞。
綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在的實(shí)施例中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)提出其他實(shí)施例，但這種實(shí)施例都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
ii
權(quán)利要求
1、一種利用臍帶胎盤制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括臍帶或胎盤的機(jī)械切割、膠原酶消化，間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)，間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增，間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存，其特征在于，所述的膠原酶使用培養(yǎng)基配制，濃度為0.01-1％。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用臍帶胎盤制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法， 其特征在于，所述的月交原酶使用DMEM / F12培養(yǎng)基配制。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用臍帶胎盤制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法， 其特征在于，間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基為胎牛血清含量^5%的低胎牛血清 培養(yǎng)基。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用臍帶胎盤制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法， 其特征在于，凍存所用液體中加的抗生素為慶大霉素，濃度為10000u/L-40000u/L。
5 、根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用臍帶胎盤制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法， 其特征在于，慶大霉素的濃度為20000u/L。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用臍帶胎盤制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法， 其特征在于，間充質(zhì)干細(xì)胞凍存所用血清為人血清。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用臍帶胎盤制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法， 其特征在于，間充質(zhì)干細(xì)胞消化傳代所用酶無動物源性。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用臍帶胎盤制備含有間充質(zhì)干細(xì)胞的 方法，其特征在于，間充質(zhì)干細(xì)胞消化傳代所用酶為TrypLETMSelect。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用臍帶胎盤制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括以下步驟A、 將體外處理干凈的臍帶胎盤經(jīng)過機(jī)械切碎后，再經(jīng)過膠原酶消化為單細(xì)胞懸液，洗滌去除膠原酶殘留，之后接種于培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿或培養(yǎng)袋內(nèi)；B、 在低胎牛血清間充質(zhì)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)多次換液、傳代后得到 較純的間充質(zhì)干細(xì)胞；C、 將獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞重懸于含人血清20%-90%的DMEM/ F12培養(yǎng)基中，加入冷凍保護(hù)劑，使用程控降溫儀或非程控降溫，深低 溫氣相中永久保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用臍帶、胎盤制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，主要涉及一種間充質(zhì)干細(xì)胞的新型來源及其制備方法。該干細(xì)胞采用胎盤或臍帶作為細(xì)胞來源，首先消化組織，制備單細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿或培養(yǎng)袋中，擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞，然后將擴(kuò)增后的間充質(zhì)干細(xì)胞消化收集后凍存。按照本發(fā)明技術(shù)制備的間充質(zhì)干細(xì)胞，含有大量有良好增殖潛力的間充質(zhì)干細(xì)胞。該間充質(zhì)干細(xì)胞可用于實(shí)驗(yàn)研究臨床治療、組織工程等應(yīng)用。其原料來源豐富、分離成功率及產(chǎn)率高，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，致敏及動物源性物質(zhì)含量低。
文檔編號C12N5/08GK101492654SQ20081010203
公開日2009年7月29日 申請日期2008年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月17日
發(fā)明者孟恒星, 釧 石, 韓俊領(lǐng), 黃家學(xué) 申請人:協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司