專利名稱：篩查牛尿苷酸核酶缺失癥攜帶者的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種篩査牛尿苷酸核酶缺失癥攜帶者的試劑盒。
技術(shù)背景荷斯坦奶牛是當(dāng)前世界各國廣泛使用的奶牛品種，經(jīng)高度的選育與良好的詞養(yǎng) 管理，生產(chǎn)性能不斷提高，在人類生活中發(fā)揮著越來越重要的作用。近年來，由于 選種選配的不斷進(jìn)行，使奶牛間的近交不斷增加，目前世界上大多數(shù)荷斯坦牛都可 以追溯到北美幾頭特別優(yōu)秀的種公牛。在我國，由于大量進(jìn)口種牛、胚胎和冷凍精 液，增加了遺傳缺陷快速傳播的風(fēng)險，因此需要逐步建立完善的檢測及防控體系。遺傳缺陷指的是由于生殖細(xì)胞或受精卵中的遺傳物質(zhì)發(fā)生了結(jié)構(gòu)或功能上的改 變，從而使發(fā)育成的個體出現(xiàn)解剖結(jié)構(gòu)上的異?；蛏頇C(jī)能上的損害。遺傳缺陷可分 為基因突變和染色體畸變兩種。而基因突變有異常染色體隱性基因突變居多。目前 發(fā)現(xiàn)的奶牛遺傳缺陷大多屬于這類突變。由于隱性遺傳缺陷，即雜合型個體雖帶有 一個異常等位基因，但外表看不出來，因此需要借助分子手段進(jìn)行檢測。如兩個親本都是雜合型個體(Aa)(這里以a表示致病基因，A表示正常基因)，那它們的后代就 有l(wèi)/4的可能出現(xiàn)二個隱性致病基因(aa)純合的情況，這樣的個體通常是致死的，即 使是非致死的遺傳缺陷，也會大大影響生產(chǎn)性能。雜合型公牛(Aa)雖然只帶有一個a， 但其卻是a基因攜帶者。這種Aa雜合型公牛常會有健壯外觀，女兒牛表現(xiàn)優(yōu)良，導(dǎo)致 a基因在子代、孫代、曾孫代...逐漸傳遞，經(jīng)過多代的人工授精，a基因攜帶者在 群體中所占比例就大大提高，從而導(dǎo)致帶有二個隱性致病基因(aa)的個體涌現(xiàn)，給奶 牛業(yè)帶來損失。尿苷酸合酶缺乏癥(DUMPS)是荷斯坦牛群中一種由常染色體單基因突變造成 的隱性遺傳疾病，可導(dǎo)致隱性純合的后代胚胎早期死亡。尿苷酸合酶是一種雙功能酶，包括乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(OPRTase)和乳清 酸核苷脫羧酶(ODCase)的活性區(qū)域以及它們之間的一段連接肽。連接肽可能對蛋 白質(zhì)的正確折疊及正?；钚云鹨欢ㄗ饔?，因此這一區(qū)段的突變可能會降低蛋白質(zhì)結(jié) 構(gòu)的穩(wěn)定性，增加溫度不穩(wěn)定性或引起蛋白質(zhì)水解能力的下降。哺乳動物中，尿苷 酸生物合成的最后兩步由尿苷酸合酶(UMPS)催化，使乳清酸轉(zhuǎn)化成尿苷酸。尿苷酸作為一種主要的嘧啶核苷酸，是其它嘧啶核苷酸合成的前體物質(zhì)。嘧啶 核苷酸是核酸(DNA、 RNA)和幾種代謝輔助因子的結(jié)構(gòu)成分，因而對于機(jī)體正常的生長發(fā)育至關(guān)重要?；加心蜍账岷厦溉狈ΠY的奶牛泌乳時，分泌大量的乳清酸到乳汁中，同時奶牛還伴隨有泌乳反應(yīng)誘導(dǎo)的乳清酸尿癥和乳清酸血癥(J丄.Robinsin， D.B.Dombrowski, G.W.Harpee stad and R.D.Shanks, 1984, Detection and prevalence of UMP synthase deficiency among dairy cattle, The Journal of Heredity, 75:277-280 )。尿苷酸合酶缺陷型奶牛的乳汁中乳清酸濃度異常高，為300—1000pg/ml，而正 常奶牛乳中乳清酸的平均濃度僅為80pg/ml。正常奶牛尿中乳清酸水平通常低于 10|ig/ml，但缺陷型奶牛泌乳時尿中乳清酸含量可達(dá)20 — 200(ig/ml。乳清酸的濃度可 以通過比色法進(jìn)行測定，所以此濃度可作為正常和缺陷型奶牛的判別指標(biāo)。但由于 只有當(dāng)奶牛泌乳時，缺陷型奶牛奶中、尿中的乳清酸水平才升高，而且測定誤差較 大， 一般并不常用。正常和缺陷型荷斯坦牛相比，乳中乳糖、？L脂、乳蛋白的濃度和血細(xì)胞比容差 異不大，而且尿苷酸合酶的動力學(xué)常數(shù)、對抑制劑的反應(yīng)、PH值的大小和熱不穩(wěn)定 性也沒有明顯的差異。此外，核苷酸代謝的其它部分，包括紅細(xì)胞PRPP濃度、PRPP 合成酶活性、腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶等在雜 合牛中不受影響。乳清酸是牛乳中的一種常見成分，個體之間含量差異較大。Robinson等人(1983 年)通過連續(xù)5年對250頭荷斯坦泌乳奶牛的觀測發(fā)現(xiàn)，有些奶牛乳中乳清酸的水 平很高，平均超過300iig/ml，而群體的平均值僅為81.8ng/ml。于是他們經(jīng)過進(jìn)一步 地研究分析后，得出這些奶牛乳中乳清酸的大量蓄積是由于其體內(nèi)尿苷酸合酶(Uridine Monophosphate Synthase,簡稱UMPS)缺陷造成的。尿苷酸合酶催化功能 的降低導(dǎo)致了酶作用底物乳清酸的含量升高。實驗室一般以紅細(xì)胞中尿苷酸合酶的 活性作為動物體內(nèi)酶活性的衡量指標(biāo)。根據(jù)紅細(xì)胞中尿苷酸合酶活性的高低，可將 荷斯坦牛群分成兩種表型，其中一種表型的牛只占絕大部分，其體內(nèi)尿苷酸合酶的 活性差不多是第二種表型牛只的兩倍。Shanks等人把前一種表型定義為正常型，后 一種表型定義為缺陷型(Deficiency of Uridine Monophosphate Synthase,簡稱 DUMPS)，缺陷型的牛只也就是患有尿苷酸合酶缺乏癥的個體。另外，Shanks等人 還通過大量的實驗和統(tǒng)計分析得出尿苷酸合酶缺乏癥的遺傳遵循常染色體隱性單 基因的遺傳模式，而且缺陷型的個體是雜合的(Nn)，正常型的個體是顯性純合的(NN)。由于牛群中沒有發(fā)現(xiàn)第三種表型，可以推測隱性純合的基因型具有致死性。 1989年Shanks等人最終實驗證實隱性基因純合的胚胎在母體妊娠40-60天左右死 亡。尿苷酸合酶基因雜合的荷斯坦牛，體內(nèi)紅細(xì)胞、肝臟、脾臟、腎臟、肌肉、乳 腺等組織中尿苷酸合酶的活性只有正常水平的一半。鑒于血樣比其它組織更易于采集和操作，實驗室在80年代至90年代初通常采用紅細(xì)胞尿苷酸合酶活性測定的生 化方法，區(qū)分基因正常和基因雜合的個體， 一般采用分光光度法(SilvaRF, HatfieldD, 1978, Orotate phosphoribosyltransferase: orotidylate decarboxylase (erythrocyte). Methods Enzymol. 1978;51:143-54)和同位素標(biāo)記法(M.E.Jones etal.， 1978; 1986 Jones M.E.,Kavipurapu P.R. and Traut T.W.， 1978， Orotate phosphoribsyltransferase: orotidylate decarbozylase(Ehrlich Ascites Cell), Methods Enzymol., 51:155-167)進(jìn)4亍湖lj 定，而后一種方法使用得較多。它通過測定(7 — "C〕乳清酸轉(zhuǎn)化成尿苷酸過程中 C02的生成量，得到最終結(jié)果，以酶的活性單位表示。尿苷酸合酶的活性單位通常 用每毫升反應(yīng)液在37"C下反應(yīng)10分或20分鐘時所形成產(chǎn)物的微摩爾數(shù)表示。由于生化指標(biāo)的測定常受到生物體、周圍環(huán)境及測定方法本身的影響，結(jié)果的 變動范圍較大，測定的準(zhǔn)確性很難保證；而且不同年齡性別組尿苷酸合酶的活性差 異很大，所以測定時應(yīng)配合對照樣本的使用，這就使得群體中年齡性別組的合理劃 分和組中對照樣本的選取相當(dāng)關(guān)鍵。出于經(jīng)濟(jì)效率的考慮，對照樣不宜過多，但也 不能太少，否則測定準(zhǔn)確性下降，達(dá)不到正確分型的目的。如果將正常個體的尿苷酸合酶活性定義為100%,則缺陷型個體中該酶的活性只 有正常水平的50%，而且個體之間存在著差異，其中年齡和性別對尿苷酸合酶活性 的影響較大。Jones等人(1986)指出初生犢牛中該酶的活性比2歲以上的成年牛高 80%，比1歲的青年牛高11%，公牛比同年齡的母牛酶活性高10%。另外，他們還 觀察到成年泌乳母牛和非泌乳母牛，初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)母牛之間酶活性沒有顯著的差異。 考慮到這些因素的干擾和盡量保證檢測的準(zhǔn)確性，Jones等人(1986)給出了正常和 缺陷型個體酶活性的分界值，分界值定義為正常水平的75%左右。成年母牛的分界 值為1.84單位/毫升，接近于先前得出的1.9單位/毫升的分界標(biāo)準(zhǔn)(Robinson J丄.,Dombrowski D.B.,Clark J.H. and Shanks R.D., 1984, Orotate in milk and urine of dairy cows with a partial deficiency of uridine monophosphate synthase, J. Dairy Sci" 67:1024-1029) 。 1987年，Shanks等人又建議將分界值定為正常水平的2/3，即紅細(xì) 胞中尿苷酸合酶活性在正常水平的33-67%之間時，個體為雜合子；活性低于33%， 為隱性純合子。但由于不同地區(qū)不同牛群自身的特點和環(huán)境條件，育種者應(yīng)結(jié)合本 地實際，通過實驗得出適合本群的分界值。牛尿苷酸合酶cDNA的開放閱讀框編碼一個480氨基酸的蛋白質(zhì)。它具有兩種 酶的催化活性，OPRTase和ODCase處于基因的兩個不同區(qū)段，中間以一條多肽相連。它們分別對應(yīng)于細(xì)菌和真菌中由不同基因編碼的單功能蛋白質(zhì)。1994年Ryan等通過熒光原位雜交(FISH)法將基因定位在牛的第一號染色體 q31區(qū)。牛UMPS的氨基酸序列與人的同源性為84%，小鼠UMPS的氨基酸序列與 人的同源性為82%，說明這個蛋白質(zhì)在哺乳動物中是高度保守的。通過將牛UMPS 基因與人和Dictyosteliumdiscoideum (網(wǎng)柄菌屬)的序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)催化活性中 心的可能區(qū)域保守性較高(Michel Jacquet et al, 1988, S叫uence analysis of the DdPYR5-6 gene coding for UMP synthase in Dictyostelium discoideum and comparison with orotate phosphoribosyl transferases and OMP decarboxylases, Mol. Gen Genet, 1988: 2U:441-445)，但屬于連接肽的中間區(qū)域保守性較差。1994年Schober等最早確定了 UMPS基因的基因組結(jié)構(gòu)(B Schwenger，S Schober and D Simon, 1993, DUMPS Cattle Carry a Point Mutation in the Uridine Monophosphate Synthase Gene, Genomics, 16:241-244)。尿苷酸合酶基因大于25kb， 包括6個外顯子和5個內(nèi)含子，，6個外顯子分別為156bp， 154 bp， 672 bp， 176 bp, 115 bp和415 bp。密碼子405的C/T突變可導(dǎo)致DNA序列上一個Aval酶切位點的 消失，這個點突變位于外顯子5中的第55位，所以根據(jù)該位點的有無可以進(jìn)行分型 工作。研究表明該點突變是造成尿苷酸合酶缺乏癥(DUMPS)的根本原因。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種篩查牛尿苷酸核酶缺失癥攜帶者的試劑盒。 本發(fā)明所提供的篩査尿苷酸核酶缺失癥攜帶者的試劑盒，包括PCR引物和內(nèi)切酶Aval;所述PCR引物為核苷酸序列分別為序列表中序列1和序列表中序列2的脫氧核苷酸組成的引物對。以牛的基因組DNA為模板，用所述核苷酸序列分別為序列表中序列l(wèi)和序列表中 序列2的脫氧核苷酸組成的引物對擴(kuò)增得到自UMPS基因外顯子5第55位5'端第39 — 133位核苷酸序列(即自GenBank Accession Number為X65065的5'端第1208位至1302 位脫氧核糖核苷酸)。所述試劑盒中還包括瓊脂糖凝膠電泳試劑，所述瓊脂糖凝膠電泳試劑包括瓊脂 糖、50xTAE和溴化乙啶貯存液；所述50xTAE為每L含有Tris堿242g、冰乙酸57.1mL、 0.5mol/L EDTA(pI^8.0)100mL的溶液；所述溴化乙啶貯存液為0.01g/L溴化乙啶溶液。所述試劑盒中，還包括非尿苷酸核酶缺失癥攜帶者的基因型RFLP檢測陽性對照 和尿苷酸核酶缺失癥攜帶者的基因型RFLP檢測陽性對照；所述非尿苷酸核酶缺失癥 的基因型RFLP檢測陽性對照為含有38bp, 36bp和21bp的DNA片段的溶液；所述尿苷酸核酶缺失癥攜帶者的基因型RFLP檢測陽性對照為含有74bp， 38bp, 36bp和21bp的 DNA片段的溶液。所述試劑盒中還包括PCR反應(yīng)試劑盒。所述PCR反應(yīng)試劑盒可為市售任意PCR 反應(yīng)試劑盒，其中，包括DNA聚合酶，PCR緩沖液，dATP， dGTP， dCTP， dTTP等 PCR擴(kuò)增試劑。具體可為10x擴(kuò)增緩沖液，4種dNTP混合物，Taq酶(濃度為2xl0617 /L)。用本發(fā)明的試劑盒篩查牛尿苷酸核酶缺失癥攜帶者時，可以待測牛的基因組 DNA為模板，利用擴(kuò)增UMPS基因外顯子5的第55位的單堿基突變的5'端第39—133 位核苷酸的PCR引物(核苷酸序列分別為序列表中的序列1和序列2的一對PCR引物) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后按照下述方法進(jìn)行RFLP分析用內(nèi)切酶AvaI對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶 切；酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖電泳來區(qū)分尿苷酸核酶缺失癥攜帶者和非尿苷酸核酶缺失 癥攜帶者。利用核苷酸序列分別為序列表中的序列1和序列2的一對PCR引物進(jìn)行 PCR-RFLP分析，由于21bp的條帶太短二看不到，因此在瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰 胺凝膠電泳圖譜中，如待測荷斯坦奶牛得到兩條帶(38bp，36bp)，則該待測荷斯坦 奶牛為非尿苷酸核酶缺失癥攜帶者(DUMPS);如待測荷斯坦奶牛得到三條帶，包括 一條74bp的條帶(74bp，38bp，36bp)，則該待測荷斯坦奶牛為尿苷酸核酶缺失癥攜 帶者(UMPS)。本發(fā)明的篩查荷斯坦奶牛尿苷酸核酶缺失癥攜帶者的試劑盒，以基因組DNA為 基礎(chǔ)的檢測牛群DUMPS雜合子的方法是利用PCR—RFLP法對荷斯坦牛的基因型進(jìn) 行直接分型，不受牲畜年齡、性別和基因表達(dá)時間等因素的影響，不使用放射性， 不需要采集對照樣本，既減少了測定的工作量，又可提高測定的準(zhǔn)確性。用其篩査 牛尿苷酸核酶缺失癥攜帶者，不需要特殊的儀器，適合常規(guī)實驗室檢測的需要。


圖1為從部分牛血樣中提取的DNA 圖2為從凍精中提取的DNA 圖3為部分牛UMPS基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖 圖4為部分個體PCR-RFLP結(jié)果(4%瓊脂糖凝膠) 圖5為部分個體PCR-RFLP結(jié)果(12%瓊脂糖凝膠)圖6為UMPS基因包括405密碼子無義突變在內(nèi)的擴(kuò)增片段繪制成的等位基因圖 譜和酶切位點示意圖具體實施方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實施例l、利用篩査牛尿苷酸核酶缺失癥攜帶者的試劑盒的制備及其效果驗證一、篩査牛尿苷酸核酶缺失癥攜帶者的試劑盒的制備本發(fā)明的篩查牛尿苷酸核酶缺失癥攜帶者的試劑盒，包括PCR反應(yīng)試劑，瓊脂 糖凝膠電泳試劑和酶切試劑。它們的具體組成如下PCR弓I物根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中牛UMPS基因序列(GenBank Accession Number 為X65125)，在UMPS基因的外顯子5的第55位(即GenBank Accession Number為 X65125的自5'端第1247位核苷酸)的點突變兩側(cè)(一個AvaI酶切位點的消失)設(shè)計 引物，其中，正向引物(引物I)的序列為5' GAACATTCTGAATTTGTGATTGGT3'(序列表中序列i，該引物由上海生工生物公司合成)，反向引物(引物n)的序列為5' GCTTCTAACTGAACTCCTCGAGT 3'(序列表中序列2，該引物由上 海生工生物公司合成)；正、反向引物濃度均為25umol/L。設(shè)計引物時，為觀察酶切反應(yīng)是否完全，在一個引物中特意將原序列的堿基C 改成堿基G (GenBank Accession Number為X65125的自5'端第1284位核苷酸)，從 而造成一個新的AvaI酶切位點的出現(xiàn)。該引物可以奶牛基因組為模板擴(kuò)增得到95bp PCR產(chǎn)物(自GenBank Accession Number為X65125的5'端第1208位至1302位脫氧核糖 核苷酸)。GenBank Accession Number為X65125的自5'端第1247位堿基均為C，基因 型為純合，即為正常奶牛的基因型，將其命名為AA基因型(UMPS基因純合基因型)， 該基因型的PCR產(chǎn)物用內(nèi)切酶AvaI酶切應(yīng)得到三條帶(38bp, 36bp，21bp) ; GenBank AccessionNumber為X65125的自5'端第1247堿基為同時含有C和T，為雜合基因型， 即尿苷酸核酶缺失癥攜帶者的基因型，將其命名為AB基因型(DUMPS雜合子)， 該基因型的PCR產(chǎn)物用內(nèi)切酶AvaI酶切應(yīng)得到四條帶(74bp,38bp,36bp,21bp)。將 UMPS基因包括405密碼子無義突變在內(nèi)的擴(kuò)增片段繪制成等位基因圖譜和酶切位點 示意圖(如圖6所示，圖中A表示正常?；蚪M擴(kuò)增片段，B表示尿苷酸核酶缺失癥攜 帶者基因組擴(kuò)增片段)。TaqDNA聚合酶(2.5U/uL) 、 10xPCR緩沖液(含Mg2。 、 dNTPs (4x2.5mM) 均購自天根生化科技(北京)有限公司，它們的商品目錄號分別為ET101-02、 CD111-02。2、 瓊脂糖凝膠電泳試劑瓊脂糖西班牙分裝，北京普博欣生物技術(shù)有限公司50xTAE: Tris堿242g、冰乙酸57.1mL、 0.5mol/L EDTA(pH=8.0)100mL，加水充分溶解，定容至1L;溴化乙啶貯存液lg溶于100mL蒸餾水中。3、 酶切試劑Aval內(nèi)切酶(10U/ul)(含酶切緩沖液)，購自北京友誼中銀生物工程科技有限責(zé)任公司；pBR322/Hael11 Markers購自華美生物工程公司。4、非尿苷酸核酶缺失癥攜帶者的基因型RFLP檢測陽性對照和尿苷酸核酶缺失 癥攜帶者的基因型RFLP檢測陽性對照為了方便篩査對比，用含有38bp, 36bp和21bp的DNA片段的溶液作為非尿苷酸核 酶缺失癥的基因型RFLP檢測陽性對照；用含有74bp, 38bp, 36bp和21bp的DNA片段的 溶液作為尿苷酸核酶缺失癥攜帶者的基因型RFLP檢測陽性對照。將測序確認(rèn)的非尿苷酸核酶缺失癥攜帶者的基因型用步驟1所述的PCR反應(yīng)試 劑進(jìn)行擴(kuò)增，然后用Aval內(nèi)切酶酶切PCR反應(yīng)產(chǎn)物得到的溶液，為38bp,36bp和 21bp的DNA片段的溶液，作為非尿苷酸核酶缺失癥攜帶者的基因型RFLP檢測陽性 對照；將測序確認(rèn)的尿苷酸核酶缺失癥攜帶者的基因型用步驟1所述的PCR反應(yīng)試 劑進(jìn)行擴(kuò)增，然后用Aval內(nèi)切酶酶切PCR反應(yīng)產(chǎn)物得到的溶液，為含有74bp, 38bp, 36bp和21bp的DNA片段的溶液，作為尿苷酸核酶缺失癥攜帶者的基因型RFLP檢 測陽性對照。二、利用步驟一制備的試劑盒篩査尿苷酸核酶缺失癥攜帶者 利用步驟一制備的試劑盒對北京奶牛中心良種場(91頭)、北京市南郊杜慶牛 場(82頭)、北京市南郊德茂牛場(190頭)共363頭中國荷斯坦奶牛，烏魯木齊種 牛場的193頭新疆褐牛，以及北京奶牛中心種公牛站的59枚中國荷斯坦公牛凍精進(jìn)行 了尿苷酸合酶(UMPS)基因PCR-RFLP檢測。 1、基因組DNA的提取1) 從血樣中提取基因組DNA采用天根生化科技(北京)有限公司的DP318試劑盒提取凍存血樣DNA，得到?；?因組DNA。從600^d凍存血樣中一般可提得15嗎左右的基因組DNA。每管DNA溶于150pl的 滅菌水中。根據(jù)分光光度計測出的OD26o值，可知基因組DNA的濃度約為100ng/W。 將每頭牛血樣提取的基因組DNA樣品，分別取lul進(jìn)行凝膠電泳，檢測基因組DNA的 提取質(zhì)量，結(jié)果如圖l所示。圖l中M為lkb ladder Marker,泳道l-5為部分牛血樣提取 的基因組DNA。2) 從凍精中提取基因組DNA采用天根生化科技(北京)有限公司的DP318試劑盒提取北京市種公牛站的59枚 中國荷斯坦公牛凍精DNA，得到?；蚪MDNA。由一枚凍精顆粒(大約0.1ml-0.2ml，約含幾千萬個精細(xì)胞) 一般可提得30嗎左右的基因組DNA。每管DNA溶于100)il的滅菌水中。根據(jù)分光光度計測出的00260值， 可知基因組DNA的濃度約為300 ng/pl。將每頭牛凍精顆粒提取的基因組DNA樣品， 分別取lul進(jìn)行凝膠電泳，檢測基因組DNA的提取質(zhì)量，結(jié)果如圖2所示。圖2中M為 lkb ladder Marker,泳道1-5為部分牛凍精顆粒提取的基因組DNA。2、 PCR擴(kuò)增以步驟l提取得到的?；蚪M基因為模板，用步驟一的步驟1的PCR試劑進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系總共25pl， 10x擴(kuò)增緩沖液2.5(1l， 4種dNTP混合物(終濃度為 2.5mmol/L)2[il，引物I (濃度為25pmol/L) 0.5pl，引物II (濃度為25pmol/L) 0.5|^1， 模板DNA (濃度為100ng4iD l|ul， Taq酶(濃度為2xl06U/L) lfil。PCR反應(yīng)程序:先94。C 5min;然后94。C lmin， 60°C lmin， 72°C 30s，總共35個 循環(huán)；最后72'C 7min。對中國荷斯坦母牛、公牛和新疆褐牛的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均得到一 條長為95bp的條帶，擴(kuò)增片段位于牛UMPS基因的外顯子5中。圖3中M為DNA 分子量參照物(pBR322/Hael11 Marker: 587, 540, 504, 458, 434〃267, 234, 213， 192, 184〃124, 123, 109, 89, 80〃64, 57, 51〃21, 18, 11, 8)，其它各泳道為部分牛UMPS基 因的PCR結(jié)果。3、 PCR-RFLP檢湖UPCR產(chǎn)物的酶切取10pl步驟2獲得的PCR產(chǎn)物，加入0.5(il(10U/nl)Aval內(nèi)切酶， 37t:消化2-3小時，分別用4%瓊脂糖凝膠和12.0%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。電泳同 時對步驟一的步驟4的非尿苷酸核酶缺失癥攜帶者的基因型RFLP檢測陽性對照和尿 苷酸核酶缺失癥攜帶者的基因型RFLP檢測陽性對照進(jìn)行電泳，作為判別對照。牛UMPS基因PCR產(chǎn)物的Aval酶切結(jié)果如圖4和圖5所示，結(jié)果表明在北京 奶牛中心良種場和南郊德茂牛場各發(fā)現(xiàn)一頭荷斯坦母牛的基因組，PCR產(chǎn)物用內(nèi)切 酶AvaI酶切得到四條帶(74bp,38bp,36bp,21bp)，與尿苷酸核酶缺失癥攜帶者的 基因型RFLP檢測陽性對照帶型一致，即AB基因型(尿苷酸核酶缺失癥攜帶者)， 其他361頭荷斯坦母牛均得到三條帶(38bp,36bp,21bp)，非尿苷酸核酶缺失癥攜 帶者的基因型RFLP檢測陽性對照帶型一致，即AA基因型(非尿苷酸核酶缺失癥 攜帶者基因型)，在荷斯坦公牛和新疆褐牛中只檢測到AA基因型，未發(fā)現(xiàn)隱性突 變基因的攜帶者(AB基因型)。攜帶隱性致死基因的雜合子(AB基因型)在所檢測的荷斯坦母牛群中出現(xiàn)的頻 率(%)為2x100/363=0.551%。UMPS突變基因(B等位基因)的基因頻率(％)為2xl00/(363x2)=0.275%。 圖4中M為pBR322/HaeHI Marker,第1-3泳道為UMPS正常基因的純合子(AA 基因型)，第4泳道為尿苷酸核酶缺失癥攜帶者基因型(AB基因型)，第5泳道為 PCR產(chǎn)物。圖5中M為pBR322/Hae111 Marker,第1 、 2泳道為PCR產(chǎn)物，第3泳 道為尿苷酸核酶缺失癥攜帶者基因型(AB基因型)，第4泳道為UMPS正?；?的純合子(AA基因型)。 5、序列分析將步驟2擴(kuò)增得到的奶牛的95bp PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析。測序采用PCR產(chǎn)物直接 測序方法，由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。結(jié)果表明這些95bpPCR產(chǎn)物均是自 GenBank AccessionNumber為X65125的5'端第1208位至1302位脫氧核糖核苷酸；表明 所有AA基因型個體(361頭)的UMPS基因的外顯子5的第55位(即GenBank Accession Number為X65125的5'端第1247位核苷酸)堿基為C，基因型為純合，即非尿苷酸核 酶缺失癥攜帶者；所有AB基因型個體(2頭)的UMPS基因的外顯子5的第55位(GenBank Accession Number為UMPS基因的5'端第1247位核苷酸)位堿基同時含有 C和G，為雜合基因型，即尿苷酸核酶缺失癥攜帶者。該測序結(jié)果與PCR-RFLP結(jié)果一致，說明PCR-RFLP結(jié)果準(zhǔn)確。對所有母牛個體 重復(fù)進(jìn)行PCR-RFLP分析，兩次實驗結(jié)果完全一致，證明建立的檢測尿苷酸核酶缺失 癥攜帶者的PCR-RFLP試劑盒穩(wěn)定，結(jié)果可靠。序列表〈160>2<210〉1 <211>24 〈212>DNA 〈213〉人工序列<220><223><400>1gaacattctg aatttgtgat tggt 24<210〉 2 〈211> 23 〈212〉 DNA <213〉人工序列<220〉<223〉<400>2gcttctaact gaactcctcg agt 2權(quán)利要求
1、一種篩查牛尿苷酸核酶缺失癥攜帶者的試劑盒，包括PCR引物對和內(nèi)切酶AvaI；所述PCR引物對為核苷酸序列為序列表中序列1的脫氧核苷酸和核苷酸序列為序列表中序列2的脫氧核苷酸組成的引物對。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括瓊脂糖凝 膠電泳試劑或聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑盒，所述瓊脂糖凝膠電泳試劑包括瓊脂糖、 50xTAE和溴化乙啶貯存液；所述50xTAE為每L含有Tris堿242g、冰乙酸57.1mL、 0.5mol/L EDTA(pI^8.0)100mL的溶液；所述溴化乙啶貯存液為0.01g/L溴化乙啶溶液。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中，還包括非尿苷 酸核酶缺失癥攜帶者的基因型RFLP檢測陽性對照和尿苷酸核酶缺失癥攜帶者的基 因型RFLP檢測陽性對照；所述非尿苷酸核酶缺失癥的基因型RFLP檢測陽性對照為含 有38bp, 36bp和21bp的DNA片段的溶液；所述尿苷酸核酶缺失癥攜帶者的基因型 RFLP檢測陽性對照為含有74bp, 38bp， 36bp和21bp的DNA片段的溶液。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括PCR反應(yīng) 試劑盒；所述PCR反應(yīng)試劑盒包括DNA聚合酶，PCR緩沖液以及dATP， dGTP， dCTP， dTTP的混和物。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項所述的試劑盒，其特征在于所述牛為荷斯坦 牛或新疆褐牛。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種篩查牛尿苷酸核酶缺失癥攜帶者的試劑盒。該試劑盒，包括PCR引物對和內(nèi)切酶AvaI；所述PCR引物對為核苷酸序列為序列表中序列1的脫氧核苷酸和核苷酸序列為序列表中序列2的脫氧核苷酸組成的引物對。以基因組DNA為基礎(chǔ)的檢測牛群DUMPS雜合子的方法是利用PCR-RFLP法對荷斯坦牛的基因型進(jìn)行直接分型，不受牲畜年齡、性別和基因表達(dá)時間等因素的影響，不使用放射性，不需要采集對照樣本，既減少了測定的工作量，又可提高測定的準(zhǔn)確性。用其篩查牛尿苷酸核酶缺失癥攜帶者，不需要特殊的儀器，適合常規(guī)實驗室檢測的需要。
文檔編號C12Q1/68GK101270393SQ20081010206
公開日2008年9月24日 申請日期2008年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月17日
發(fā)明者孫東曉, 松 張, 沅 張 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)