專利名稱：：巖藻糖基化高爾基蛋白gp73抗體及其用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域。具體地，本發(fā)明涉及一種抗巖藻糖基化的GP73蛋白的抗體、一種用于制備所述抗巖藻糖基化的GP73蛋白的抗體的方法、一種用于診斷肝癌的試劑、一種用于診斷肝癌的試劑盒、提供上述的試劑和/或試劑盒在制備用于診斷肝臟疾病的產品中的應用以及一種用于制備純化巖藻糖基化GP73蛋白的方法。
背景技術：
：我國是乙型肝炎大國，由乙型肝炎發(fā)展所致的肝硬化和肝細胞肝癌已為我國醫(yī)療資源帶來了很大的負擔，據最近統計，世界上每新增的2例肝癌患者中就有1例發(fā)生在中國。對肝癌進行早期的診斷和治療是我國肝臟學界面臨的重要任務。上世紀七十年代，以湯釗猷院士為代表的老一輩醫(yī)學家以大規(guī);漠臨床測試曱胎蛋白(AFP)作為早期診斷肝癌的主要手段，繼之以早期的手術切除，在國內以至世界上在小肝癌治療領域里做出了卓越的貢獻。目前AFP已成為臨床上最常用的、幾乎是唯一的肝細胞肝癌的血清標記物。在此后的數十年的臨床實踐中，臨床醫(yī)師發(fā)現AFP還是存在敏感率不甚滿意的缺憾，雖報道不一(33%-85%)，但平均在50%或稍高水平，使部分的早期肝癌患者事實上還是得不到早期的發(fā)現。近年來，基因技術、蛋白質組學、胂瘤免疫等研究飛速發(fā)展，篩選出一些潛在的新的腫瘤標志物。其中，GP73被認為是最值得期待的血清標志物之一。GP73是存在于高爾基體的一種跨膜蛋白，Kladney于2000年首先描述了在正常的人體肝組織中，GP73主要由膽管上皮細胞表達，而肝細胞表達很少甚至不表達。肝細胞受到病毒感染可引起GP73的高表達[1]。Kladney繼續(xù)深入研究，提出不管是由病毒(HBV及HCV)感染引起還是由非病毒原因(酒精性肝病及自身免疫性肝炎)引起的肝病患者中，GP73水平均顯著上調[2。Iftikhar同樣發(fā)現，在急性肝炎(包括病毒性和自身免疫性)和進行性肝硬化患者中，GP73體現出高表達。從而認為GP73的表達途徑可能存在不同的機制，一種由急性肝細胞損傷觸發(fā)，而另一種存在于慢性肝臟疾病*過程中[3]。同時，Maitra提出，GP73在急性及慢性肝臟疾病中都可以體現出高表達，提示這種蛋白對肝臟疾病的病因診斷可能并無幫助，但可以作為肝臟疾病的血清標志物[4]。隨后，Block于2005年首先提出，在肝癌患者血清中，GP73水平顯著升高[5]。在一項包括352名患者的研究中，相比較肝硬化患者，肝癌患者的血清GP73水平顯著升高。如果取臨界值為IO個相對單位，GP73診斷肝癌的敏感性為69%，特異性為75%。對于早期肝癌(Tl:單個結節(jié)，直徑〈2cm及T2:單個結節(jié)，直徑位于2cm5cm之間或小于三個結節(jié)，每個直徑〈3cm)的診斷，GP73的敏感性(62%)顯著優(yōu)于AFP(25%)。而且，AFP水平低于20ng/ml的肝癌患者中，有57%(32/56)的人群GP73水平顯著升高。從而提示，肝癌患者血清中GP73水平顯著升高，且對于早期肝癌的診斷，GP73優(yōu)于AFP，在一項包括80名患者的研究中，GP73診斷肝癌的敏感性和特異性為65%和90%,而巖藻糖基化GP73的敏感性和特異性則高達90%和100%[7]。因此，Cassandra提出，GP73及其異構體是肝癌可靠的肺瘤標志物。美國專利申請文件US20050112711A1，發(fā)明名稱為《Diagnosisandmonitoringofhepatocellularcarcinoma》，其^>開了一種以GP73作為肝細月包癌監(jiān)測指標的診斷和監(jiān)測方法，但未提及糖基化蛋白及其高度敏感和特異性。中國專利申請文件CN101062939A，發(fā)明名稱為《檢測肝癌巖藻糖基化高爾基蛋白GP73的裝置及試劑盒》，其公開了一種用于檢測肝癌巖藻糖基化高爾基蛋白GP73的裝置和試劑盒方法，其抗體為一般性的抗GP73抗體，并非專門針對糖基化蛋白的特異性抗體，其方法需要首先分離出所有糖基化蛋白，然后用抗體檢測GP73，操作復雜。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于，提供一種抗巖藻糖基化的GP73蛋白的抗體。本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種所述抗體在制備用于診斷肝癌(包括肝細胞癌、膽管細胞癌、肝轉移癌，以及肝癌治療后復發(fā))的試劑中的應用。本發(fā)明的又一個目的在于，提供一種用于制備本發(fā)明的抗巖藻糖基化的GP73蛋白的抗體的方法。本發(fā)明還有一個目的在于，提供提供一種用于診斷肝癌(包括肝細胞癌、膽管細胞癌、肝轉移癌，以及肝癌治療后復發(fā))的試劑。本發(fā)明的又一個目的在于，提供一種用于診斷肝癌(包括肝細胞癌、膽管細胞癌、肝轉移癌，以及肝癌治療后復發(fā))的試劑盒本發(fā)明的又一個目的在于，提供上述的試劑和/或試劑盒在制備用于診斷肝臟疾病的產品中的應用。本發(fā)明的又一個目的在于，提供一種用于制備純化巖藻糖基化GP73蛋白的方法。本發(fā)明的又一個目的在于，提供一種能穩(wěn)定分泌所述抗人巖藻糖基化GP73蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞株。本發(fā)明的又一個目的在于，提供抗GP73蛋白的抗體或抗巖藻糖基化的GP73蛋白的抗體在制備用于診斷肝細胞癌、膽管細胞癌、肝轉移癌，以及肝癌治療后復發(fā)的試劑中的應用。針對上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案一方面，本發(fā)明提供一種抗巖藻糖基化的GP73蛋白的抗體，所述抗體優(yōu)選為單克隆抗體。優(yōu)選地，所述抗體是通過以下方法來制備的1)通過PCR獲得人GP73cDNA;2)將l)中獲得的GP73基因亞克隆至pRevHyg載體或稱作pIREShyg(CancerRes.2004,64:3436-43)中；3)轉染PT67包裝細胞；4)產生重組病毒pRevHyg-GP73;5)將4)中得到的重組病毒感染HepG2細胞系；6)收獲感染的H印G2細胞培養(yǎng)液并富集所述的糖基化蛋白親和/離子層析純化；7)以6)中純化得到的巖藻糖基化GP73蛋白作為抗原免疫小鼠，從而制備抗巖藻糖基化GP73蛋白的抗體。另一方面，本發(fā)明提供所述抗體在制備用于診斷肝癌(包括肝細胞癌、膽管細胞癌、肝轉移癌，以及肝癌治療后復發(fā))的試劑中的應用。又一方面，本發(fā)明提供一種用于制備本發(fā)明的抗巖藻糖基化的GP73蛋白的抗體的方法，所述方法包括如下步驟1)通過PCR獲得人GP73cDNA;2)將l)中獲得的GP73cDNA亞克隆至pRevHyg載體或稱作pIREShyg(CancerRes.2004，64:3436-43)中；3)轉染PT67包裝細胞；4)產生重組病毒pRevHyg-GP73;5)將4)中得到的重組病毒毒感染H印G2細胞系；6)收獲感染的H印G2細胞培養(yǎng)液并富集所述的糖基化蛋白親和/離子層析純化；7)以6)中純化得到的巖藻糖基化GP73蛋白作為抗原免疫小鼠，從而制備抗巖藻糖基化GP73蛋白的抗體。另一方面，本發(fā)明提供一種用于診斷肝癌(包括肝細胞癌、膽管細胞癌、肝轉移癌，以及肝癌治療后復發(fā))的試劑，所述試劑包含本發(fā)明所述的抗體，優(yōu)選地，所述試劑還包括藥學上可接受的載體。又一方面，本發(fā)明提供一種用于診斷肝癌(包括肝細胞癌、膽管細胞癌、肝轉移癌，以及肝癌治療后復發(fā))的試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明所述的抗體，優(yōu)選地，所述抗體以鼠抗人巖藻糖基化GP73單抗包被板的形式存在。另一方面，本發(fā)明提供上述的試劑和/或試劑盒在制備用于診斷肝臟疾病的產品中的應用。另一方面，本發(fā)明^R供一種用于制備純化巖藻糖基化GP73蛋白的方法，所述方法包括將GP73基因亞克隆至表達載體中，轉染包裝細胞，產生重組病毒，將所述重組病毒轉染GP73低表達細胞系，收獲細胞并富集所述的糖基化蛋白，以親和層析純化得到所述蛋白。又一方面，本發(fā)明提供一種能穩(wěn)定分泌權利要求1或2的抗人巖藻糖基化GP73蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞抹。又一方面，本發(fā)明提供抗GP73蛋白的抗體在制備用于診斷肝細胞癌、膽管細胞癌、肝轉移癌，以;ot癌治療后復發(fā)的試劑中的應用。又一方面，本發(fā)明提供抗巖藻糖基化的GP73蛋白的抗體在制備用于診斷乙型肝炎、肝內良性占位、肝細胞癌、原發(fā)肝內惡性腫瘤如膽管細胞癌、肝轉移癌和/或肝癌治療后復發(fā)的試劑中的應用。與現有技術相比，本發(fā)明具有如下的明顯優(yōu)點7首先，與現有技術CN101062939A相比，本發(fā)明在國際上率先制備了糖基化GP73的單克隆抗體，可直接檢測糖基化的GP73;而CN101062939A的方法需要首先分離出所有糖基化蛋白，然后用抗體檢測GP73，從而與本發(fā)明具有根本的區(qū)別。因此，本發(fā)明的檢測方法快捷，具有檢測成本低的等特點。其次，本發(fā)明人研究的初步結果確立了我國正常人的GP73相對水平范圍(2.06土0.10);正常人群和非肝病患者的GP73水平相當(尸=0.2925)。肝癌組血清GP73水平與對照組及乙肝攜帶者組相比顯著增高(37.94士4.16vs.2.06±0.10和4.80±0.34,尸=0.0015和0.0058)(表1,圖2、3、4)。GP73診斷HCC的敏感性達到76.9%,特異性達到92.8%，與本組病人AFP的敏感性(48.6%)相比，前者有顯著增高[9'1()](圖5)。這些研究首次在中國初步揭示了GP73在以乙肝為基礎的HCC患者中的高敏感性，它有可能成為臨床上一個新的更有效的肝癌標記物。表1血清GP73水平<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>此外，根據本發(fā)明人的發(fā)現，有理由認為，GP73可能成為更好的診斷肝癌尤其是早期肝癌的血清標志物。我們研究的初步結果確立了我國正常人的GP73相對水平范圍(2.06士0.10);正常人群和非肝病患者的GP73水平相當(尸=0.2925)。肝癌組血清GP73水平與對照組及乙肝攜帶者組相比顯著增高(37.94±4.16vs.2.06±0.10和4.80±0.34，戶=0.0015和0.0058)(表一，圖2、3、4)。GP73診斷HCC的敏感性達到76.9%,特異性達到92.8%,與本組病人AFP的敏感性(48.6%)相比，前者有顯著增高[9'1()](圖5)。這些研究首次在中國初步揭示了GP73在以乙肝為基礎的HCC患者中的高敏感性，它有可能成為臨床上一個新的更有效的肝癌標記物。我們進一步發(fā)現肝臟良性占位性疾病病變的GP73水平不高，而膽管細胞癌的水平升高(7.39±2.40肝轉移癌的GP73接近肝細胞癌的水平(30.27±8.31ii),肝癌手術后的GP73水平明顯下降，復發(fā)后回升(表一，圖6、7)，因此GP73也可用于診斷膽管細胞癌、肝轉移癌，監(jiān)測肝癌治療后是否復發(fā)，評價治療效果，并且可以作為鑒別肝臟良性或惡性腫瘤的一個指標?？梢酝ㄟ^對該巖藻糖基化GP73蛋白或抗體的檢測，對肝癌的發(fā)生、發(fā)展以及是否有轉移進行診斷。更為廣泛地，抗巖藻糖基化GP73蛋白的抗體可用于親和層析、cDNA文庫的篩選、免疫學i貪斷或醫(yī)藥的制備。以下，結合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施例，其中圖1為顯示制備本發(fā)明的糖基化GP73抗體的流程示意圖；圖2顯示GP73在正常組、乙肝攜帶者組和肝癌組血清中的表達，其中，N為組間對照；圖3顯示正常對照組、乙肝攜帶者組和肝癌組的血清GP73水平，其中，圖3A為正常對照組的GP73水平分布圖，圖3B為正常對照組、乙肝病毒(HBV)攜帶組和肝細胞癌(HCC)組的GP73水平比較；圖4顯示GP73診斷HCC的ROC曲線和敏感性、特異性；圖5顯示GP73和AFP的敏感性和特異性對比結果；圖6顯示GP73在其他疾病中表達水平的比4^;圖7顯示GP73在肝癌手術前、手術后及復發(fā)后水平的變化，其中，圖7A為HCC患者術后復發(fā)與否與GP73水平的關系，圖7B為HCC患者術前術后短期復發(fā)與GP73的水平變化；圖8顯示GP73基因的PCR結果；圖9顯示克隆酶切鑒定的陽性結果(+PCR結果)，其中，前6項是酶切，后6項是PCR結果，第1、4被鑒定為正確克??；圖10顯示感染后的HepG2能夠分泌GP73蛋白；圖11顯示用抗巖藻糖基化的GP73蛋白的抗體特異性地識別糖基化的GP73蛋白；圖12顯示用抗巖藻糖基化的GP73蛋白的抗體檢測凝集素(Lectin)來分離的正常組(1)、乙肝攜帶者組(2、3)和肝癌組(4為早期肝癌患者、5為中晚期肝癌患者)血清中的糖基化GP73的結果。具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。但這些實施例4義限于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。實施例l、構建pRevHyg-GP73載體設計GP73引物5'tatggatccatgatgggcttgggaaacg3'禾口5'aggatcgattcagagtgtatgattccgcttttc3';通過PCR才支術擴增人GP73cDNA，酶切位點分別為Clal和Notl(購自Openbiosystems，美國)，使用PFUDNA聚合酶(購自Stratagene，美國)進行PCR反應，(95攝氏度1分鐘、52攝氏度1分鐘、72攝氏度1.2分鐘，共30個循環(huán))，擴增片斷大小為1.2kb(圖8)。將PCR產物和pRevHyg質粒(記載于CancerRes.2004，64:3436-43)用Clal和Notl(購自寶生物工程(大連)有限/>司)雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收，隨后用T4DNA連接酶(購自寶生物工程(大連)有限公司)進行連接，并將連接反應混合物轉化大腸桿菌抹DH5a(購自北京全式金生物技術有限公司)。挑取單克隆于3ml的LB(Amp十)培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，用PlasmidMinikit(購自威格拉斯生物技術(北京)有限公司)小量制備pRevHyg-GP73重組質粒。經PCR和酶切鑒定正確后(圖9),再利用pRevHyg通用引物對插入片段進行測序分析，結果顯示插入片段正確無誤。實施例2、細胞培養(yǎng)HepG2細胞系(ADCC，美國)用含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基(購自北京鈕因應用技術發(fā)展有限公司)在C02培養(yǎng)箱(37度，5%C02)中培養(yǎng)，同時利用實施例l中構建的pRevHyg-GP73質粒轉染病毒包裝細胞PT67(購自Clontech,美國)，經用50ug/ml潮霉素(Hygromycin,購自Sigma，美國)篩選出轉染了pRevHyg-GP73的PT67細胞，并產生pRevHyg-GP73病毒，將其感染HepG2細胞并用50ug/ml潮霉素(購自Sigma,美國)篩選出感染了pRevHyg-GP73病毒的HepG2細胞(HepG2-GP73)。實施例3、Western-blot檢測GP73在HepG2細胞培養(yǎng)液中的表達收集實施例2得到的HepG2-GP73細胞的DMEM培養(yǎng)液(購自北京鈕因應用技術發(fā)展有限公司)，加入一倍量的蛋白變性液([60mMTris-HCl(pH6.8),2%SDS，10%甘油和100mMDTT)，95攝氏度加熱變性，進行4-12。/。SDS-PAGE電泳。將蛋白用半干轉移法轉印至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)。膜用5。/。BSA(Sigma,美國)室溫封閉l小時，依次與l:1000稀釋的GP73抗體(購自SCBT，美國)4度孵育過夜以及1:2000稀釋的以辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG室溫孵育l小時后，在暗室里進行化學發(fā)光(ECL)檢測，結果顯示感染后的HepG2能夠分泌GP73蛋白(抗GP73抗體、購自SCBT,美國)(圖IO)。實施例4、富集糖基化蛋白收集實施例3得到的HepG2-GP73細胞的DMEM培養(yǎng)液(購自北京鈕因應用技術發(fā)展有限公司)，采用親和層析法，富集糖基化蛋白。首先收集HepG2-GP73細胞的DMEM培養(yǎng)液，用0.05mol/L、pH7.0磷酸緩沖液(含0.2mol/LNaCl)透析后上層析柱LentillectinS印harose4B(購自GE,美國)，平衡后用相同的緩沖液洗滌，然后再用在該緩沖液中含有0.211101/1^-曱基0-葡萄糖苷的緩沖液來洗脫，得到含有糖基化蛋白峰，即所需的純化巖藻糖基化蛋白。實施例5、糖基化蛋白中的GP73蛋白純化取實施例4中富集的糖基化蛋白，加入ANX離子層析柱(購自GE，美國)，加0.1-0.5MNaCl洗脫，收集洗脫峰，再濃縮，透析。蛋白定量，經SDS-PAGE檢測純化的GP73蛋白(Fuc-GP73),經WestemBlot確認。實施例6、雜交瘤細胞株的建立及單克隆抗體的制備用實施例5中純化的巖藻糖基化GP73'作為免疫原，接種Balb/c小鼠(中國醫(yī)學科學院^5出所動物中心)，基礎免疫共5次，間隔3周，每次抗原用量為50ug/只。初次用弗氏完全佐劑(購自Sigma,美國)混合乳化，皮下多點，以后用弗氏不完全佐劑(購自Sigma，美國),腹腔注射。每次免疫后1周測效價，在融合前3天以尾靜脈注射加強免疫，抗原用量為100ug/只。取免疫小鼠的脾細胞與NS-1細胞(購自上海中科院細胞庫cellbank,P3/NSI/l-Ag4-l[NS-1](小鼠骨髓瘤細胞，細胞編號TCM25)按常規(guī)方法進行融合，經HAT選擇性培養(yǎng)基(即含有黃噪呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧咬脫氧核苷(thymidin)的20%小牛血清的培養(yǎng)基，購自Sigma,美國)培養(yǎng)，以ELISA法篩選出陽性克隆，再通過有限稀釋法進行兩次亞克隆篩選出能穩(wěn)定分泌抗人巖藻糖基化的GP73蛋白(下稱ii"Fuc-GP73")單克隆抗體(mAb)的雜交瘤細胞抹，并制備mAb腹水，先用液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中去。以HItrapProteinG柱(購自GE,美國)來純化腹水即得所述單克隆抗體(mAb)。所得單克隆抗體(mAb)經Ig亞類測定、效價測定、Westernblot鑒定及單抗識別位點的鑒定，證實其能與實施例5中制得的巖藻糖基化的GP73抗原相結合(圖11、12)而不識別大腸桿菌產生的非糖基化GP73(圖11)。本實施例中所述的非糖基化GP73是通過PCR技術使用如下引物和方法來制備的正向引物ctcagatctgatgggcttgggaaacgggc和反向引物agtgcggccgctcagagtgtatgattccg在PFUDNA聚合酶(購自Stratagene，美國)催化下擴增人GP73cDNA,用Notl和BgIII(購自寶生物工程(大連)有限/>司)酶切后插入PET29a十(購自Novogen,美國)，在BL21菌抹(購自Novogen，美國)表達，然后用鎳離子瓊脂糖凝膠柱(Ni-Agarose柱)(購自GEHealthcare,美國)來純化非糖基化的GP73(購自Novogen,美國)。實施例7、診斷肝臟疾病的巖藻糖基化GP73試劑盒該試劑盒包括包被有實施例6中制得的鼠抗人Fuc-GP73單抗的ELISA板。包被緩沖液(35mMNaHC03,15mMNa2C03,pH9.6)，樣品稀釋液(1*PBS,1%BSA，0.05%NaN3，PH7.2士0.2)(自配)，洗脫液(1*TBS，50mMTris-HCl，pH7.6,150mMNaCl,5%脫脂奶，0.1%Tween20)(自配)，HRP標記的羊抗鼠Ig以及Fuc-GP73標準品。所述試劑盒的制備方法為在ELISA板的每孔中加入1.8-2.2ug/ml實施例6中制得的鼠抗人Fuc-GP73單抗50-100ul，4攝氏度過夜；取出，置于37攝氏度30分鐘；甩去液體，以PBS緩沖液洗滌2-4次；控干，加入1*PBS稀釋的3-5%BSA(小牛血清白蛋白)封閉，100ul/孑L，37攝氏度，2小時；甩去液體，PBS洗滌2次；每孔加入1.8-2.2ug/ml實施例6中制得的鼠抗人Fuc-GP73單抗50-100ul，4攝氏度過夜；甩去液體，洗滌緩沖液洗1-3次；放于4攝氏度，備用。使用時，將采自受試者的血清樣本用樣品稀釋液以1:100稀釋，以50-100ul/孔的體積加樣，37攝氏度60分鐘；甩去液體，用洗滌緩沖液洗滌5次；控干，加入稀，的辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠Ig，50-100ul/孑L,37攝氏度，60分鐘；甩去液體，用洗滌緩沖液洗滌5次；加入化學發(fā)光底物A和B(購自北京科躍中楷生物技術有限公司,HRP化學發(fā)光底物液，產品編號D2-0500,分為A、B液)，25-50ul/孑L,室溫避光孵育15-30分鐘；在酶標〗義上(450nm)測定OD值。用標準品的OD值制作標準曲線，將檢測所得的讀值按標準品曲線計算即得被測血清樣本中Fuc-GP73的含量，并根據被測血清樣本中Fuc-GP73的含量對肝癌的發(fā)生、發(fā)展以及是否有轉移來進行診斷。序列表<110>中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所<120>巖藻糖基化高爾基蛋白GP73抗體及其用途<130>DIC08110037<160>2<170>Patentlnversion3.4<210>1<211>1206<212>DNA<213>人<400>1atgatgggcttgggaaacgggcgtcgcagcatgaagtcgccgcccctcgtgctggccgcc60ctggtggcctgcatcatcgtcttgggcttcaactactggattgcgagctcccggagcgtg120gacctccagacacggatcatggagctggaaggcagggtccgcagggcggctgcagagaga180ggcgccgtggagctgaagaagaacgagttccagggagagctggagaagcagcgggagcag240cttgacaaaatccagtccagccacaacttccagctggagagcgtcaacaagctgtaccag300gacgaaaaggcggttttggtgaataacatcaccacaggtgagaggctcatccgagtgctg360caagaccagttaaagaccctgcagaggaattacggcaggctgcagcaggatgtcctccag420tttcagaagaaccagaccaacctggagaggaagttctcctacgacctgagccagtgcatc480aatcagatgaaggaggtgaaggaacagtgtgaggagcgaatagaagaggtcaccaaaaag540gggaatgaagctgtagcttccagagacctgagtgaaaacaacgaccagagacagcagctc600caagccctcagtgagcctcagcccaggctgcaggcagcaggcctgccacacacagaggtg660ccacaagggaagggaaacgtgcttggtaacagcaagtcccagacaccagcccccagttcc720gaagtggttttggattcaaagagacaagttgagaaagaggaaaccaatgagatccaggtg780gtgaatgaggagcctcagagggacaggctgccgcaggagccaggccgggagcaggtggtg840gaagacagacctgtaggtggaagaggcttcgggggagccggagaactgggccagacccca900caggtgcaggctgccctgtcagtgagccaggaaaatccagagatggagggccctgagcga960gaccagcttgtcatccccgacggacaggaggaggagcaggaagctgccggggaagggaga1020aaccagcagaaactgagaggagaagatgactacaacatggatgaaaatgaagcagaatct1080gagacagacaagcaagcagccctggcagggaatgacagaaacatagatgtttttaatgtt1140gaagatoagaaaagagacaccataaatttacttgatcagcgtgaaaagcggaatcataca1200ctctga141206<210>2<211>401<212>PRT<213>人<■>2MetMetGlyLeuGlyAsnGlyArgArgSerMetLysSerProProLeu151015ValLeuAlaAlaLeuValAlaCyslielieValLeuGlyPheAsnTyr202530TrplieAlaSerSerArgSerValAspLeuGinThrArgHeMetGlu354045LeuGluGlyArgValArgArgAlaAlaAlaGluArgGlyAlaValGlu505560LeuLysLysAsnGluPheGinGlyGluLeuGluLysGinArgGluGin657075LeuAspLyslieGinSerSerHisAsnPheGinLeuGluSerValAsn859095LysLeuTyrGinAspGluLysAlaValLeuValAsnAsnlieThrThr100105110GlyGluArgLeulieArgValLeuGinAspGinLeuLysThrLeuGin115120125ArgAsnTyrGlyArgLeuGinGinAspValLeuGinPheGinLysAsn.130135140GinThrAsnLeuGluArgLysPheSerTyrAspLeuSerGinCyslie145150155AsnGinMetLysGluValLysGluGinCysGluGluArglieGluGlu165170175ValThrLysLysGlyAsnGluAlaValAlaSerArgAspLeuSerGlu180185190AsnAsnAspGinArgGinGinLeuGinAlaLeuSerGluProGinPro8016015195200205ArgLeuGinAlaAlaGlyLeuProHisThrGluValProGinGlyLys210215220GlyAsnValLeuGlyAsnSerLysSerGinThrProAlaProSerSer225230235240GluValValLeuAspSerLysArgGinValGluLysGluGluThrAsn245250255GlulieGinValValAsnGluGluProGinArgAspArgLeuProGin260265270GluProGlyArgGluGinValValGluAspArgProValGlyGlyArg275280285GlyPheGlyGlyAlaGlyGluLeuGlyGinThrProGinValGinAla290295300AlaLeuSerValSerGinGluAsnProGluMetGluGlyProGluArg305310315320AspGinLeuVallieProAspGlyGinGluGluGluGinGluAlaAla325330335GlyGluGlyArgAsnGinGinLysLeuArgGlyGluAspAspTyrAsn340345350MetAspGluAsnGluAlaGluSerGluThrAspLysGinAlaAlaLeu355360365AlaGlyAsnAspArgAsnlieAspValPheAsnValGluAspGinLys370375380ArgAspThrlieAsnLeuLeuAspGinArgGluLysArgAsnHisThr385390395400Leu參考文獻KladneyRD,BullaGA，GuoL，etal.GP73,anovelgolgi畫localizedproteinupregulatedbyviralinfection[J].Gene,2000,249:53-65;KladneyRD,CuiX,BullaGA，etal.ExpressionofGP73,aresidentgolgimembraneprotein,inviralandnonviralliverdisease[J].Hepatology,2002,35:1431—1440;IftikharR,KladneyRD，HavliogluN,etal.Disease-andcell-specificexpressionofGP73inhumanliverdisease[J].AmJGastroenterol,2004,99:1087-1095;MaitraA,ThuluvathPJ.GP73andliverdisease:a(Golgi)complexenigma[J].AmJGastroenterol,2004,99:1096-1098;BlockTM,ComunaleMA，LowmanM,etal.Useoftargetedglycoproteomicstoidentifyserumglycoproteinsthatcorrelatewithlivercancerinwoodchucksandhumans[J].ProcNatlAcadSciUSA，2005,102:779-784;[6]MarreroJA,RomanoPR,NikolaevaO,etal,GP73,aresidentgolgiglycoprotein,isanovelserummarkerforhepatocellularcarcinoma[J].JHepatol,2005,43:1007—1012;DrakeRR,SchweglerEE，MalikQetal.Lectincapturestrategiescombinedwithmassspectrometryforthediscoveryofserumglycoproteinbiomarkers[J].MolCellProteomics，2006,5:1957-1967;CassandraWillyard，Researcherslookfor'sweet，methodtodiagnosecancer[J].NatureMedicine,2007,13:1267;徐海峰、楊華瑜、毛一雷等，改變肝癌早期診斷和治療現狀的新肝癌血清標志物，基礎醫(yī)學與臨床，2008，28:104-108;毛一雷、楊華瑜、徐海峰等，新的肝癌血清標記物GP73在肝癌診斷中的初步研究，《中華醫(yī)學雜志》，2008年4月8日權利要求1.一種抗巖藻糖基化的GP73蛋白的抗體，所述抗體優(yōu)選為單克隆抗體。2.權利要求l所述的抗體，其特征在于，所述抗體是通過包括如下步驟的方法來制備的1)通過PCR獲得GP73cDNA;2)將l)中獲得的GP73cDNA亞克隆至pRevHyg載體中；3)轉染PT67包裝細胞；4)產生重組病毒pRevHyg-GP73;5)將4)中得到的重組病毒感染HepG2細胞系；6)收獲HepG2-GP73細胞的培養(yǎng)液，并用親和-離子層析純化富集所述的糖基化蛋白，所述培養(yǎng)液優(yōu)選為DMEM培養(yǎng)液；7)以6)中純化得到的巖藻糖基化GP73蛋白作為抗原免疫小鼠，從而制備所述的抗巖藻糖基化GP73蛋白的抗體。地，所述肝臟疾病為乙型肝炎、肝內良性占位、肝細胞癌、原發(fā)肝內惡性腫瘤如膽管細胞癌、肝轉移癌和/或肝癌治療(如手術治療)后復發(fā)。4.一種用于制備權利要求1或2的抗巖藻糖基化的GP73蛋白的抗體的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟1)通過PCR獲得GP73cDNA;2)將l)中獲得的GP73cDNA亞克隆至pRevHyg載體中；3)轉染PT67包裝細胞；4)產生重組病毒pRevHyg-GP73;5)將4)中得到的重組病毒感染HepG2細胞系；6)收獲HepG2-GP73細胞的培養(yǎng)液，富集所述的糖基化蛋白并以親和-離子層析純化所述蛋白，所述培養(yǎng)液優(yōu)選為DMEM培養(yǎng)液；7)以6)中純化得到的巖藻糖基化GP73蛋白作為抗原免疫小鼠，從而制備所述的抗巖藻糖基化GP73蛋白的抗體。5.—種用于診斷肝臟疾病(優(yōu)選肝癌)的試劑，其特征在于，所述試劑包含權利要求1或2的抗體，優(yōu)選地，所述試劑還包括藥學上可接受的載體。6.—種用于診斷肝臟疾病(優(yōu)選肝癌)的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權利要求1或2的抗體，優(yōu)選地，所述抗體以鼠抗人巖藻糖基化GP73單抗包^皮纟反的形式存在。7.權利要求5的試劑和/或權利要求6的試劑盒在制備用于診斷肝臟疾病的產品中的應用，優(yōu)選地，所述肝臟疾病為乙型肝炎、肝內良性占位、肝細胞癌、原發(fā)肝內惡性腫瘤如膽管細胞癌、肝轉移癌和/或肝癌治療(如手術治療)后復發(fā)。8.—種用于制備純化巖藻糖基化GP73蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括將GP73cDNA亞克隆至表達載體中，轉染包裝細胞，產生重組病毒，將所述重組病毒感染肝癌細胞并從細胞培養(yǎng)液富集所述的糖基化蛋白，以親和-離子交換層析純化得到所述蛋白。9.一種能穩(wěn)定分泌權利要求1或2的抗人巖藻糖基化GP73蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞抹。10.抗GP73蛋白的抗體在制備用于診斷乙型肝炎、肝內良性占位、肝細胞癌、原發(fā)肝內惡性腫瘤如膽管細胞癌、肝轉移癌和/或肝癌治療(如手術治療)后復發(fā)的試劑中的應用。11.抗巖藻糖基化的GP73蛋白的抗體在制備用于診斷乙型肝炎、肝內良性占位、肝細胞癌、原發(fā)肝內惡性肺瘤如膽管細胞癌、肝轉移癌和/或肝癌治療(如手術治療)后復發(fā)的試劑中的應用。全文摘要本發(fā)明涉及一種抗巖藻糖基化的GP73蛋白的抗體、一種用于制備所述抗巖藻糖基化的GP73蛋白的抗體的方法、一種用于診斷肝癌的試劑、一種用于診斷肝癌的試劑盒、提供上述的試劑和/或試劑盒在制備用于診斷肝臟疾病的產品中的應用以及一種用于制備純化巖藻糖基化GP73蛋白的方法?？梢酝ㄟ^對本發(fā)明所述的巖藻糖基化GP73蛋白或抗體的檢測，對肝癌的發(fā)生、發(fā)展以及是否有轉移進行診斷。更為廣泛地，抗巖藻糖基化GP73蛋白的抗體可用于親和層析、cDNA文庫的篩選、免疫學診斷或醫(yī)藥的制備。文檔編號C12N15/31GK101555282SQ20081010394公開日2009年10月14日申請日期2008年4月11日優(yōu)先權日2008年4月11日發(fā)明者張宏冰,毛一雷申請人:中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所