專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種發(fā)酵生產(chǎn)丁醇和丁二酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)丁醇和丁二酸的方法。技術(shù)背景經(jīng)過(guò)40億年漫長(zhǎng)的演化過(guò)程，地球上才形成今天精確、高效、科學(xué)、穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng)。然而，短短150年間工業(yè)體系的快速發(fā)展，不僅使全球面臨嚴(yán)重的資源和能源危機(jī)，而且引發(fā)全球氣候變暖等諸多嚴(yán)重社會(huì)問(wèn)題，我國(guó)已經(jīng)成為溫室氣體C02的主要貢獻(xiàn)者，排放量己經(jīng)居世界第二位，并將持續(xù)增加。C02既是對(duì)大氣"溫室效應(yīng)"影響最大的氣體，又是地球上最豐富的碳資源。人們可以通過(guò)C02減排和碳封存兩種方法，同時(shí)結(jié)合提高能源生產(chǎn)和使用效率以及增加低碳或非碳燃料的生產(chǎn)和利用等手段來(lái)達(dá)到減緩大氣C02濃度增長(zhǎng)的目標(biāo)。利用微生物固定C02同時(shí)代謝生產(chǎn)有機(jī)酸、醇等是一個(gè)非常有前景的發(fā)展領(lǐng)域。丁醇(Butanol)是一種重要的化工原料，主要用于制造增塑劑、溶劑、萃取劑等，全球年需求量超過(guò)140萬(wàn)噸。丁醇又是一種極具潛力的新型生物燃料，其熱值、辛垸值與汽油相當(dāng)；含氧量與汽油中常用的甲基叔丁基醚相近；不會(huì)腐蝕管道，便于管道輸送；蒸汽壓低，安全性高，且能與汽油以任意比混合。發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮丁醇(又稱(chēng)ABE發(fā)酵)曾經(jīng)是僅次于乙醇的全球第二大發(fā)酵工業(yè)。20世紀(jì)80年代以后，由于化學(xué)合成技術(shù)的不斷發(fā)展和國(guó)際原油價(jià)格的持續(xù)走低，丁醇發(fā)酵逐漸淡出市場(chǎng)。2003年以來(lái)，隨著石油價(jià)格的不斷上漲，世界各國(guó)對(duì)能源安全和資源安全的憂(yōu)慮日增，丁醇發(fā)酵工業(yè)已迎來(lái)產(chǎn)業(yè)復(fù)蘇的大好時(shí)機(jī)。1861年巴斯德首次發(fā)現(xiàn)細(xì)菌能夠產(chǎn)生丁醇，1912年魏茲曼(Weizmaiin)發(fā)現(xiàn)了一種梭菌ao欲Wwmflc"o^/^/cwm能夠?qū)⒌矸坜D(zhuǎn)化為丙酮、丁醇及乙醇。迄今，用于丙酮丁醇發(fā)酵最主要的兩株野生菌為丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌(C/oWW&"maceto6M^//cMm，簡(jiǎn)稱(chēng)丙丁菌)及拜氏梭狀芽孢桿菌(C/oWnW/wm6e|/e〃'"cA://)，這兩種菌均為嚴(yán)格厭氧菌。這兩株菌都能利用淀粉，但在系統(tǒng)發(fā)育上相距較遠(yuǎn)(George,H.ande.al,爿c柳"e,/so/rapawo/,awd6wtowo/prodwc"owAyC7o敗Www6ez)'m-"cA://C7o5^〃V^'wwAw/^/ZcwmjaweC7oWn.cZ/wmawawf/6w2yr/cwm.Appl.Environ.Microbiol"1983.45:p.1160-1163)。在C.aceto^/)^cwm中，丁醇發(fā)酵可以分為兩個(gè)階段發(fā)酵初期，碳源主要轉(zhuǎn)化為乙酸和丁酸；隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)發(fā)酵液pH下降，當(dāng)?shù)孜镞^(guò)量、pH<4.5、乙酸和/或丁酸超過(guò)臨界濃度、且磷酸鹽或硫酸鹽限制細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞開(kāi)始大量合成丁醇、丙酮和乙醇(合稱(chēng)總?cè)軇?。根據(jù)文獻(xiàn)，在多數(shù)未經(jīng)基因改造的菌株發(fā)酵過(guò)程中溶齊U比(丁醇丙嗣乙醇，質(zhì)量比)基本為6:3:1(Nolling,J.ande.al,Gewomese《wewceJ,Bacteriol"2001.183:p.4823-4838)。從上面的代謝途徑可以看出，厭氧發(fā)酵C.0(^0^0;&"附時(shí)，不論產(chǎn)酸階段還是產(chǎn)溶劑階段都會(huì)產(chǎn)生大量co2:根據(jù)文獻(xiàn)，多數(shù)未經(jīng)基因改造的菌株發(fā)酵過(guò)程中溶劑比(丁醇丙酮乙醇，質(zhì)量比)基本為6:3:1，按此比例計(jì)算發(fā)酵生產(chǎn)1噸總?cè)軇┑倪^(guò)程中至少可以產(chǎn)生1.49噸C02，同時(shí)副產(chǎn)一定量H2。大量發(fā)酵廢氣直接排放，不僅會(huì)增加環(huán)境負(fù)擔(dān)，而且會(huì)降低碳源的利用率。目前對(duì)發(fā)酵廢氣綜合利用方面的研究和應(yīng)用還剛剛起步，發(fā)酵廢氣中C02純度較高時(shí)，如白酒發(fā)酵(張廣然，白酒發(fā)酵中的C02回收和利用，釀酒，2003.30(4):p.66-67)，可以用低壓、中壓或高壓法直接將C02液化回收；廢氣成分越復(fù)雜，分離回收的成本越高。丁二酸又稱(chēng)琥珀酸(Succinicacid，succinate),是一種常見(jiàn)的天然有機(jī)酸。自1546年首次從琥珀中分離出來(lái)以后，丁二酸已經(jīng)在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。丁二酸是一種重要的化學(xué)品，可以用于表面活性劑、清潔劑、溶劑等領(lǐng)域，在食品行業(yè)中可以用作pH改良劑、風(fēng)味物質(zhì)或抗菌劑，也可以用作動(dòng)物飼料添加劑及植物助長(zhǎng)劑等。丁二酸在工業(yè)上也是一種重要的四碳化合物，可以轉(zhuǎn)化為很多重要的化學(xué)品，如脂肪酸、1，4-丁二醇、四氫呋喃、Y-丁內(nèi)酯等(Song,H.andS.Lee,/Vo凼c"o"o/swcc/w/cflc/d6少6acfen'a/々rmewto"ow.EnzymeandMicrobialTechnology.,2006.39(3):p.352-361.)，還可以作為單體用來(lái)合成生物可降解材料PBS(聚丁酸琥珀酸)和聚氨酉旨(Willke,T.andK.Vorlop,/"t/usWa/6/oco"vens/o"o/re"e而6/e7^owrcesawa/fer"a&vetocowvew"owa/c/zew&^y.Appl.Microbiol.Biotechnol.,2004.66:p.131-142)。目前已有超過(guò)250種以苯為原料的化工產(chǎn)品可以通過(guò)丁二酸轉(zhuǎn)化獲得，因此丁二酸的市場(chǎng)需求不斷增加。目前市場(chǎng)上銷(xiāo)售的丁二酸都是以液化石油氣或石油為原料化學(xué)法生產(chǎn)的。由于化學(xué)法由丁垸轉(zhuǎn)化為馬來(lái)酐生產(chǎn)丁二酸的成本過(guò)高，丁二酸的產(chǎn)量和銷(xiāo)量并不高，應(yīng)用領(lǐng)域受到很大限制；近年來(lái)由于生物技術(shù)的進(jìn)步，發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸的成本不斷下降，已經(jīng)低于化學(xué)合成法(Willke,T.andK.Vorlop，/m^WnWZ>/oco"vera/o"o/rewewa6/emsowces<xyawate/-w<af"vetocowew"owa/c/em&^y.Appl.Microbiol.Biotechnol.，2004.66:p.131-142)。而且，發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸以葡萄糖等可再生資源為原料，而且生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中可以固定溫室氣體C02，因此對(duì)于資源安全和環(huán)境安全都明顯優(yōu)于化學(xué)合成法。丁二酸是生物三羧酸(TCA)循環(huán)的中間產(chǎn)物，也是很多厭氧代謝過(guò)程的終產(chǎn)物，因此，多數(shù)微生物、動(dòng)、植物都能合成丁二酸。但是能高產(chǎn)丁二酸的體系主要是真菌及細(xì)菌，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能夠生產(chǎn)丁二酸的菌株主要有J"awo6/o5^n7/t/mswc"'"/c^rocfwc6叫v4c"'woZa"'〃Mjswcc,"oge"M,Maf朋/^z'w/a5^cc/"/c^wWmc6wsMBEL55E，Js/erg/〃tww/ger,v4s/erg/〃tis^m〖ga^us，5^wsoc/z/am;vywzVea,丄ewZ/"wstfege"er，尸em.cz.〃/M附v/"i/^""m以及酵母菌iSacc/wfro附j(luò);cescerev/w.ae等。前二者的石開(kāi)究較多，丁二酸合成能力也較高。近年來(lái)也有很多研究者利用基因工程的方法構(gòu)建重組大腸桿菌生產(chǎn)丁二酸。這些菌株合成丁二酸的途徑不盡相同，有些主要是通過(guò)磷酸烯醇式丙酮酸羧化反應(yīng)(Lee,P.,etal.,Swcc/"/cac/t/jWocw"/oww/Arec^cedybrm^^/ow/Ae■sowrce..Biotech.Bioeng.,2001.72(1):p.41-48)，有些是利用更為復(fù)雜的反應(yīng)途徑(Werf，M.V.d.,etal.,五"v/ro,e她///戸'o/og/ca/々cto^sq^fe"/wgAeswcc/"她/vWmCra&o(^n'"gca/-6o/^ra&々-me"她'o"m'"。6"c/〃t^/30Z.ArchMicrobiol,1997.168:p.332-342)。無(wú)論哪種途徑合成丁二酸的過(guò)程中都需要二氧化碳，因此，C02的供給會(huì)影響到丁二酸的合成。有人研究過(guò)提高胞外C02供給對(duì)丁二酸合成的影響，發(fā)現(xiàn)C02供給抑制了v4朋mWo^W〃Mm犯cc/m'c^ra^cmy的生長(zhǎng)，但促進(jìn)了丁二酸的合成(Lee，P.,etal.，<Swcc/"/cac/d/vWmc"o"爿waera6/o—n'〃,swcc/m'cz》ro^cemve^fecteo/f/ze朋c/C6^^"pp/yg/wctwecowce/^raHow.EnzymeandMicrobialTechnology.,1999.24:p.549-554)。另外，Lee等研究發(fā)現(xiàn)，增加112供給也對(duì)丁二酸合成產(chǎn)生正面影響，而且H2:C02以體積比1:19的比例供給時(shí)對(duì)丁二酸合成的促進(jìn)作用最顯著(Lee,P.,etal"SW"'"/c"c/d//Wwc"'o"Z少cowcewfr(3"o".EnzymeandMicrobialTechnology.,1999.24:p.549-554)。根據(jù)化學(xué)計(jì)量式可知，每生產(chǎn)lmol丁二酸需要固定lmol二氧化碳，即每生產(chǎn)1噸丁二酸至少需要補(bǔ)加0.37噸二氧化碳。目前丁二酸發(fā)酵過(guò)程中二氧化碳的補(bǔ)給主要有兩種方法一是直接通入二氧化碳，二是利用碳酸鹽(如碳酸鈉、碳酸鈣或碳酸鎂等)。這兩種方法都需要增加額外的發(fā)酵成本。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵生產(chǎn)丁醇和丁二酸的方法。本發(fā)明提供的發(fā)酵生產(chǎn)丁醇和丁二酸的方法，是在不同的體系中同時(shí)微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇和丁二酸，并將發(fā)酵生產(chǎn)丁醇產(chǎn)生的氣體通入發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的體系中。該技術(shù)方案包括兩個(gè)微生物發(fā)酵系統(tǒng)——丁醇發(fā)酵和丁二酸發(fā)酵，前者發(fā)酵過(guò)程中釋放大量C02，后者在利用葡萄糖轉(zhuǎn)化為丁二酸的過(guò)程中同時(shí)固定C02，將這兩個(gè)過(guò)程集成起來(lái)，丁醇發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的C02和H2用于丁二酸發(fā)酵，既減少丁醇發(fā)酵時(shí)的廢氣排放，又為丁二酸發(fā)酵過(guò)程提供C02和H2，以實(shí)現(xiàn)碳源的循環(huán)利用和節(jié)能減排。所述方法中，所述發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的微生物可為丙酮丁醇梭菌(C/o^^wmflceto6M0;//c"w)或拜氏梭菌(C/oWWaf/wm6ez)'eW"c故)，所述發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的微生物可為產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌(J"flera6/o^/r說(shuō)wmswcc/m'")^oafwcew),琥珀酸放線桿菌"c""o6a"'〃wsswcc/"oge"es)，產(chǎn)琥珀酸巴斯德氏菌(Maf""/e/m/awcc/w/czjwWwcera)MBEL55E，黑曲霉"5perg/〃"51w/ger),煙曲霉(A/erg飾syiwZga加)，或酵母菌(iSflcc/wromycescem^'57'cre)。所述方法中，所述發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的底物為玉米粉或葡萄糖，所述發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的底物為葡萄糖。所述方法中，所述發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的微生物優(yōu)選為丙酮丁醇梭菌(C/oWnVZ/wmflceto6i^//cMm)SB-1CGMCCNo.2287;所述發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的微生物優(yōu)選為琥珀ywcc/wogewes)ATCC55618。所述方法中，所述發(fā)酵生產(chǎn)丁醇產(chǎn)生的氣體經(jīng)過(guò)濾除菌直接通入所述發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的發(fā)酵罐或經(jīng)緩沖罐、氣體流量計(jì)控制通入發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的發(fā)酵罐的量。所述方法中，所述發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的培養(yǎng)基優(yōu)選為玉米粉糊化液；所述玉米粉糊化液中玉米粉的濃度為60-90g/L;所述發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的培養(yǎng)基優(yōu)選為每升含葡萄糖30.0-50.0g,酵母粉10.0g,(NH4)2S045.5g，K2HP04.3H208.6g,NaH2P045.0g,MgS04.7H206.0g,FeS04.7H200.005g。所述方法中，所述發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的pH為5.5-7.0。所述方法中，所述發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸過(guò)程流加葡萄糖補(bǔ)充碳源，葡萄糖濃度維持在5-50g/L(共補(bǔ)加葡萄糖80-120gl")。所述方法中，所述可產(chǎn)生C02的微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的初始濃度為106-107cfU/L;所述可利用C02的微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的初始濃度為106-107cfo/L。所述方法中，所述發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的培養(yǎng)基體積大于或等于所述發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的培養(yǎng)基體積。通過(guò)如下技術(shù)構(gòu)思進(jìn)行分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得到本發(fā)明的上述技術(shù)方案1)兩個(gè)大宗化學(xué)品發(fā)酵過(guò)程集成的思路；2)丁醇發(fā)酵工藝優(yōu)化；3)丁二酸發(fā)酵工藝優(yōu)化；4)丁醇發(fā)酵產(chǎn)氣與丁二酸發(fā)酵耗氣過(guò)程的結(jié)合；5)丁醇發(fā)酵產(chǎn)氣量與丁二酸發(fā)酵耗氣量的相符性分析，不需要增加存儲(chǔ)單元；6)丁醇發(fā)酵尾氣中的H2對(duì)維持丁二酸發(fā)酵環(huán)境提高丁二酸產(chǎn)量有利。本發(fā)明的方法由兩個(gè)重要大宗化學(xué)品的工業(yè)發(fā)酵體系組成，并通過(guò)尾氣/進(jìn)氣管道串聯(lián)起來(lái)利用厭氧發(fā)酵玉米淀粉或葡萄糖生產(chǎn)丁醇、丙酮等，該過(guò)程中產(chǎn)生的尾氣(主要是H2和C02)經(jīng)過(guò)濾除菌直接通入到丁二酸發(fā)酵體系中，C02在丁二酸合成反應(yīng)中被利用，而H2則可以維持丁二酸發(fā)酵體系的厭氧環(huán)境，提高丁二酸產(chǎn)率。該工藝的應(yīng)用可以使丁二酸發(fā)酵過(guò)程中不再添加碳酸鹽，而丁醇和丁二酸發(fā)酵過(guò)程效率也不受影響。本發(fā)明將產(chǎn)生二氧化碳的體系和消耗二氧化碳的體系集成到一個(gè)系統(tǒng)中進(jìn)行，提高了碳源利用率和設(shè)備利用率，減少了發(fā)酵工業(yè)廢氣的排放，降低了發(fā)酵成本；在兩個(gè)發(fā)酵體系中只需加設(shè)一根通氣管道和一個(gè)空氣過(guò)濾裝置，就可形成集成工藝，具有設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，成本低等特點(diǎn)。與傳統(tǒng)的獨(dú)立發(fā)酵工藝相比，本發(fā)明的方法采用的集成工藝，具有以下特征1)兩個(gè)系統(tǒng)串聯(lián)，簡(jiǎn)化了中間處理環(huán)節(jié)，降低了設(shè)備投資；2)丁醇發(fā)酵產(chǎn)生的氣體經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的過(guò)濾除菌后供丁二酸發(fā)酵使用，簡(jiǎn)化了丁醇發(fā)酵尾氣處理工藝；3)丁醇發(fā)酵產(chǎn)生的C02用于丁二酸合成反應(yīng)，提高了碳源利用率，降低了丁二酸發(fā)酵的原料成本；4)丁醇發(fā)酵產(chǎn)生的C02和H2同時(shí)通入到丁二酸發(fā)酵體系，可以提高丁二酸得率和產(chǎn)率，縮短發(fā)酵周期，降低發(fā)酵成本。圖1為發(fā)酵生產(chǎn)丁醇與丁二酸串聯(lián)集成發(fā)酵工藝設(shè)計(jì)圖；圖中，l為丁醇發(fā)酵罐；2為丁二酸發(fā)酵罐；3為閥門(mén)；4為氣體過(guò)濾器。圖2為琥珀酸放線桿菌(J^'"o6flc/〃附犯cc/"oge"^)ATCC55618發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸過(guò)程產(chǎn)物生成量變化曲線圖3為丙酮丁醇梭菌(C/o^n'fifemaceto6w^"cww)SB-1(CGMCCNo.2287，中國(guó)微生物菌種保藏中心)發(fā)酵生產(chǎn)丁醇過(guò)程產(chǎn)物生成量變化曲線圖4為丁二酸合成過(guò)程所需C02與丁醇合成過(guò)程產(chǎn)生C02的量時(shí)變曲線圖具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所述的百分含量，如果沒(méi)有特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例l、本發(fā)明發(fā)酵生產(chǎn)丁醇和丁二酸的篩選和效果驗(yàn)證本發(fā)明的發(fā)酵生產(chǎn)丁醇和丁二酸是分別用可產(chǎn)生co2的微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇，用可利用C02的微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸；其生產(chǎn)設(shè)備簡(jiǎn)圖如圖l所示，圖1中，1為丁醇發(fā)酵罐；2為丁二酸發(fā)酵罐；3為闊門(mén)；4為氣體過(guò)濾器；丁醇發(fā)酵罐1的尾氣通過(guò)閥門(mén)3和氣體過(guò)濾器4通入丁二酸發(fā)酵罐2。下述實(shí)施例用丙酮丁醇梭菌(C/oWnV//wmaceto^0;//cMm)SB-1(中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，CGMCCNo.2287)進(jìn)行丁醇發(fā)酵，用琥珀酸放線桿菌"c"wo6fl"7/usSMCcfwogewes)ATCC55618進(jìn)行丁二酸發(fā)酵。1、丙酮丁醇梭菌(C7o欣Wwmaceto6w0^cwm)SB-1(中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，CGMCCNo.2287)的發(fā)酵種子液的獲得1)丙酮丁醇梭菌(C/o欲WMmaceo^0^CMm)SB-1(中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，CGMCCNo.2287)的獲得七八月份采集云南騰沖溫泉附近植物根際的土樣40份。將土樣分別加入裝有l(wèi)OmLRCM培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成每升培養(yǎng)基含酵母粉3.0g,蛋白胨10.0g,牛肉膏10.0g,葡萄糖5.0g,淀粉10.0g,乙酸鈉3.0g,L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g,丁醇，pH6.8)的厭氧管中，混合后，在10(TC沸水中加熱90S，殺死營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞，于37r溫箱中培養(yǎng)。定期觀察，挑出有氣泡產(chǎn)生的厭氧管，應(yīng)用亨蓋特滾管技術(shù)，分離單菌落。將單菌落挑出擴(kuò)培后，轉(zhuǎn)移玉米粉培養(yǎng)基(質(zhì)量百分含量為7%的玉米粉溶液)，37'C培養(yǎng)，觀察發(fā)酵現(xiàn)象，挑出有醪蓋形成的試管，總共得到產(chǎn)丁醇的菌株105株。對(duì)這些菌株在玉米粉培養(yǎng)基(質(zhì)量百分含量為7%的玉米粉溶液)中，37。C進(jìn)行重新發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵醪進(jìn)行液相色譜分析，比較各菌株的溶劑總產(chǎn)量和丁醇的比例，經(jīng)發(fā)酵篩選，選出一株發(fā)酵速度快，產(chǎn)生的丁醇比例高的菌株，即為丙酮丁醇梭菌(C/oW〃W/Mmflceo6wO^CMW)SB-1CGMCCNo.2287。丙酮丁醇梭菌(aoWWWwwaceto6z^//cMw)SB-1CGMCCNo.2287營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)呈兩端圓形短桿狀，單一或雙聯(lián)，有鞭毛，可運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞有2.64.7X0.50.7微米。SB-1的生理生化特征鑒定按照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)進(jìn)行，結(jié)果見(jiàn)表l。表l.SB-1的生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>蜜二糖不可以發(fā)酵甘油不可以發(fā)酵纖維素不可以發(fā)酵丙酮丁醇梭菌(C/oWn'WMmaceto6w&//cwm)SB-1己于2007年12月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管委理員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址為中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路)，保藏號(hào)為CGMCCW.2287。對(duì)丙酮丁醇梭菌(C/o;^WwmacetoZmO;//cwm)SB-lCGMCCNo.2287進(jìn)行了16SrDNA序列擴(kuò)增，測(cè)序表明，SB-1的16SrDNA序列具有序列表中序列1的核苷酸序列，并在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)。結(jié)果表明，SB-1的16SrDNA序列ClostridiumacetobutylicumATCC824(U16166.1)的16SribosomalRNA(rrn)gene的同源性為100%，與ClostridiumacetobutylicumVKPMB-4786(AM231184.1)、Clostridiumacetobutylicum6MSU(AM231182.1)、Clostridiumacetobutylicum7MSU(AM231183.1)16SrRNA的同源性均為99%。2)丙酮丁醇梭菌(C7a^Wwm。cetoZ)M&//cwn)SB-1(中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，CGMCCNo.2287)種子培養(yǎng)①丙酮丁醇梭菌(C/oWnW/wmflcetoZmO^cwm)SB-1的活化取2ml含孢子的丙酮丁醇梭菌(aoWrWwmaceto^O^CMm)凍存液，沸水熱激60秒取出，冷水迅速冷卻后接種到含10mlRCM培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基含酵母粉3.0g,蛋白胨10.0g,牛肉膏10.0g,葡萄糖5.0g,淀粉10.0g,乙酸鈉3.0g,L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g，pH6.8)的厭氧管中，37°C,150rpm，培養(yǎng)16h得到培養(yǎng)液，室溫放置，等待接種培養(yǎng)。②丙酮丁醇梭菌(C/oWn'WMwaceto6w0^cwm)SB-1的種子培養(yǎng)取活化好的丙酮丁醇梭菌(C/oWWwmflceto^0;//cwm)SB-1(中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，CGMCCNo.2287)培養(yǎng)液，以體積百分含量為5%接種量接種到含50mlRCM培養(yǎng)基的厭氧瓶中，37°C,150rpm，培養(yǎng)10-12h。然后再次接種到含50mlRCM培養(yǎng)基的厭氧瓶中(接種量體積百分含量為5%，107cfo/L)，37°C,150rpm，培養(yǎng)16h，得到生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的丙酮丁醇梭菌(C/oWn'c^macetok^//cwm)SB-l培養(yǎng)液，作為種子液。2、琥珀酸放線桿菌"c""o6ac/〃wsywcc/wogewes)ATCC55618的發(fā)酵禾中子液的獲得1)琥珀酸放線桿菌(爿c""o^c/〃Mswcc/"oge"es)ATCC55618菌種活化無(wú)氧條件下由凍存管取100pi琥珀酸放線桿菌""/"o6flc/〃wwcc/"oge"es)9ATCC55618凍存液涂布到LB培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基含葡萄糖10.0g，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaC110.0g，pH6.5。在其中加入瓊脂15.0g即為固體培養(yǎng)基)固體斜面進(jìn)行活化，37。C培養(yǎng)12h后，再挑取一環(huán)菌苔接入固體LB平板，37。C培養(yǎng)12h后獲得單菌落。2)琥珀酸放線桿菌Uc""o6a"7/^y;wcc/"ogewey)ATCC55618種子培養(yǎng)從步驟1)得到的LB平板上挑取一個(gè)單菌落，接種于含50mlLB培養(yǎng)基的厭氧瓶中，37°C，150rpm，培養(yǎng)16h得到生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的琥珀酸放線桿菌(Uc"wo^c/〃wswcc/"oge"es)ATCC55618培養(yǎng)液，作為種子液。3、發(fā)酵生產(chǎn)丁醇和/或丁二酸分別進(jìn)行如下方法一至五的方法進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)丁醇和/或丁二酸，比較傳統(tǒng)發(fā)酵方法和本發(fā)明方法的效果方法一、琥珀酸放線桿菌"c""o6ad〃M^cc/"oge"es)ATCC55618發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸——以Na2C03調(diào)節(jié)pH并補(bǔ)充發(fā)酵過(guò)程所需的C02將圖1所示的7升丁二酸發(fā)酵罐2中裝有4升已滅菌的琥珀酸放線桿菌(^c"wo^c說(shuō)us幼cc/wogewey)ATCC55618發(fā)酵培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基含葡萄糖30.0g,酵母粉10.0g,(NH4)2S045.5g,K2HP04.3H208.6g,NaH2P045.0g,MgS04.7H206.0g，F(xiàn)eS04.7H200.005g)，將上述方法培養(yǎng)好的琥珀酸放線桿菌"c""o6flc/〃ws犯cd"ogewM)ATCC55618種子液以體積百分含量為5%(107cfb/L)的接種量接入發(fā)酵罐2中，37°C，200rpm培養(yǎng)80小時(shí)，發(fā)酵過(guò)程中以Na2C03調(diào)節(jié)pH為6，同時(shí)流加葡萄糖(保持發(fā)酵液葡萄糖的濃度為5-50gr1，共補(bǔ)加葡萄糖ioogr1)補(bǔ)充碳源。發(fā)酵過(guò)程中，取發(fā)酵液，用液相色譜檢測(cè)丁二酸、乙酸、乳酸、乙醇的濃度變化。發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)物生成曲線分別如圖2所示；發(fā)酵60小時(shí)的主要產(chǎn)物濃度如表2所示，發(fā)酵80小時(shí)的主要產(chǎn)物濃度如表3所示，結(jié)果表明發(fā)酵60小時(shí)丁二酸濃度達(dá)到61.5g/L，發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵60小時(shí)消耗Na2CO360g/L;繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，丁二酸濃度最高達(dá)到80.0g/L(發(fā)酵80小時(shí))。丁二酸發(fā)酵副產(chǎn)物極少，能檢測(cè)到的副產(chǎn)物僅有乙酸、乙醇和乳酸，濃度很低。表2.各方法中丁醇和丁二酸發(fā)酵體系主要產(chǎn)物濃度(60小時(shí))<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>方法四10.53.41.715.463.00.52.01.260.0方法五10.53.31.715.361.81.12.32.30表3.各方法中丁醇和丁二酸發(fā)酵體系主要產(chǎn)物濃度(80小時(shí))實(shí)施方案丁醇發(fā)酵體系主要產(chǎn)物濃度(g/L)丁二酸發(fā)酵體系主要產(chǎn)物及碳酸鹽消耗(g/L)丁醇丙酮乙醇總?cè)軇┒《嵋宜崛樗嵋掖佳a(bǔ)加Na2C03方法一////801.82.42.275.0方法二////671.54.21.10方法三11.03.41.716.1/////方法四11.03.51.716.282.01.22.41.275.0方法五11.03.41.716.1訓(xùn)1.72.42.30方法二、不額外通入C02及添加碳酸鹽時(shí)的琥珀酸放線桿菌(^c""oZ^"7/mATCC55618發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸將圖1所示的7升丁二酸發(fā)酵罐2中裝有4升已滅菌的琥珀酸放線桿菌"c""o6ac/〃a^wcc/woge"es)ATCC55618發(fā)酵培養(yǎng)基(培養(yǎng)基同方法一)，將按照上述方法培養(yǎng)好的琥珀酸放線桿菌ATCC55618種子液以體積百分含量為5%(107cfU/L)接入該發(fā)酵罐2中，37°C，200rpm培養(yǎng)，發(fā)酵過(guò)程中以NaOH調(diào)節(jié)pH為6，同時(shí)流加葡萄糖(保持發(fā)酵液葡萄糖的濃度為5-50gr1，共補(bǔ)加葡萄糖100gr1)補(bǔ)充碳源。發(fā)酵過(guò)程中，取發(fā)酵液，用液相色譜檢測(cè)丁二酸、乙酸、乳酸、乙醇的濃度變化。發(fā)酵60小時(shí)的主要產(chǎn)物濃度如表2所示，發(fā)酵80小時(shí)的主要產(chǎn)物濃度如表3所示，結(jié)果表明，發(fā)酵60小時(shí)后丁二酸濃度達(dá)到53.0g/L，繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，發(fā)酵80小時(shí)后丁二酸濃度最高達(dá)到65.0g/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于添加Na2C03的工藝。方法三、丙酮丁醇梭菌(C/oWW^wwacWo6^y/z'CM附)發(fā)酵生產(chǎn)丁醇丙酮丁醇梭菌(C/o欲Wwwaceto6M&"cMm)發(fā)酵培養(yǎng)基(玉米培養(yǎng)基)玉米粉最終濃度為75g/L，糊化30min后滅菌。玉米粉的糊化方法將一定重量的玉米面放入一定體積的常溫水中，攪拌均勻后浸泡5min左右，倒入已經(jīng)沸騰的水中，攪拌以免糊底，使玉米粉最終濃度為75g/L。將圖1所示的7升丁醇發(fā)酵罐1中裝有4升預(yù)先滅菌的RCM培養(yǎng)基，將按照上述方法培養(yǎng)好的丙酮丁醇梭菌(C/o欣Wwmflceto^/^CMm)SB-1(中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，CGMCCNo.2287)種子液以體積百分含量為5%(107cfWL)接入該丁醇發(fā)酵罐l中，37。C靜置培養(yǎng)。發(fā)酵尾氣經(jīng)過(guò)濾除菌后直接排放。發(fā)酵過(guò)程中，取發(fā)酵液，用液相色譜檢測(cè)丁醇、丙酮、乙醇、總?cè)軇?生成丁醇、丙酮、乙醇的總量)的量變化。丁醇發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)物生成量變化曲線如圖3所示；發(fā)酵60小時(shí)的主要產(chǎn)物濃度如表2所示，發(fā)酵80小時(shí)的主要產(chǎn)物濃度如表3所示，結(jié)果表明，發(fā)酵60小時(shí)后丁醇濃度達(dá)到10.5g/L。丁醇發(fā)酵罐1的主要副產(chǎn)物為丙酮和乙醇，二者均為重要的溶劑和化學(xué)品。根據(jù)圖2和圖3兩個(gè)體系的發(fā)酵過(guò)程代謝產(chǎn)物時(shí)變曲線，可以計(jì)算出丁醇發(fā)酵產(chǎn)生的C02量和丁二酸發(fā)酵過(guò)程消耗的C02量，結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明丁醇發(fā)酵產(chǎn)生的C02量和丁二酸發(fā)酵過(guò)程消耗的C02量時(shí)變曲線基本吻合。說(shuō)明，同樣體積的發(fā)酵體系中，丁醇發(fā)酵產(chǎn)生的C02基本可以滿(mǎn)足丁二酸發(fā)酵所需。方法四、使用本發(fā)明提供的集成工藝實(shí)現(xiàn)丁醇與丁二酸串聯(lián)發(fā)酵如圖1所示的裝置，發(fā)酵罐1的尾氣管道連接一個(gè)空氣過(guò)濾器4后與發(fā)酵罐2的通氣入口相連。其中，圖1所示的7升丁醇發(fā)酵罐1中裝有4升預(yù)先滅菌的玉米培養(yǎng)基，將培養(yǎng)好的丙酮丁醇梭菌(C/o欣W"maceto6^y"cwn)SB-1(中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，CGMCCNo.2287)種子液以體積百分含量為5%(107cfu/L)接入發(fā)酵罐l中，37"C靜置培養(yǎng)。圖1所示的7升發(fā)酵罐2中裝有4升已滅菌的琥珀酸放線桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基，將培養(yǎng)好的琥珀酸放線桿菌(A^o6""7/M^"cdMogewM)ATCC55618種子液以體積百分含量為5%(107cfti/L)接入發(fā)酵罐2中，37°C，200rpm培養(yǎng)，發(fā)酵過(guò)程中以Na2C03調(diào)節(jié)pH為6，同時(shí)流加葡萄糖(保持發(fā)酵液葡萄糖的濃度為5-50gl'1，共補(bǔ)加葡萄糖100gr1)補(bǔ)充碳源。發(fā)酵過(guò)程中，取發(fā)酵罐l中發(fā)酵液，用液相色譜法檢測(cè)丁醇、丙酮、乙醇、總?cè)軇?生成丁醇、丙酮、乙醇的總量)的量變化；取發(fā)酵罐2中發(fā)酵液檢測(cè)丁二酸、乙酸、乳酸、乙醇的濃度變化。發(fā)酵60小時(shí)的主要產(chǎn)物濃度如表2所示，發(fā)酵80小時(shí)的主要產(chǎn)物濃度如表3所示，結(jié)果表明，丁醇與丁二酸集成發(fā)酵60小時(shí)后，碳酸鈉添加量為60g/L，丁醇和丁二酸濃度分別達(dá)到10.5g/L和63.0g/L。延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間(發(fā)酵80小時(shí))，丁酸和丁二酸濃度最高分別達(dá)到11.0g/L和82.0g/L。該工藝條件下丁二酸合成濃度略高于獨(dú)立的丁二酸發(fā)酵。丁醇發(fā)酵(發(fā)酵罐l)的主要副產(chǎn)物為丙酮和乙醇，丁二酸發(fā)酵(發(fā)酵罐2)副產(chǎn)物為乙酸、乙醇和乳酸。方法五、使用本發(fā)明提供的集成工藝實(shí)現(xiàn)丁醇與丁二酸(不加碳酸鹽及C02)串聯(lián)發(fā)酵如圖1的實(shí)驗(yàn)裝置，發(fā)酵罐1的尾氣管道連接一個(gè)空氣過(guò)濾器4后與發(fā)酵罐2的通氣入口相連。其中，圖1所示的7升丁醇發(fā)酵罐1中裝有4升預(yù)先滅菌的RCM培養(yǎng)基，將培養(yǎng)好的丙酮丁醇梭菌(C/o^7'c//wmaceto6w(y//cwm)SB-1(中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，CGMCCNo.2287)種子液以體積百分含量為5%(107cfii/L)接入發(fā)酵罐l中，37'C靜置培養(yǎng)。發(fā)酵罐2中裝有4升已滅菌的琥珀酸放線桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基，將培養(yǎng)好的琥珀酸放線桿菌"c""o6fl"7/w"wcc/"oge"")ATCC55618種子液以體積百分含量為5%(107cfu/L)接入發(fā)酵罐2中，37°C，200rpm培養(yǎng)，發(fā)酵過(guò)程中以NaOH調(diào)節(jié)pH為6.2，同時(shí)流加葡萄糖(保持發(fā)酵液葡萄糖的濃度為5-50gl"，共補(bǔ)加葡萄糖100gr1)補(bǔ)充碳源。發(fā)酵60小時(shí)的主要產(chǎn)物濃度如表2所示，發(fā)酵80小時(shí)的主要產(chǎn)物濃度如表3所示，結(jié)果表明，丁醇與丁二酸發(fā)酵60小時(shí)后，丁醇和丁二酸濃度分別達(dá)到10.5g/L和61.8g/L;延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間(發(fā)酵80小時(shí))，丁酸和丁二酸濃度最高分別達(dá)到11.0g/L和80.8g/L。與丁醇獨(dú)立發(fā)酵、丁二酸發(fā)酵體系中添加碳酸鹽的結(jié)果基本一致，但該工藝條件下節(jié)約不需添加Na2C03。丁醇發(fā)酵(發(fā)酵罐l)的主要副產(chǎn)物為乙醇和丙酮，丁二酸發(fā)酵(發(fā)酵罐2)的主要副產(chǎn)物為乙酸、乙醇和乳酸。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>權(quán)利要求1、一種生產(chǎn)丁醇和丁二酸的方法，是在不同的體系中同時(shí)微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇和丁二酸，并將發(fā)酵生產(chǎn)丁醇產(chǎn)生的氣體通入發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的體系中。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的微生物為丙嗣丁醇梭菌(C7asfn'￡//wmacetoZ>M(y//cwm)或手羊氏梭菌(C7oWnV//wm6e々'e〃'wcA://)，所述發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的微生物為產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌""aen^/(w/zW〃"mswcc/m'c^Wwcms),琥珀酸方文線桿菌"c/"oZac飾j犯cc,"oge"es),產(chǎn)琥珀酸巴斯德氏菌(Ma朋/ze/附/aSMcc/"/")ra血cew50MBEL55E，黑曲霉(y4，rg/〃wsw/ger)，煙曲霉(A/erg〃/Ms^m扭加)，或酵母菌(iS^cc/z(3ram少cescem^s/ae)。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的底物為玉米粉或葡萄糖，所述發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的底物為葡萄糖。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的微生物為丙酮丁醇梭菌(C/oWnVfemacetoZm&//cMW)SB-1CGMCCNo.2287;所述發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的微生物為琥珀酸放線桿菌Uc"'"o6ac/〃ww"cc/"ogewej)ATCC55618。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵生產(chǎn)丁醇產(chǎn)生的氣體經(jīng)過(guò)濾除菌直接通入所述發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的發(fā)酵罐或經(jīng)緩沖罐、氣體流量計(jì)控制通入發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的發(fā)酵罐的量。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的培養(yǎng)基為玉米粉糊化液；所述玉米粉糊化液中玉米粉的濃度為60-90g/L;所述發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的培養(yǎng)基為每升含葡萄糖30.0-50.0g,酵母粉10.0g,(NH4)2S045.5g,K2HP04.3H208.6g,NaH2P045.0g,MgS04.7H206.0g,FeS04.7H200.005g。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的pH為5.5-7.0。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸過(guò)程流加葡萄糖補(bǔ)充碳源，葡萄糖濃度維持在5-50g/L。9、根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述可產(chǎn)生C02的微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的初始濃度為10、1(^cfU/L;所述可利用C02的微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的初始濃度為106-107cfU/L。10、根據(jù)權(quán)利要求9中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的培養(yǎng)基體積大于或等于所述發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的培養(yǎng)基體積。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種發(fā)酵生產(chǎn)丁醇和丁二酸的方法。該方法，一種生產(chǎn)丁醇和丁二酸的方法，是在不同的體系中同時(shí)微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇和丁二酸，并將發(fā)酵生產(chǎn)丁醇產(chǎn)生的氣體通入發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的體系中。該方法將丁醇發(fā)酵體系與丁二酸發(fā)酵體系串聯(lián)起來(lái)，利用丁醇發(fā)酵產(chǎn)生的CO₂和H₂促進(jìn)丁二酸合成。既實(shí)現(xiàn)了CO₂綜合利用，減少溫室氣體排放；又減少了丁二酸生產(chǎn)過(guò)程的碳酸鹽使用量。本方法并不需要復(fù)雜的設(shè)備改造，只需要在丁醇發(fā)酵罐尾氣管道上增加一個(gè)過(guò)濾除菌裝置后與丁二酸發(fā)酵罐進(jìn)氣管道連接即可。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的方法可以在不額外補(bǔ)加碳酸鹽的情況下維持甚至增加丁二酸的合成濃度，同時(shí)丁醇合成不受影響。文檔編號(hào)C12P7/46GK101250561SQ20081010408公開(kāi)日2008年8月27日申請(qǐng)日期2008年4月15日優(yōu)先權(quán)日2008年4月15日發(fā)明者張延平,寅李,王少華,鄭文超申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所