專利名稱：：一種單精注射激活方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及胚胎工程領(lǐng)域，特別是涉及單精注射中激活以生產(chǎn)體外胚胎技術(shù)。技術(shù)背景單精注射即以人工的方法將單個精子注射入卵胞質(zhì)使之受精，形成原核，最終在體外發(fā)育成為早期胚胎的過程。將單個精子直接注入牛卵母細(xì)胞胞質(zhì)以完成受精過程的方法稱為胞質(zhì)內(nèi)注射法。為了達(dá)到高效體外生產(chǎn)優(yōu)良品種牛的胚胎，單精子胞質(zhì)內(nèi)注射方法成為目前國際上首選的有性生殖的方法，在發(fā)達(dá)國家該方法己經(jīng)取代了傳統(tǒng)的體外受精的方法，成為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)體外胚胎的主要技術(shù)。我們國內(nèi)該技術(shù)已經(jīng)在人類治療生殖性不孕方面的應(yīng)用有了很大的進(jìn)展，但是在家畜生產(chǎn)、品種改良方面的應(yīng)用較少，所以將該項技術(shù)應(yīng)用于優(yōu)質(zhì)奶牛胚胎生產(chǎn)，以期達(dá)到在體外高效生產(chǎn)優(yōu)良品種的性控胚胎。該技術(shù)體系的優(yōu)點有節(jié)約精子，大大地減少使用的精子數(shù)量；受精率高，顯著高于體外受精(IVF);對精子的質(zhì)量要求不高，一般活力的精子或者是接近死亡的精子都可以達(dá)到受精的目的；與精子體外XY染色體分離技術(shù)結(jié)合，可以高效率的體外生產(chǎn)性控胚胎；生產(chǎn)成本低。從目前分離精液情況來看，釆用單精注射(ICSI)，是降低性控胚胎生產(chǎn)成本有效途徑之一。從理論上講，采用單精注射方法生產(chǎn)性控胚胎，一個劑量的分離精子(有效精子數(shù)200萬)，足以滿足國內(nèi)所有實驗需要，這樣采用單精注射生產(chǎn)的性控胚胎，所用的精子成本幾乎為零。在應(yīng)用單精注射生產(chǎn)性別控制胚胎方面也存在一些技術(shù)問題，如牛卵母細(xì)胞激活率低，胚胎發(fā)育效率低下等。目前，牛卵母細(xì)胞可用鈣離子載體A23187、離子霉素、乙醇、DMAP、放線菌酮。采用A23187(50mmol/L，5min)、乙醇(7%，5min)處理牛卵母細(xì)胞，卵裂率分別為55%和52%，但乙醇處理胚胎沒有發(fā)育到桑椹胚和囊胚(Chen，1997)。乙醇與放線菌酮聯(lián)合處理能提高激活率，且效果明顯好于乙醇或放線菌酮的單獨(dú)處理(Presiece，1994)隨著卵齡的增大、乙醇的激活率提高，但卵齡偏高(成熟培養(yǎng)44h)其胚胎發(fā)育能力下降(Minamihashi,1993)。Both在2001年發(fā)現(xiàn)用A23187分別與DMAP和放線菌酮聯(lián)合處理卵母細(xì)胞，A23187/DMAP的激活率、囊胚率高，但A23187/放線菌酮在核移植中融合卵的囊胚率更高。
發(fā)明內(nèi)容針對上述領(lǐng)域中的缺陷，本發(fā)明提供一種單精注射激活方法，該方法激活卵1個原核的比例最高，適宜用于胞質(zhì)內(nèi)單精子注射卵的激活。一種單精注射激活方法，其特征在于用離子霉素和6-DMAP聯(lián)合激活受精卵。所述離子霉素的濃度為5pM，6-DMAP的濃度為2pM。所述聯(lián)合激活方法為在5pM離子霉素中處理6分鐘，再移入到2pM6-DMAP中，用2pM6-DMAP清洗三遍后在培養(yǎng)箱中孵育3h。本發(fā)明用離子霉素和DMAP聯(lián)合激活受精卵，提高了卵母細(xì)胞的激活率，卵裂率得到了提高，用終濃度5nM的離子霉素(io)與2pM的DMAP激活受精卵后，卵裂率為60~65%。具體實施方式下面通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實施例1(聯(lián)合處理)1試劑1.1Ml99(Medium199GIBCO11150-059)1.2葡萄糖(D-GlucoseSIGMAG-8270)1.3咖啡因(CaffeineSIGMAC-0750)1.4胎牛血清(FBSGIBCO26140-087)1.5透明酯酸酶(HSIGMAH4272)1.6細(xì)胞松弛素B(CBSIGMAC6762)1.7二甲基亞砜(DMSOSIGMAD4540)1.8io(離子霉素SIGMA10634)1.96-DMAP(6-二甲基氨基嘌呤SIGMAD2629)UODDT(GIBCOD1532)1.11PVP(SIGMAP5288)2實驗器材及儀器2.1C02培養(yǎng)箱Mode131112.2實體顯微鏡M-4002.3生物顯微鏡XSZ-G2.4離心機(jī)JAISHILIXINJI80-2B2.5恒溫箱DHP1202.6恒溫水浴鍋Q/lYS002-91BS3操作步驟3.1卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備將離體卵巢或活體采卵得到的卵母細(xì)胞進(jìn)行成熟培養(yǎng)20h，培養(yǎng)條件38.5°C,4.5%C02。成熟后用含透明質(zhì)酸酶的操作液(M2)脫顆粒細(xì)胞，用實心針在顯微鏡下挑出有極體質(zhì)量好的卵備用。3.2精子的準(zhǔn)備用添加5mM的DDT將精液洗漆兩次，然后用不含咖啡因的受精液懸浮精液20分，然后將懸浮的精液放入PVP液中備用。3.3單精注射3.3.1用吸卵針從時鐘9點鐘的方向吸住一枚卵母細(xì)胞，使紡錘體保持在6點或12點位置，從3點的方向輕輕進(jìn)針，注射針的斜面與紡錘體相反。3.3.2注射針吸l-2個精子，穿過透明帶時將第一個精子頭吹至針尖處，繼續(xù)進(jìn)針，直至針尖插入卵母細(xì)胞深處，將精子頭吐出，注射到透明帶內(nèi)的胞質(zhì)中，回吸注入卵內(nèi)多余的操作液，輕輕退針，完成一次操作。3.3.3依次方法操作，將注射后的卵在預(yù)熱加FBS的M199中洗兩遍。3.4卵母細(xì)胞的激活成熟約24小時后，開始進(jìn)行激活。3.4.1將受精卵移入終濃度為5pMio中，作用6min。3.4.26min后，移入終濃度2pM的6-DAMP中，用6-DAMP液洗3遍，再放入做好的液滴中，放入培養(yǎng)箱中作用3h。3.4.33h后，取出受精卵，用培養(yǎng)液充分清洗3-5遍后，放入培養(yǎng)滴中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)液(M199+10%FBS)中培養(yǎng)。3.5受精卵的培養(yǎng)隔天半換液。并觀察每滴中每枚胚胎發(fā)育情況。實施例2(離子霉素處理)步驟如實施例l，但步驟3.4項不同3.4卵母細(xì)胞激活3.4.1將受精卵移入終濃度為5pMio中，作用6min。3.4.26min后，用培養(yǎng)液充分清洗3-5遍后，放入培養(yǎng)滴中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)液(M199+10%FBS)中培養(yǎng)。實施例3(DMAP處理)步驟如實施例l，但步驟3.4項下不同3.4卵母細(xì)胞激活3.4.1將受精卵移入終濃度為2pM的6-DAMP中，用6-DAMP液洗3遍，再放入做好的液滴中，放入培養(yǎng)箱中作用3h。3.4.23h后，取出受精卵，用培養(yǎng)液充分清洗3-5遍后，放入培養(yǎng)滴中，放入培養(yǎng)箱中培<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>上表用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。從中可以看出，實施例1卵裂率和囊胚率均為三種方法最好的，且卵裂率與其他兩種方法有顯著性差異(P<0.05)。權(quán)利要求1、一種單精注射激活方法，其特征在于用離子霉素和6-DMAP聯(lián)合激活受精卵。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述聯(lián)合激活方法為在離子霉素中處理6分鐘，再移入到6-DMAP中，用6-DMAP清洗三遍后在培養(yǎng)箱中孵育3h。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，所述離子霉素的濃度為5pM，6-DMAP的濃度為2pM。全文摘要本發(fā)明涉及一種單精注射激活方法，屬于胚胎工程領(lǐng)域。本發(fā)明用離子霉素和DMAP聯(lián)合激活受精卵，提高了卵母細(xì)胞的激活率，卵裂率得到了提高，用終濃度5μm的離子霉素(io)與2μm的DMAP激活受精卵后，卵裂率為60～65％。文檔編號C12N5/06GK101260383SQ20081010428公開日2008年9月10日申請日期2008年4月17日優(yōu)先權(quán)日2008年4月17日發(fā)明者晶安,張家新,張紅霞,月王,海王,敏郭,郭麗麗申請人:北京錦繡大地農(nóng)業(yè)股份有限公司