專(zhuān)利名稱(chēng)：通過(guò)耐酸性改造在昆蟲(chóng)中組裝口蹄疫病毒空衣殼的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過(guò)耐酸性改造在昆蟲(chóng)中組裝口蹄疫病毒空衣殼的方法。
技術(shù)背景口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)是偶蹄動(dòng)物的一種急性烈性傳染病，位 于A類(lèi)動(dòng)物傳染病之首，世界各國(guó)均投入了巨額經(jīng)費(fèi)用于該病的防治。傳統(tǒng)疫苗在 口蹄疫的防治中存在著不足，主要表現(xiàn)在疫苗使用的不安全性和難于進(jìn)行感染動(dòng)物 和免疫動(dòng)物的鑒別診斷；同時(shí)在滅活疫苗的生產(chǎn)過(guò)程中，大量增殖自然病毒，需要 嚴(yán)格的防范病毒擴(kuò)散的設(shè)施，盡管如此，仍然存在病毒逃逸和病毒滅活不完全而散 毒的可能性。2007-2008年英國(guó)口蹄疫的爆發(fā)就是因?yàn)椴《咎右菟??？谔阋卟《?FMDV)空衣殼具有與完整病毒相同的免疫學(xué)特性，但不存在散毒的風(fēng)險(xiǎn)，因而利 用各種表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)FMDV的空衣殼一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。FMDV衣殼呈二十面體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，由60個(gè)相同的原體組成，每個(gè)原體由四種非 共價(jià)連接的蛋白組成，即VP4、 VP2、 VP3、 VP1。它們由氨基端至羧基端依次連接形 成P1聚蛋白。2A蛋白是FMDV的一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，它的氨基端與P1聚蛋白的羧基 端連接形成融合蛋白P12A。在小RNA病毒科的所有病毒中，F(xiàn)MDV是對(duì)低pH值最敏感的。完整的FMDV在 pH值低于7的環(huán)境下，衣殼會(huì)解離成五聚體，它是由五個(gè)原體對(duì)稱(chēng)組裝而成。在解 離過(guò)程中，RNA被釋放出來(lái)，四條鏈中最小的一條鏈VP4就脫離原體。有資料表明 FMDV的酸不穩(wěn)定性可能和五聚體一五聚體接觸面上排列的組氨酸殘基有關(guān)(Acharya R, Fry E, Stuart D I, et al. The three-dimersional structure of foot and mouth disease virus at 2.9A. Nature, 1989， 337: 709-716. Warwicker J. Model for the differential stabilities of rhinovirus and poliovirus to mild acidic pH based on electrostatics calculations. J. Mol. Biol. 1992,223: 247-257.) 。 Acharya等通過(guò)對(duì)一株 0型FMDV的3D結(jié)構(gòu)分析表明，沿著一個(gè)原體的c90-A邊緣排列的7個(gè)組氨酸殘基(VP2上H21、 H65、 H87和H157; VP3上H141、 144和H191)離五聚體—五聚體接 觸面很近，以使其能與相鄰的五聚體上帶電殘基發(fā)生相互作用。由于組氨酸殘基在 pH值低于7時(shí)帶正電荷，這就使7個(gè)組氨酸殘基和對(duì)面接觸面上的組氨酸、賴(lài)氨酸和精氨酸有可能產(chǎn)生靜電推斥作用。但是在相同區(qū)域帶負(fù)電荷的殘基(谷氨酸、天門(mén)冬氨酸)會(huì)屏蔽這個(gè)效應(yīng)。事實(shí)上，7個(gè)氨基酸中只有2個(gè)氨基酸(VP3上H141 和H144)所在位置上的組氨酸、賴(lài)氨酸和精氨酸殘基的數(shù)目(5:2)大大超過(guò)了對(duì) 面五聚體一五聚體接觸面10A范圍內(nèi)谷氨酸和天門(mén)冬氨酸的殘基數(shù)。Twomey等人 對(duì)一株A型FMDV病毒分析發(fā)現(xiàn)，它也有7個(gè)組氨酸殘基(其中有4個(gè)在0型上是 相同的)沿著五聚體一五聚體接觸面以相同的位置排列(TwomeyT, France LL, Hassard S, et al. Characterization of an acid-resistant mutant of foot-and-mouth cisease virus. Virology, 1995， 206: 69-75.)。同樣只有2個(gè)組氨酸殘基(VP3上H141和H 144) 和其它位置上帶正電荷的氨基酸的數(shù)目(6:2和6:3)大大超過(guò)了對(duì)面五聚體一五 聚體接觸面IOA范圍內(nèi)帶負(fù)電荷的氨基酸的數(shù)目。Curry和Twomey等確定了決定 酸不穩(wěn)定性的五聚體間接觸面上的氨基酸可能是H142和H145 (Twomey T, France L L, Hassard S, et al. Characterization of an acid-resistant mutant of foot-and-mouth cisease virus. Virology, 1995, 206: 69-75. Curry S, Fry E, Crowther J C， et al. Viral RNA modulates the acid sensitivity of foot-and-mouth disease virus capsids. J. Virol. 1995, 69: 430-438.)。在Asial型FMDV中，相對(duì)應(yīng)的組氨酸在VP3上140位和143位。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)水平高、重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能、能進(jìn)行 翻譯后的加工修飾和能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因等諸多優(yōu)點(diǎn)，在重組蛋白的表達(dá)中廣泛應(yīng) 用。但是由于昆蟲(chóng)細(xì)胞的培養(yǎng)基pH值在6.3左右，因此很難應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)系 統(tǒng)在昆蟲(chóng)細(xì)胞中組裝穩(wěn)定的FMDV空衣殼蛋白。Soo-JeongKye等用桿狀病毒表達(dá)系 統(tǒng)在Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)了 FMDV五聚體結(jié)構(gòu)，電子顯微鏡下觀察到的五聚體結(jié)構(gòu) 比完整的FMDV粒子小得多(Jae-Ku Oema, Jong-Hyeon Park, Kwang-Nyeong Lee， et al. Characterization of recombinant foot-and-mouth disease virus pentamer-like structures expressed by baculovirus and their use as diagnostic antigens in a blocking ELISA. Vaccine, 2007， 25: 4112-4121.)，這種五聚體結(jié)構(gòu)是FMDV空衣殼組裝過(guò)程中產(chǎn)生的 中間體，之所以沒(méi)能成功地組成完整的空衣殼，主要原因可能是昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基的 pH值影響了空衣殼的組裝。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種通過(guò)耐酸性改造在昆蟲(chóng)細(xì)胞中組裝口蹄疫病毒空衣 殼的方法及空衣殼蛋白和該空衣殼蛋白的用途。本發(fā)明所提供的口蹄疫病毒空衣殼蛋白，是將P12A進(jìn)行耐酸性改造得到的突變蛋白，所述耐酸性改造是將P12A中VP3的自氨基末端第140-145位中的組氨酸 殘基均突變?yōu)樗嵝原h(huán)境中不帶正電荷的氨基酸；所述酸性環(huán)境中不帶正電荷的氨基酸可為除精氨酸和賴(lài)氨酸外的其他17種氨基酸；優(yōu)選亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、 丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；更優(yōu)選亮氨酸、異亮氨酸或纈氨 酸。所述P12A的VP4、 VP2、 VP3、 VP1和2A蛋白均可來(lái)自同一毒株，也可分別來(lái) 自不同的毒株。本發(fā)明也涉及改進(jìn)口蹄疫病毒空衣殼的耐酸性穩(wěn)定性。通過(guò)突變病毒衣殼五聚 體接觸面的帶正電荷的氨基酸為不帶正電荷的氨基酸，有利地增加了空衣殼的酸性 穩(wěn)定性。由現(xiàn)有的7個(gè)血清型(Asial、 0、 A、 C、 SAT1、 SAT2、 SAT3)的口蹄疫病毒P12A 蛋白進(jìn)行耐酸性改造得到的耐酸性空衣殼蛋白mP12A，具體可為1) 其氨基酸序列為序列表中的序列2，它是由氨基酸序列是自GenBank Accession Number EF149009的氨基末端第217-950位的Asial型FMDV的P12A蛋 白進(jìn)行耐酸性改造得到的突變蛋白，該耐酸性改造是將P12A中VP3的自氨基末端 第140和143位(自序列表中序列2的氨基末端第429和432位)的組氨酸殘基均 突變?yōu)樘扉T(mén)冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪 氨酸、色氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸 或苯丙氨酸；2) 由氨基酸序列是自GenBank Accession Number AF511039的氨基末端第 217-953位的0型FMDV的P12A蛋白進(jìn)行耐酸性改造得到的突變蛋白，該耐酸性改 造是將P12A中VP3的自氨基末端第141位和第144位的組氨酸殘基突變?yōu)樘扉T(mén)冬 酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、色氨酸、 亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；3) 由氨基酸序列是自GenBank Accession Number EF494487的氨基末端第 219-956位的A型FMDV的P12A蛋白進(jìn)行耐酸性改造得到的突變蛋白，該耐酸性改 造是將P12A中VP3的自氨基末端第142位和第145位的組氨酸殘基突變?yōu)樘扉T(mén)冬 酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、色氨酸、 亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；4) 由氨基酸序列是自GenBank Accession Number AM409325的氨基末端第217-948位的C型FMDV的P12A蛋白進(jìn)行耐酸性改造得到的突變蛋白，該耐酸性改 造是將P12A中VP3的自氨基末端第140位和第143位的組氨酸殘基突變?yōu)樘扉T(mén)冬 酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、色氨酸、 亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；5) 由氨基酸序列是自GenBank Accession Number NC011451的氨基末端第 215-960位的SAT1型FMDV的P12A蛋白進(jìn)行耐酸性改造得到的突變蛋白，該耐酸性 改造是將P12A中VP3的自氨基末端第142位和第145位的組氨酸殘基突變?yōu)樘扉T(mén) 冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、色氨 酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸;6) 由氨基酸序列是自GenBank Accession Number NC003992的氨基末端第 215-956位的SAT2型FMDV的P12A蛋白進(jìn)行耐酸性改造得到的突變蛋白，該耐酸性 改造是將P12A中VP3的自氨基末端第142位和第145位的組氨酸殘基突變?yōu)樘扉T(mén) 冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、色氨 酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；7) 由氨基酸序列是自GenBank Accession Number AY593852的氨基末端第 215-956位的SAT3型FMDV的P12A蛋白進(jìn)行耐酸性改造得到的突變蛋白，該耐酸性 改造是將P12A中VP3的自氨基末端第142位和第145位的組氨酸殘基突變?yōu)樘扉T(mén) 冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、色氨 酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸。上述蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 含有上述基因的重組載體和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種通過(guò)耐酸性改造在昆蟲(chóng)細(xì)胞中組裝口蹄疫病 毒空衣殼的方法。本發(fā)明所提供的在昆蟲(chóng)細(xì)胞中組裝口蹄疫病毒空衣殼的方法，包括以下步驟1) 將所述mP12A的編碼基因和口蹄疫病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因3C通過(guò)桿狀病毒 載體導(dǎo)入細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行重組，得到重組桿狀病毒A;2) 用所述重組桿狀病毒A的DNA轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，獲得口蹄疫病毒空衣殼。 上述方法中還包括將用所述重組桿狀病毒A的DNA轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞得到的重組桿狀病毒再感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，獲得口蹄疫病毒空衣殼的步驟。mP12A的編碼基因和口蹄疫病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因JC可通過(guò)下述兩種方法之一導(dǎo)入細(xì)菌內(nèi)a) 將mP12A的編碼基因和口蹄疫病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因^7通過(guò)同一個(gè)含有雙 啟動(dòng)子的桿狀病毒載體導(dǎo)入細(xì)菌內(nèi)，mP12A的編碼基因插入所述雙啟動(dòng)子桿狀病毒 載體的一個(gè)啟動(dòng)子下游，口蹄疫病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因JC插入所述雙啟動(dòng)子桿狀 病毒載體的另一個(gè)啟動(dòng)子下游；b) 將mP12A的編碼基因和非結(jié)構(gòu)蛋白基因JC通過(guò)只含有一個(gè)啟動(dòng)子的桿狀病 毒載體導(dǎo)入細(xì)菌內(nèi)。所述雙啟動(dòng)子桿狀病毒載體為能在細(xì)菌內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)座重組的載體；所述雙啟動(dòng)子 桿狀病毒載體優(yōu)選為pFastBacTMDual。pFastBacTMDual可以同時(shí)表達(dá)兩種異源蛋白，且該載體為非融合載體，可以使 表達(dá)的蛋白保持天然蛋白的特性。同時(shí)，本發(fā)明應(yīng)用Bac-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)通 過(guò)在細(xì)菌內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)座重組制備重組桿狀病毒，比傳統(tǒng)的應(yīng)用同源重組產(chǎn)生的重組體 病毒更具優(yōu)點(diǎn)不需要多輪噬斑純化，僅需2周時(shí)間就可以得到重組體桿狀病毒； 可以同時(shí)快速的分離多個(gè)重組體病毒。上述細(xì)菌均指大腸桿菌。上述昆蟲(chóng)細(xì)胞可為Sf9細(xì)胞系、Sf21細(xì)胞系、High Five細(xì)胞系或其它昆蟲(chóng)細(xì) 胞系，優(yōu)選為Sf9細(xì)胞系或High Five細(xì)胞系，其中，Sf9細(xì)胞的貼壁效果好。將利用上述方法在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和Westemblot檢測(cè)，結(jié) 果表明，歷尸7i^基因和FMDV衣殼蛋白組裝必需的非結(jié)構(gòu)蛋白3C基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞中均 獲得表達(dá)，且衣殼蛋白被3C蛋白酶成功地加工裂解。雙抗體夾心ELISA和免疫熒光 檢測(cè)結(jié)果表明，表達(dá)的mP12A蛋白主要集中在細(xì)胞膜上，且具有很好的抗原性。通 過(guò)電鏡觀察到重組桿狀病毒在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了直徑約為30nm的空衣殼結(jié)構(gòu)。利用上述方法制備的口蹄疫病毒空衣殼也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。利用上述方法制備的口蹄疫病毒空衣殼可以應(yīng)用于制備口蹄疫病毒疫苗或制 備口蹄疫病毒診斷試劑。本發(fā)明首次在昆蟲(chóng)細(xì)胞中組裝成了完整的FMDV空衣殼，為基因工程亞單位疫 苗和新型診斷試劑的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。


圖1為JC基因和7基因的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖2為重組桿狀病毒Bac mP12A3C-l和Bac P12A3C-1的PCR檢測(cè)結(jié)果圖3為Sf9細(xì)胞轉(zhuǎn)染Bac mP12A3C-l后的具體形態(tài)圖4為重組桿狀病毒Bac mP12A3C-l轉(zhuǎn)染High FiveTM昆蟲(chóng)細(xì)胞后的SDS-PAGE 檢測(cè)結(jié)果圖5為重組桿狀病毒Bac mP12A3C-l轉(zhuǎn)染High FiveTM昆蟲(chóng)細(xì)胞后的Western blot檢測(cè)結(jié)果圖6為重組桿狀病毒Bac mP12A3C-l和Bac P12A3C-1分別感染High FiveTM細(xì) 胞后的間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果圖7為重組桿狀病毒BacmP12A3C-l和BacP12A3C-l在昆蟲(chóng)細(xì)胞中組裝口蹄 疫病毒空衣殼蛋白的電鏡檢測(cè)結(jié)果圖8為重組桿狀病毒BacmP12A3C-2和Bac P12A3C-2在昆蟲(chóng)細(xì)胞中組裝口蹄 疫病毒空衣殼蛋白的電鏡檢測(cè)結(jié)果圖9為重組桿狀病毒BacmP12A3C-3和BacP12A3C-3在昆蟲(chóng)細(xì)胞中組裝口蹄 疫病毒空衣殼蛋白的電鏡檢測(cè)結(jié)果具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，這些實(shí)施例并不限制本發(fā)明的 保護(hù)范圍，所有基于本發(fā)明基本思路的修改和變形均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。以將氨基酸序列是自GenBank Accession Number EF149009的氨基末端第 217-950位的Asial型FMDV的P12A蛋白進(jìn)行耐酸性改造得到的突變蛋白，該耐酸 性改造是將P12A中VP3的自氨基末端第140位和第143位的組氨酸殘基突變?yōu)榫?突變?yōu)榱涟彼幔灰詫被嵝蛄惺亲訥enBank Accession Number AF511039的氨基 末端第217-953位的0型FMDV的P12A蛋白進(jìn)行耐酸性改造得到的突變蛋白，該耐 酸性改造是將P12A中VP3的自氨基末端第141位和第144位的組氨酸殘基均突變 為纈氨酸；以將氨基酸序列是自GenBank Accession NumberEF494487的氨基末端第 219-956位的A型FMDV的P12A蛋白進(jìn)行耐酸性改造得到的突變蛋白，該耐酸性改 造是將P12A中VP3的自氨基末端第142位和第145位的組氨酸殘基突變?yōu)槔i氨酸 和異亮氨酸為例，闡明完整的FMDV空衣殼的制備方法。實(shí)施例l、 口蹄疫病毒空衣殼在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的組裝一、目的基因的克隆1、 RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄按照RNeasy Mini Kit的操作說(shuō)明書(shū)，分別從Asia I /JS/05株(國(guó)家農(nóng)業(yè)部指定的口蹄疫病毒保藏機(jī)構(gòu)國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室，參考文獻(xiàn)Arch Virol, 2007,152:1699-1708 Comparisons of the complete genomes of two Chinese isolates of a recent foot-and-mouth disease type Asia 1 virus。 GenBank序歹(J號(hào) EF149009) 、 O/Akesu/58和A/XJ/KT/58株(國(guó)家農(nóng)業(yè)部指定的口蹄疫病毒保藏 機(jī)構(gòu)國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室，參考文獻(xiàn)Arch Virol， 2007, 152: 2079-2085 The complete genome sequence of foot-and-mouth disease virus O/Akseu/58 strain and its some molecular characteristics, GenBank序歹!j號(hào)AF511039禾口 AJ131665) 的FMDV適應(yīng)細(xì)胞毒中提取細(xì)胞的總RNA，將得到的總RNA用引物 5， -CTTACTCGTGGTGTGGTTCGGGGTCGATG-3，反轉(zhuǎn)錄得到FMDV的cDNA。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中， 所有器皿和試劑均經(jīng)0. 1%的DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液進(jìn)行去RNase處理。 2、目的基因的克隆按照TaKaRa RNA PCRKit(AMV) Ver. 3.0操作說(shuō)明書(shū)，分別以步驟l反轉(zhuǎn)錄得到 的Asia I /JS/05株的FMDV的cDNA、 0/Akesu/58株的FMDV的cDNA和A/XJ/KT/58株的 FMDV的cDNA為模板，以3CF: 5， -AGGCCATGGAGAGTGGTGCCCCACCGACTGA-3，和3CR: 5， -AGGGTACCTTACTCGTGGTGTGGTTCGGGGTCGATG-3，為引物，PCR擴(kuò)增衣殼蛋白組裝 必需的非結(jié)構(gòu)蛋白基因JC。對(duì)PC財(cái)廣增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明， 均得到大小為639bp的5遂因片段。以步驟l反轉(zhuǎn)錄得到的Asial/JS/05株的FMDV的cDNA為模板，以P1F: 5， AGGGGATTCCATGGGCAACACTGGAAGCATCATTAAC-3'和IP1R: 5'-GATTCTAGATTACCCAGGGTTGGACTCCACGTCTCCTG-3，為引物，PCR擴(kuò)增FMDV衣殼蛋白基因尸7i^-7;以步驟1反轉(zhuǎn)錄得到的O/Akesu/58株的FMDV的cDNA為模板，以P1F:5， AGGGGATTCCATGGGCAACACTGGAAGCATCATTAAC-3'和0P1R: 5'-GATTCTAGATTATCCGGGGTTGGACTCAACGTCTCCTG-3'為引物，PCR擴(kuò)增FMDV衣殼蛋白基因/^24-2;以步驟l反轉(zhuǎn)錄得到的A/XJ/KT/58株的FMDV的cDNA為模板，以P1F: 5' AGGGGATTCCATGGGCAACACTGGAAGCATCATTAAC-3'和AP1R: 5'-GATTCTAGATTACCCGGGGTTGGACTCAACGTCTCCTG-3 ，為引物，PCR擴(kuò)增FMDV衣殼蛋白基因尸7a-J。分別對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，得到預(yù)期大小約為2200bp的/l 24-2基因片段、2基因片段和3基因片段。FMDV衣殼蛋白基因/724-厶/^i^-i^I/^^-溯突變改造用連接PCR進(jìn)行。以步 驟l擴(kuò)增得到的Asia I /JS/05株的FMDV的cDNA為模板，以P1F:5' -AGGGGATCCATGGGCAACACTGGAAGCATCATTAAC-3'和MP1R:5' -GAGTCCAGTGTCCCACTCAGACAAAATGCACAATGCAGCCCGCTCCGGGTCCGCTGG-3' 為弓I 物，擴(kuò)增得到突變改造的,7i^-7基因的上游片段；以MP 1F: 5 ， -GACCCGGAGCGGGCTGCATTGTGCATTTTGTCTGAGTGGGACACTGGACTCAATTCTAA-3 ，和P1R: 5， -GATTCTAGATTACCCAGGGTTGGACTCCACGTCTCCTG-3，為引物，擴(kuò)增得到 突變改造的尸7W^基因的下游片段；以步驟1擴(kuò)增得到的0/Akesu/58株的FMDV的 cDNA為模板，以P1F: 5， -AGGGGATTCCATGGGCAACACTGGAAGCATCATTAAC-3，和M0P1R: 5' -CAACCCTGTGTCCCACTCAGCMCAATGCAAACTGCAGCCGCTTCAGGTGTTTTCGG-3'為引物， 擴(kuò)增得到突變改造的尸724-邀因的上游片段；以M0P1F: 5 ， -GAAAACACCTGAAGCGGCTGCAGTTTGCATTGTTTGGCTGAGTGGGACACAGGGTTG-3' 和P1R: 5， -GATTCTAGATTACCCAGGGTTGGACTCCACGTCTCCTG-3，引物，擴(kuò)增得到突變 改造的尸W力-邀因的下游片段；以步驟l擴(kuò)增得到的A/XJ/KT/58株的FMDV的cDNA為 模板，以P1F: 5， -AGGGGATTCCATGGGCAACACTGGAAGCATCATTAAC-3，和MAP1R: 5， -CAACCCTGTGTCCCACTCAGCAACGATGATGCATTGCAGCTTTCTCAGGCGTGTCCGG-3 ，為引物， 擴(kuò)增得到突變改造的尸724-堪因的上游片段；以MAP 1F: 5 ， -GGACACGCCTGAGAAAGCTGCAGTTTGCATCATCGCTGAGTGGGACACAGGGTTG-3'禾口 P1R: 5， -GATTCTAGATTACCCAGGGTTGGACTCCACGTCTCCTG-3，引物，擴(kuò)增得到突變改 造的尸724-堪因的下游片段。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，得到大小均為1360bp的 突變改造的尸/^-厶3卩/7^-堪因的上游片段和920bp的突變改造的/^24-7、 堪因的下游片段。再分別以上述擴(kuò)增得到的1360bp的突變改造的 厶"24-3B尸724-邀因的上游片段和920bp的突變改造的尸/24-厶^口 堪因的下游片段為模板，以P1F和P1R為引物，擴(kuò)增得到突變改造的/724-厶 W^I-i和/7^-堪因；對(duì)PC財(cái)廣增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，得到 大小均約為2200bp的突變改造的尸724-厶i和尸7iM-邀因，分別將其命名為3、目的基因的鑒定將上述步驟2擴(kuò)增得到的JC基因、7基因、yz7/^a-2基因、/aWa-J基 因、尸UU基因、尸7W-2基因和3基因分別與pGEM-T載體(Promega公司) 4"C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞均勻涂布于含有Amp的LB瓊脂平板上，挑取單個(gè)菌落，以質(zhì)?？焖偬崛?試劑盒分別小量提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切和PCR鑒定，將PCR鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的重組質(zhì) 粒送上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒分別命名為 pGEM-3C、 pGEM-mP12A-1、 pGEM-mP12A-2、 pGEM-mP12A-3、 pGEM-P12A-1、 pGEM-P12A-2 和pGEM-P12A-3。1的脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示，其所編 碼的氨基酸序列如序列表中序列2所示，其中，自其氨基末端第429位和432位為 亮氨酸(即VP3的自其氨基末端第140位和143位為亮氨酸)；2所編碼的 氨基酸序列是將自GenBank Accession Number AF511039的自氨基末端第217-953 位的0型FMDV的P12A蛋白中VP3的自氨基末端第141位和第144位的組氨酸殘基 均突變?yōu)槔i氨酸所得；歷尸7i^1-3所編碼的氨基酸序列是將自GenBank Accession Number EF494487的自氨基末端第219-956位的A型FMDV的P12A蛋白中VP3的自 氨基末端第142位和第145位的組氨酸殘基突變?yōu)楫惲涟彼岷屠i氨酸所得；3C的脫 氧核糖核苷酸序列如序列表中序列4所示；尸7i^-7所編碼的氨基酸序列如序列表中 序列3所示。二、重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建將實(shí)步驟一構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEM-3C經(jīng)7Vco I和尺/w I酶切后，與經(jīng)同樣酶切 處理的pFastBacTMDual (Invitrogen公司)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受 態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞均勻涂布于含有Amp的LB瓊脂平板上， 挑取單個(gè)菌落，以質(zhì)粒快速提取試劑盒小量制備質(zhì)粒，進(jìn)行PCR、酶切和電泳檢測(cè)， 結(jié)果表明，獲得大小為639bp的酶切片段，將PCR鑒定為結(jié)果為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒命 名為pFastDual-3C。以重組質(zhì)粒pFastDual-3C為模板，以3CR和3CF為引物，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，結(jié)果也獲得639bp的片段，與預(yù)期大小相符，表明3C基因已經(jīng)與轉(zhuǎn)移載 體pFastBacTMDual (Invitrogen公司)正確連接，置于桿狀病毒P,。啟動(dòng)子的控制之 下。將步驟一構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEM-P12A-1和pGEM-mP12A-l、 pGEM-P12A-2和 pGEM-mP12A-2、 pGEM-P12A-3和pGEM-mP12A-3分別用5^n/H和I酶切后，與 用同樣酶切處理的重組質(zhì)粒pFastDual-3C連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受 態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞均勻涂布于含有Amp的LB瓊脂平板上， 挑取單個(gè)菌落，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR、酶切和電泳檢測(cè)。電泳結(jié)果如圖l所示。其 中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1和2為JC基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，泳道3為尸7^4基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。將PCR鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒分別命名為pFastDual-mP12A3C-l、 pFastDual-mP12A3C-2、 pFastDual-mP12A3C-3、 pFastDual-P12A3C-l、 pFastDual-P12A3C-2和pFastDual-P12A3C-3 。分別以重組質(zhì)粒 pFastDual-mP12A3C-l、 pFastDual-mP12A3C-2、 pFastDual-mP12A3C-3為模板，以 P1F和P1R為引物，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果均獲得約2200bp的片段，與預(yù)期大小 相符，表明基因/z 尸^4-厶2和/m。"U已經(jīng)與轉(zhuǎn)移載體pFastBacTMDual (Invitrogen公司)正確連接，并置于桿狀病毒&啟動(dòng)子的控制之下。 三、重組桿粒的獲得將步驟二獲得的重組質(zhì)粒pFastDual-mP12A3C-l、 pFastDual-mP12A3C-2、 pFastDual-mP12A3C-3、 pFastDual-P12A3C-l、 pFastDual-P12A3C-2禾口 pFastDual-P12A3C-3分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac(Invitrogen公司)感受態(tài)細(xì)胞， 取lpL上述感受態(tài)細(xì)胞涂布于LB選擇培養(yǎng)平板上(卡那霉素50|ig/mL、慶大霉素 7pg/mL、四環(huán)素10嗎/mL、 IPTG 40|xg/mL、 Bluo-gal 100|ig/mL) ， 37。C培養(yǎng)48h后 挑選白色菌落，接種于液體LB培養(yǎng)基上，37°。振搖12 h，用S.N.A.P. MidiPrep Kit 試劑盒(Invitrogen公司)分別提取桿粒pFastDual-mP12A3C-l、 pFastDual-mP12A3C-2、 pFastDual-mP12A3C-3、 pFastDual-P12A3C-l、 pFastDual-P12A3C-2和pFastDual-P12A3C-3的DNA，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn) 行。分別以所得三種桿粒的DNA為模板，以M13 Forward(-40) 5， -GTTTTCCCAGTCACGAC-3，和M13 Reverse 5， -CAGGAAACAGCTATGAC-3，為引物， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，具體的檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。其中， M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1和2為野生型桿粒的PCR檢測(cè)結(jié)果，3和4為重組桿粒 pFastDual-mP12A3C-l的PCR檢測(cè)結(jié)果，5和6為重組桿粒pFastDual-P12A3C-l的 PCR檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果表明，野生型桿粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為300bp，重組型桿粒PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物的大小為5401bp。將插入歷尸7^-7基因和JC基因的重組桿粒命名為Bac mP12A3C-l，將插入歷尸"U基因和^基因的重組桿粒命名為Bac mP12A3C-2， 將插入J基因和JC基因的重組桿粒命名為Bac mP12A3C-3，將插入尸7^-7 基因和3C基因的重組桿粒命名為BacP12A3C-l，將插入尸7i^-i"基因和JC基因的重組桿粒命名為Bac P12A3C-2，將插入尸"U基因和JC基因的重組桿粒命名為 BacP12A3C-3。四、 重組桿狀病毒的獲得用S.N.A.P.TMMidiPrep Kit試劑盒提取重組桿粒Bac mP12A3C-l 、 Bac mP12A3C-2、 Bac mP12A3C-3和Bac P12A3C-1、 BacP12A3C-2、 BacP12A3C-3的DNA，分別將提取得到的高純度的桿粒DNA lpg用Cellfectin⑧轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng) 期的Sf9細(xì)胞(Invitrogen公司)。轉(zhuǎn)染Bac mP12A3C-l、 Bac mP12A3C-2、 Bac mP12A3C-3后Sf9細(xì)胞逐漸發(fā)生改變，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞發(fā)生典型病變后， 收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清，此為第一代病毒，4。C保存?zhèn)溆?。Sf9細(xì)胞轉(zhuǎn)染BacmP12A3C-l 后的具體形態(tài)如圖3所示。其中，A為未轉(zhuǎn)染重組桿狀病毒的正常Sf9細(xì)胞的形態(tài)， B為轉(zhuǎn)染重組桿狀病毒Bac mP12A3C-l后Sf9細(xì)胞的形態(tài)，C為轉(zhuǎn)染重組桿狀病毒 BacP12A3C-l后Sf9細(xì)胞的形態(tài)。五、 重組蛋白的表達(dá)與檢測(cè)1、 SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)將上述步驟四獲得的第一代重組桿狀病毒Bac mP12A3C-1、 Bac raP12A3C-2和 BacmP12A3C-3分別在Sf9細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，用噬斑法確定滴度后，分別以10個(gè)感 染復(fù)數(shù)(Multiplicity of Infection, MOI)的上述兩種重組病毒接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的High Five 昆蟲(chóng)細(xì)胞(Invitrogen公司)，72h后收獲細(xì)胞及培養(yǎng)上清。將收獲的細(xì)胞用 細(xì)胞裂解液裂解后，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，培養(yǎng)上清則直接用于SDS-PAGE檢測(cè)，同 時(shí)以未接種重組病毒的High Five 昆蟲(chóng)細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染Bac P12A3C-1、 Bac P12A3C-2 和Bac P12A3C-3的High Five 昆蟲(chóng)細(xì)胞裂解液作為對(duì)照。將電泳蛋白帶轉(zhuǎn)印至硝 酸纖維素膜上，PBST洗滌硝酸纖維素膜后，用3。/。的BSA37X:封閉45niin，再用PBST 洗滌后分別加入Asia I型FMDV感染豬血清(Asia I /JS/05株免疫豬得到的血清)、 O型FMDV感染牛血清(0/Akesu/58株免疫牛得到的血清)和A型FMDV感染牛血清 (A/XJ/KT/58株免疫牛得到的血清)于37。C作用lh， PBST洗滌后加入1:20000稀 釋的服P-兔抗豬IgG 37。C作用lh。充分洗滌，加入DAB-HA顯色，觀察特異性條 帶。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，其中，M為14-116KDa的蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，1 為重組桿狀病毒Bac P12A3C-1轉(zhuǎn)染High FiveTM昆蟲(chóng)細(xì)胞后培養(yǎng)上清的SDS-PAGE 檢測(cè)結(jié)果，2和3為重組桿狀病毒Bac mP12A3C-l轉(zhuǎn)染High FiveTM昆蟲(chóng)細(xì)胞后培養(yǎng)上清的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果，4為未轉(zhuǎn)染任何重組桿狀病毒的正常High FiveTM昆蟲(chóng) 細(xì)胞裂解液的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果，5為轉(zhuǎn)染野生型桿狀病毒的High FiveTM昆蟲(chóng)細(xì) 胞裂解液的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果，6為轉(zhuǎn)染野生型桿狀病毒的High FiveTM昆蟲(chóng)細(xì)胞 培養(yǎng)上清的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果，7為重組桿狀病毒Bac mP12A3C-l轉(zhuǎn)染High Five 昆蟲(chóng)細(xì)胞后細(xì)胞裂解液的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果，8為重組桿狀病毒Bac P12A3C-1轉(zhuǎn) 染High FiveTM昆蟲(chóng)細(xì)胞后細(xì)胞裂解液的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果表明，重組桿狀病毒感染細(xì)胞的培養(yǎng)上清比作為對(duì)照的野生 型桿狀病毒感染細(xì)胞的培養(yǎng)上清在80kDa (PI) 、 47kDa (VP31) 、 33kDa (VPO)、 24kDa (VP3)和23kDa (VP1)處多出條帶，說(shuō)明歷尸/24-么3基因 和JC基因均在昆蟲(chóng)細(xì)胞中獲得表達(dá)，且raP12A-l蛋白、mP12A-2蛋白和mP12A-3 蛋白均被3C蛋白酶成功地加工裂解。對(duì)上述表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果出現(xiàn)了 5條反應(yīng)條帶(Pl、 VP31、 VP0、 VP3和VP1) ， Western blot檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。其中，1和2為重組桿狀病 毒Bac mP12A3C-l轉(zhuǎn)染High FiveTM昆蟲(chóng)細(xì)胞后的Western blot檢測(cè)結(jié)果，3禾B 4為 重組桿狀病毒BacP12A3C-l轉(zhuǎn)染High Five 昆蟲(chóng)細(xì)胞后的Western blot檢測(cè)結(jié)果。 結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物能與FMDV陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)，且具有很高的特異性。2、間接免疫熒光檢測(cè)用重組桿狀病毒BacmP12A3C-l、 Bac mP12A3C-2、 Bac mP12A3C-3、 Bac P12A3C-l、BacP12A3C-2和BacP12A3C-3分別感染HighFiveTM細(xì)胞，12h后，用3. 7% 的多聚甲醛固定細(xì)胞10min，用含有iy。BSA的PBS洗滌2次，再用50mraol/L NHX1淬滅 10min。分別加入Asia I型FMDV兔抗血清(Asia I/JS/05株免疫兔得到的血清)、O 型FMDV兔抗血清(0/Akesu/58株免疫兔得到的血清)和A型FMDV兔抗血清 (A/XJ/KT/58株免疫兔得到的血清)于37t:作用40min。用含有P/。BSA的PBS洗滌后 加入熒光素標(biāo)記的羊抗兔抗血清于37。C作用15-30min。 PBS洗滌后用甘油封片，熒 光顯微鏡觀察。間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果如圖6所示。其中，Al和A2分別為重組桿狀病毒Bac mP12A3C-l和BacP12A3C-l感染HighFiveTM細(xì)胞后的間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果，B為 野生型桿狀病毒感染HighFiveTM細(xì)胞后的間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果。間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明，重組桿狀病毒BacmP12A3C-l、 Bac mP12A3C-2、 BacmP12A3C-3、 BacP12A3C-l、 Bac P12A3C-2和Bac P12A3C-3感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞顯示強(qiáng)熒光信號(hào)，并且熒光主要集中在細(xì)胞膜上，而野生型桿狀病毒感染的HighFiveTM昆蟲(chóng)細(xì)胞熒光信號(hào)為陰性，表明歷尸724-厶么zz 尸^4-堪因和/724-厶 么堪因在High FiveTM昆蟲(chóng)細(xì)胞中均獲得表達(dá)。 六、空衣殼結(jié)構(gòu)電鏡觀察將上述步驟四獲得的重組桿狀病毒BacmP12A3C-l、 Bac mP12A3C-2、 Bac mP12A3C-3培養(yǎng)至第3代后分別感染HighFiveTM細(xì)胞，96h后細(xì)胞病變完全，離心 收集細(xì)胞，加細(xì)胞裂解液裂解后，離心取上清20uL，磷鴇酸負(fù)染色后置電子顯微 鏡下觀察空衣殼結(jié)構(gòu)。電鏡觀察結(jié)果如圖7、圖8和圖9所示。其中，圖7A、圖8A和圖9A分別為改 造后的/7^基因(即/ z/VZ4-7、 /w/^a-2和/a^i^-J基因)在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)后組裝 為完整的空衣殼，圖7B、圖8B和圖9B分別為未改造的尸7^基因卿尸^4-厶尸"力-2 和/V^-J基因)在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)后觀察不到空衣殼。結(jié)果表明，通過(guò)耐酸性改造 的重組桿狀病毒BacmP12A3C-l、 Bac mP12A3C-2、 BacmP12A3C-3在感染細(xì)胞中 產(chǎn)生了直徑約為30nra的空衣殼結(jié)構(gòu)，呈正六邊形，大小和形狀與FMDV 75S衣殼結(jié) 構(gòu)相似，而重組桿狀病毒BacP12A3C-l、 BacP12A3C-2、 Bac P12A3C-3在感染細(xì) 胞中不能得到FMDV空衣殼。序列表<160〉 4〈210〉 1〈211〉 2208<212> DNA <213〉人工序列<400> 1atgggcaaceictggaagcatcatteiEicaac tactacatgcgigc3gtaccagaactccatg60gacacgcaacttggagataatgctatcagc ggaggctcca3cgagggttccacggacacc120acstcc3C3Cacacaaacaacacccaaaac aatgattggttctcacgcttggccaactcg180gcctttagcgg3Ctgtttggtgctcttttg gctgacaagaa肌cggaggagacaactctg240cttgaagaccgcattctcaccaccagaaat ggccacacgacgtcgacgac3ceigtcgEigt300gttggcgtaacatatggttacgctgtggct ga卿cgcggtatctgggcctaacacctca360ggcctggagacccgcgtaacacaggctgaa cggttcttcaagaaacacctgtttgactgg420acgccggatttgtcatttggacactgtca_c tacttggaactcccctctga3C3C肌gggC480gtgtttggcagcctcatgagctcttatgct tacatgagga3CgggtgggElcgttgaggtg540accgctgttggaaatcagttcaatggtggt tgtctcctcgtcgcactcgtgccggeigctg600ataaagctcggC8CgCggC3gaagtatcag ttaaccctcttCCC3C8CC3gttcattaac660ccgcgcacta3C3tgacggctcacattaac gtgccgtacgtgggtgtcaacaggtacgac720C3gt3Cg3gCtccac肌accgtggacgctt gtggtgatggtggtggccccgcttaccgtc780aaaactggtggttctgaacag3tc33ggtc tacatgaMgcagcgccgacctacgtgcac840gtggcagg叫aactgccctcg朋卿gggg 8t3gttCCtgtggcgtgtgtggacggttac900ggC纖3tggtaaccacggacccgaagacg gctgaccccgtctacgggaaagtgtctaac960cccccca_gaacaagcttccctgggcgtttc acaaacttccttgatgtsgcggaggcgtgt1020ccgaccttcctccgcttcggagaagtacca tttgtgaagacggtgaactctggtgaccgc1080ttgcttgccaagtttgacgtgtccctcgct gcggggcacatgtccaacacctacttggca1140ggtttggcacagtactscac3C3gtax:3gc ggcactatgaatatccacttcatgttcacc1200ggacccacggatgccaaagcccgctacatggtggcttacatacctcctggtatgacaccg1260ccagcggacccggagcgggctgcattgtgcattttgtctgagtgggacactggactcaat1320tctaaattt3ccttttctatcccttacctttctgctgcagactatgcttacactgcttct1380gacgtggctgagaccacgagtgtgcagggatgggtgtgtatttaccagatcacccacggt1440gtgacgcgctggtcgtgtccgtcagcgctggcaaggactttgagtttcga1500ctaccggtggatgcccgccaacagactaxxaccaccggcg3gtccgc3ga_cccagtcacc1560accacggttg鄧aactacggaggagaaacccagacggcccgacggcttcacactgatgtc1620gccttcgttctcgacaggttcgtgaaactcaccca_gccc3agagcacccaaacccttgat1680ctcEitgcag3tcccctcacacacactggtcggggcgcttctccggtctgcgacgtactac1740ttctcagatctggaggttgcgctcgtccacacaggaccggtC3Cgtgggtgcccaatggt1800gcgcctaagaccgccttgaaaacccgactgcct3ccagaagcagcctatc1860acccgcttggcactcccctacaccgctccccaccgtgtgctgtcaacagtgt3C38Cggg1920atcctcgcggcgtgatgatcttgccgccctCgC3CgC8gEl1980gtg3gC犯CCggctgcccacttccttcaactacggcgctgtgaaggccgacaccatcacg2040gagctgttgatCCgC3tg犯gcgtgcggaaacatactgccccaggcccttgctggctctt2100g3ca_cc3C3caagaccgccgtaaacaggagatcattgc3cctgagaaacagactttgaac2160tttgacctactcaagttggcaggagacgtggagtccaaccctgggtaa2208〈210〉 2<211〉 735<212〉 PRT 〈213〉人工序列<220〉〈221> MISC一FEATURE<222〉 (429)〈223〉 Xaa=Leu或lie或Val或Ala或Asp或Gly或Met或Phe或Asn或Cys或 Glu或Gin或Pro或Ser或Thr或Tyr或Trp〈220〉<221〉 MISC—FEATURE <222> (432)<223> Xaa=Leu或lie或Val或Ala或Asp或Gly或Met或Phe或Asn或Cys或 Glu或Gin或Pro或Ser或Thr或Tyr或Trp<400〉 2Met Gly Asn Thr Gly Ser lie lie Asn Asn Tyr Tyr Met Gin Gin Tyr15 10 15Gin Asn Ser Met Asp Thr Gin Leu Gly Asp Asn Ala lie Ser Gly Gly20 25 30Ser Asn Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Asn Asn Thr35 40 45Gin Asn Asn Asp Trp Phe Ser Arg Leu Ala Asn Ser Ala Phe Ser Gly50 55 60Leu Phe Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu 65 70 75 80Leu Glu Asp Arg lie Leu Thr Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr85 90 95Thr Gin Ser Ser Val Gly Val Thr Tyr Gly Tyr Ala Val Ala Glu Asp100 105 110Ala Val Ser Gly Pro Asn Thr Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Thr Gin115 120 125Ala Glu Arg Phe Phe Lys Lys His Leu Phe Asp Trp Thr Pro Asp Leu130 135 140Ser Phe Gly His Cys His Tyr Leu Glu Leu Pro Ser Glu His Lys Gly 145 150 155 160Val Phe Gly Ser Leu Met Ser Ser Tyr Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp165 170 175Asp Val Glu Val Thr Ala Val Gly Asn Gin Phe Asn Gly Gly Cys Leu 180 185 190Leu Val Ala Leu Val Pro Glu Leu lie Lys Leu Gly 195 200 Leu Thr Leu Phe Pro HisTyr Gin 210Met Thr Ala His lie Asn 225 230 Gin Tyr Glu Leu His Lys 245Pro Leu Thr Val Lys Thr 260Asn Ala Ala Pro Thr Tyr 275Glu Gly lie Val Pro Val290 Thr Thr 305Pro ProPro 215Val Pro Tyr ValGin Phe lie Asn 220 ValThr 205 ProAsnPro Trp ThrAsp Pro Lys ArgThrThr 310 PheGlyValAla 295 AlaTrp GlyGly 235Val Val Met ValArg Gin Lys Arg Thr Asn ArgLeu 250Glu Gin lie LysSer 265Val Ala Gly GluTyr Asp 240 Val Ala 255Tyr MetPro Gly ArgSer 325Pro Thr Phe LeuHis 280Cys Val Asp Asp Pro Vsl GlyGlyGlyTyr 315 ThrVal 270Pro Ser LysTyr 300 GlyAsnLeu 285Gly Asn Met ValLys PheAla Glu Ala Cys 340Asn Ser Gly AspPhe 330Phe Gly Glu ValLys Thr Val 355Ala Gly His MetArg 345Leu Leu Ala LysLeu Ala 370Tyr Tyr Thr Gin Tyr 385Gly Pro Thr AspArg 360Asn Thr Tyr LeuVal Ser Asn 320Leu Asp Val335 Pro Phe Val 350Asp Val SerSer 375Gly Thr Met AsnPhe 365Gly Leu Ala GinSer 390Lys Ala Arg TyrAla 380His Phe MetGly Met Thr Pro 420Ala 405Pro Ala Asp Prolie 395Val Ala Tyr lieGlu 425Met 410Arg Ala Ala XaaCys 430Phe Thr 400 Pro Pro 415lie XaaSer Glu Trp Asp Thr Gly Leu Asn Ser 435Ser Ala AlaTyr Leu 450Thr Thr Ser Val Gin 465Lys Ala Glu GlyGly AspTyr 455 TrpAsn 440 AlaValTyr CysGly 470Ala Leu Val ValPhe Glu Phe Arg 500 AlaAsp 485Leu Pro Val AspGly Glu Ser 515 GinGlu Thr 530 Asp Arg 545Leu Met Gin lieAsp Pro Val AlaPhe Val LysAla 505 ThrLys Phe "Thr Phe 445Thr Ala Ser Asp 460lie Tyr Gin lie 475Ser Val Ser Ala 490Arg Gin Gin ThrThr Ala ArgLeu 550SerPro 565Phe Ser Asp LeuAla Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu 580 585 Trp Val Pro Asn Gly AlaThr Thr Thr Val Glu Asn 520 525 Leu His Thr Asp Val Ala 540Gin Pro Lys Ser Thr Gin 555His Thr Leu Val Gly Ala Leu 570Val Ala Leu ValArg 535 ThrPro Val Thr 595His Thr Asn Pro Thr Ala 610Leu Pro Tyr Thr Ala Pro 625 630 Lys Thr Thr Tyr Gly GluLeu Ala Arg Arg 660Gly 645Val Ser Asn ArgGly Ala Pro Lys Thr Ala 600 605 Tyr Gin Lys Gin Pro lie Thr 615 620 His Arg Val JLeu Ser Thr Val 635Glu Ser Ser Arg Arg Asp Asp 650Pro Thr Ser PheLeu 665Ser lie ProVal Ala GluThrGlyThrLeuHis Gly ■ Lys Asp 495Thr ThrThr 510Tyr Gly Gly Phe Val LeuLeu Asp 560 Arg Ser 575Thr GlyHis 590Leu Asn AsnArg Leu AlaTyr Asn Gly 640Leu Alei Ala655 Asn Tyr Gly 670Ala Val Lys Ala Asp Thr lie Thr Glu Leu Leu lie Arg Met Lys Arg675 680 685Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Leu Asp Thr Thr Gin690 695 700Asp Arg Arg Lys Gin Glu lie lie Ala Pro Glu Lys Gin Thr Leu Asn 705 710 715 720Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly 725 730 735〈210〉 3〈211〉 735<212> PRT 〈213>人工序列<400> 3Met Gly Asn Thr Gly Ser lie lie Asn Asn Tyr Tyr Met Gin Gin Tyr15 10 15Gin Asn Ser Met Asp Thr Gin Leu Gly Asp Asn Ala lie Ser Gly Gly20 25 30Ser Asn Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Asn Asn Thr35 40 45Gin Asn Asn Asp Trp Phe Ser Arg Leu Ala Asn Ser Ala Phe Ser Gly50 55 60Leu Phe Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu 65 70 75 80Leu Glu Asp Arg lie Leu Thr Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr85 90 95Thr Gin Ser Ser Val Gly Val Thr Tyr Gly Tyr Ala Val Ala Glu Asp100 105 110Ala Val Ser Gly Pro Asn Thr Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Thr GinAlaSer 145 ValTyrGluThr 305 ProGlu 130 PhePhe115Arg Phe Phe Lys120His Leu Phe AspGly His Cys GlyLys 135Tyr Leu Glu LeuSerHis 150Met Ser Ser TyrLeu 165Thr Ala Val GlyPro 155 Tyr125 Trp Thr Pro 140Ser Glu HisMetAsp Val Glu Val 180Leu Val Pro GluAla 170Gin Phe AsnLeu Val Ala 195Leu Thr Leu PheAsn 185lie Lys Leu GlyGin 210Thr Ala His lieLeu 200His Gin Phe lieMet 225Gin Tyr Glu LeuPro Leu Thr Vsl 260 ProAsn 230 LysPro 215Val Pro Tyr ValAsn 220 ValArgGlyThr 205 ProAsnProHis 245Lys Thr GlyTrp GlyThr Leu 250Glu Gin lie LysThrAsn Ala Ala 275lie Val ProGly 290 ThrProAsp Pro Lys ArgThrTyrValThr 310 PheValAla 295 AlaProSer 265Val Ala Gly GluSer 325Pro Thr Phe LeuHis 280Cys Val Asp Asp Pro Val GlyGly GlyAsnGly 235Val Val Met ValVal 270 ProArgTyr 315Thr Asn Phe LeuPhe 330Phe Gly Glu ValAspLysGly 175 CysLeuGly 160 TrpLeuGly 190Arg Gin Lys Arg Thr Asn ArgTyrVal 255 TyrSerLeu 285Gly Asn MetTyr 300Gly Lys Val SerAsp 335 PheAsp 240 AlaMetLysValAsn 320 ValValAla Glu Ala Cys Pro Thr Phe Leu Arg Phe Gly Glu Val Pro 340 345 350Lys Thr Val Asn Ser Gly Asp Arg Leu Leu Ala Lys Phe Asp Val Ser24355Ala Gly His MetLeu Ala 370Tyr Tyr Thr Gin Tyr 385Gly Pro Thr Asp360Asn Thr Tyr LeuSer 375Gly Thr Met Asn365Gly Leu Ala GinSer 390Lys Ala Arg TyrAla 380His Phe MetGly Met Thr Pro 420 AspAla 405Pro Ala Asp Prolie 395Val Ala Tyr lieMet 410Arg Ala Ala HisThrSer Glu Trp 435Tyr Leu Ser Ala Ala 450Thr Thr Ser Val Gin 465Lys Ala Glu GlyGly AspLeuTyr 455 TrpAsn 440 AlaValGlu 425Ser Lys Phe ThrGly 470Ala Leu Val ValTyr Thr Ala CyslieSer 460 GinAsp 485Leu Pro Val AspPhe Glu Phe Arg 500Ala Asp Pro ValSer 490Arg Gin Gin ThrGly Glu Ser 515Gin Thr Ala ArgAla 505Thr Thr Val GluGlu Thr 530Asp Arg Phe Val Lys 545Leu Met Gin lieThr 520Leu His Thr AspArg 535Thr Gin Pro LysLeu 550Ser His Thr LeuPro 565Phe Ser Asp LeuAla Thr Tyr Tyr 580Pro Val Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Lys Thr Ala Leu Asn AsnGlu 585 AlaVal 570Val Ala Leu ValCys 楊 SerPhe Thr 400 Pro Pro 415lie His lie ProPhe 445Asp Val Ala GluTyr 475Val Ser Ala Glylie Thr His Gly 480 Lys Asp 495Thr ThrThr 510Tyr Gly GlyAsn 525Ala Phe Val LeuVal 540Thr Gin ThrSer 555Gly Ala Leu LeuHis 590 LeuLeu Asp 560 Arg Ser 575Thr Gly595Asn Pro Thr AlaHis Thr 610Leu Pro Tyr Thr Ala 625Lys Thr Thr600Gin Lys Gin ProTyr 615His Arg Val LeuPro 630Glu Glu Ser SerTyr Gly 645Leu Ala Arg Arg Val Ser Asn Arg 660Ala Asp Thr lieArg 650 ProSer 635 ArgThrAla ValAla Glu 690 Asp Arg 705Phe AspLys 675 ThrArgLeuTyr CysLys GinLeu Lys 725ProArg 695 lieThr 680Pro Leu Leu Alalie 620 ThrLeu 665Glu Leu Leu lie605 ThrValArg Leu Ala TyrAsp Asp Leu SerPheAsn 670 MetAsnAla 655 TyrGlu 710Leu Ala Gly AspLeu 700Lys Gin Thr Leulie Ala Pro Glu 715Glu Ser Asn ProVal 730Gly 640 AlaGlyArg 685Asp Thr Thr GinAsn 720Gly 735〈210〉 4<211> 642<212> DNA <213>人工序列<400〉 4agtggtgccccaccgactgacttgcaaaagatggtcatgggcaacaccaagcctgttgag60ctcatcctcg3CggC33g3Cggt3gCC3tCtgctgcgctaccggagtctttggtactgcc120tacctcgagcctcgtcaccttttcgcagagaagtacgacaagatcatgctggacggcaga180gccatgacagacagtgactacagagtgtttgagtttgagattaeiagta^aaggacaggac240atgctctcagacgccgcactcatggtgctcc織gtgggaatcgcgtgcgtgacatcacg300aagcacttccgtgatgtagcc肌g3tga3gaaaggaacccccgtcgttggtgtga/ttaac360aacgccgacg ttgggagact gattttctct ggtgaggccc taacctacaa agacattgta 420gtgtgcatgg acggagacac catgcctggg ctttttgcct acaaggccgt caccagggcg 480ggctactgtg gaggagccgt tctcgcgaag gacggagccg agactttcat cgtcggcact 540cactccgcag gcggcaacgg agttggatac tgctcgtgcg tttccaggtc catgctgctc 600aagatgaaigg ctcaceitcgs ccccgeiacca caccacga_gt犯 64權(quán)利要求
1. 一種空衣殼蛋白，是將口蹄疫病毒的P12A進(jìn)行耐酸性改造得到的突變蛋白；所述耐酸性改造是將口蹄疫病毒的P12A中VP3的自氨基末端第140-145位中的組氨酸殘基突變?yōu)樗嵝原h(huán)境中不帶正電荷的氨基酸；所述酸性環(huán)境中不帶正電荷的氨基酸為天門(mén)冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；優(yōu)選為亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；更優(yōu)選為亮氨酸、異亮氨酸或纈氨酸；所述P12A的VP4、VP2、VP3、VP1和2A蛋白均來(lái)自口蹄疫病毒的同一毒株，或分別來(lái)自口蹄疫病毒的不同毒株。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白，其特征在于所述空衣殼蛋白為下述七種蛋白之一1) 其氨基酸序列為序列表中的序列2;2) 由氨基酸序列是自GenBank Accession Number AF511039的氨基末端第 217-953位的0型FMDV的P12A蛋白進(jìn)行耐酸性改造得到的突變蛋白，該耐酸性改 造是將P12A中VP3的自氨基末端第141位和第144位的組氨酸殘基突變?yōu)樘扉T(mén)冬 酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、色氨酸、 亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；3 )由氨基酸序列是自GenBank Accession Number EF494487的氨基末端第 219-956位的A型FMDV的P12A蛋白進(jìn)行耐酸性改造得到的突變蛋白，該耐酸性改 造是將P12A中VP3的自氨基末端第142位和第145位的組氨酸殘基突變?yōu)樘扉T(mén)冬 酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、色氨酸、 亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；4)由氨基酸序列是自GenBank Accession Number AM409325的氨基末端第 217-948位的C型FMDV的P12A蛋白進(jìn)行耐酸性改造得到的突變蛋白，該耐酸性改 造是將P12A中VP3的自氨基末端第140位和第143位的組氨酸殘基突變?yōu)樘扉T(mén)冬 酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、色氨酸、 亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；5) 由氨基酸序列是自GenBank Accession Number NC011451的氨基末端第 215-960位的SAT1型FMDV的P12A蛋白進(jìn)行耐酸性改造得到的突變蛋白，該耐酸性 改造是將P12A中VP3的自氨基末端第142位和第145位的組氨酸殘基突變?yōu)樘扉T(mén) 冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、色氨 酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；6) 由氨基酸序列是自GenBank Accession Number NC003992的氨基末端第 215-956位的SAT2型FMDV的P12A蛋白進(jìn)行耐酸性改造得到的突變蛋白，該耐酸性 改造是將P12A中VP3的自氨基末端第142位和第145位的組氨酸殘基突變?yōu)樘扉T(mén) 冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、色氨 酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；7) 由氨基酸序列是自GenBank Accession Number AY593852的氨基末端第 215-956位的SAT3型FMDV的P12A蛋白進(jìn)行耐酸性改造得到的突變蛋白，該耐酸性 改造是將P12A中VP3的自氨基末端第142位和第145位的組氨酸殘基突變?yōu)樘扉T(mén) 冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、色氨 酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸。
3、 權(quán)利要求1或2所述蛋白的編碼基因。
4、 含有權(quán)利要求3所述基因的重組載體和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
5、 一種在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)口蹄疫病毒空衣殼的方法，包括以下步驟1) 將權(quán)利要求3所述的基因和口蹄疫病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因JC通過(guò)桿狀病毒 載體導(dǎo)入細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行重組，得到重組桿狀病毒A;2) 用所述重組桿狀病毒A的DNA轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，獲得口蹄疫病毒空衣殼。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述方法中還包括將用所述重 組桿狀病毒A的DNA轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞得到的重組桿狀病毒再感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，獲得口蹄 疫病毒空衣殼的步驟。所述昆蟲(chóng)細(xì)胞為Sf9細(xì)胞系、sf21細(xì)胞系或High Five細(xì)胞系； 所述權(quán)利要求5中的細(xì)胞系優(yōu)選為Sf9細(xì)胞系； 所述權(quán)利要求6中的細(xì)胞系優(yōu)選為High Five細(xì)胞系。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述權(quán)利要求3所述的基 因和口蹄疫病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因^C可通過(guò)同一個(gè)含有雙啟動(dòng)子的桿狀病毒載體 導(dǎo)入細(xì)菌內(nèi)，權(quán)利要求3所述的基因插入所述雙啟動(dòng)子桿狀病毒載體的一個(gè)啟動(dòng)子下游，所述口蹄疫病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因JC插入所述雙啟動(dòng)子桿狀病毒載體的另 一個(gè)啟動(dòng)子下游；所述細(xì)菌優(yōu)選為大腸桿菌。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述雙啟動(dòng)子桿狀病毒載體為 能在細(xì)菌內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)座重組的載體；所述雙啟動(dòng)子桿狀病毒載體優(yōu)選為 pFastBacTMDual。
9、 利用權(quán)利要求8所述方法制備的口蹄疫病毒空衣殼。
10、 權(quán)利要求9所述的口蹄疫病毒空衣殼在制備口蹄疫病毒疫苗或制備口蹄疫 病毒診斷試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種通過(guò)耐酸性改造在昆蟲(chóng)細(xì)胞中組裝口蹄疫病毒空衣殼的方法。本發(fā)明的在昆蟲(chóng)細(xì)胞中組裝口蹄疫病毒空衣殼的方法，包括以下步驟1)將改造后的P12A基因和口蹄疫病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因3C通過(guò)桿狀病毒載體導(dǎo)入細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行重組，得到重組桿狀病毒A；用重組桿狀病毒A的DNA轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，獲得口蹄疫病毒空衣殼。本發(fā)明首次在昆蟲(chóng)細(xì)胞中組裝成了完整的FMDV空衣殼，為基因工程亞單位疫苗和新型診斷試劑的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101270155SQ20081010595
公開(kāi)日2008年9月24日 申請(qǐng)日期2008年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月6日
發(fā)明者劉在新, 盧曾軍, 普 孫, 曹軼梅, 李平花, 謝慶閣, 郭建宏 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所