專利名稱：一種adp-葡萄糖焦磷酸化酶突變體及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體及其編碼基因與應(yīng)用，特別是 涉及來(lái)源于玉米胚乳的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
淀粉作為一種在工業(yè)生產(chǎn)和人類(lèi)生活中不可替代的物質(zhì)資源，在人類(lèi)生產(chǎn)和生 活中占有十分重要的地位，因此科研人員對(duì)于淀粉合成的研究投入了極大的熱情， 并且從未間斷過(guò)。在過(guò)去的很長(zhǎng)一段時(shí)間里，為了能夠滿足持續(xù)增長(zhǎng)的世界人口所 帶來(lái)的糧食需求和工業(yè)原料供給，人們僅僅致力于提高農(nóng)作物(如玉米、小麥、水 稻等)的產(chǎn)量。然而，隨著社會(huì)的飛速發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，同時(shí)從環(huán) 境保護(hù)和可持續(xù)發(fā)展的角度出發(fā)，對(duì)農(nóng)作物中淀粉含量和質(zhì)量的要求也會(huì)日益增加 和提高。此外，由于淀粉含量高的植物細(xì)胞或器官吸收脂肪或煎炸油量少，因此食 品工業(yè)上淀粉可用于生產(chǎn)低熱量的"更健康"的食品。同時(shí)醫(yī)藥工業(yè)應(yīng)用淀粉為原 料生產(chǎn)抗生素和維生素；鑄造工業(yè)應(yīng)用淀粉為砂芯膠粘劑；石油工業(yè)油井鉆泥中應(yīng) 用淀粉使其具有蓄水性；干電池中應(yīng)用淀粉為電解質(zhì)載體等。其他諸如油漆、塑料、 染料、紡織、造紙、輪胎橡膠等行業(yè)，均將淀粉作為必需的材料，淀粉也是制作各 類(lèi)變性淀粉的起始材料。研究發(fā)現(xiàn)，大米、麥子及玉蜀黍等農(nóng)作物中均富含淀粉。 但據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界生產(chǎn)和生活所用淀粉80%以上來(lái)源于玉米。在美國(guó)這一比例更是 高達(dá)95%以上。我國(guó)在高淀粉玉米方面的研究還存在許多欠缺之處。因此，加速工 業(yè)用高淀粉玉米品種的培育和改良已勢(shì)在必行。
在生物體內(nèi)，淀粉的合成過(guò)程涉及到一系列酶的共同參與，如ADP-葡萄糖焦 磷酸4七酶(ADP-Glucosepyrophosphorylase， AGPase)、；定私、合成酶(strarch synthase, SS)、淀粉分支酶(starch branching enzyme, SBE)和淀粉去分支酶(starch debranchingenzyme, DBE)等。其中，AGPase是細(xì)菌糖原和植物淀粉合成的關(guān)鍵酶， 它能夠催化l-磷酸葡萄糖(1-P-Glucose)和腺苷三磷酸(ATP)生成腺苷二磷酸葡 萄糖(ADPG)和焦磷酸(PPi)。同時(shí)，ADPG作為淀粉合成的前體物質(zhì)在淀粉合成酶、 淀粉分支酶和淀粉去分支酶等的協(xié)同作用下合成直鏈淀粉和支鏈淀粉。因此， AGPase活性的高低是決定淀粉積累速率的關(guān)鍵因素之一。提高AGPase活性以促進(jìn)還原糖向淀粉合成方向的轉(zhuǎn)化，是提高作物淀粉含量、實(shí)現(xiàn)品質(zhì)改良的重要途徑。在
高等植物中，AGPase具有復(fù)雜的異源四聚體結(jié)構(gòu)。到目前為止，已從玉米、小麥、 菠菜、甜菜、擬南芥、大麥和馬鈴薯等多種植物中得到分離純化到AGPase。
AGPase活性的高低受多種因素共同調(diào)控。其中別構(gòu)調(diào)節(jié)是一種重要的調(diào)節(jié)方 式，該方式通過(guò)調(diào)節(jié)激活劑3-磷酸甘油酸(3-PGA)和抑制劑無(wú)機(jī)磷(Pi)的比例 來(lái)達(dá)到控制酶活性的目的。1969年，Cattaneo等(Cattaneo J, O. M., Sigal N, Sanchez-Medina Q Puig J. Genitic studies of E.coli K12 mutants with alterations in glycogenesis and properties of an altered AGPase. Biochem Biophys Res Commun . 1969,34:694-701.)發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌(E.coli) K12株系中的一個(gè)突變菌株，其糖原 含量比野生型菌株提高了 33%以上。進(jìn)一步研究證實(shí)，突變體糖原含量提高的原因 是由于控制糖原合成的關(guān)鍵酶AGPase發(fā)生了突變，改變了該酶對(duì)別構(gòu)調(diào)節(jié)劑的反 應(yīng)，即對(duì)別構(gòu)調(diào)節(jié)不敏感(Lee Y M， K. A., Preiss J. Amino acid sequence of an E.coli ADPglucose synthetase allostefric mutants as deduced from the DNA sequence of the glgC gene. Nucleic Acids Res, 1987, 15: 10603.)。 1992年，Monsanto公司的Stark等 人(David M. Stark, Kurt P. Timmerman et al. Regulation of the amount of starch in plant tissues byAGPase.Science,258:287-291.)將突變的AGPase基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯中，獲得了 淀粉含量提高的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯。該轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中淀粉平均含量比對(duì)照提高了 35 %，有的甚至高達(dá)60%，這是利用基因工程手段提高植物淀粉含量的第一個(gè)成功的 例子。
環(huán)境因素(尤其是溫度)對(duì)AGPase活性的影響也是不容忽視的重要因素之一。 研究證實(shí)，玉米胚乳AGPase是一種熱不穩(wěn)定酶，耐熱性低，溫度的變化能夠顯著 地影響AGPase的活性。Hannah等(Hannah L, Tuschall D， Mans R. Multiple forms of maize endosperm ADP-glucose pyrophosphorylase and their control by shrunken-2 and brittle-2. Genetics. 1980,95,961-970.)通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，57。C熱處理5分鐘后，玉米胚 乳AGPase活性喪失了 96%以上。AGPase作為植物中淀粉生物合成的限速酶，高溫 能夠顯著地降低AGPase活性的同時(shí)也減少了淀粉的合成與積累，谷物的產(chǎn)量也隨 之降低。Green等(Greene, T. W. and L. C. Hannah. Enhanced stability of maize endosperm ADP-glucose pyrophosphorylase is gained through mutants that alter subunit interactions." Proc Natl Acad Sci USA. 1998, 95 (22): 13342-13347.)利用突變技術(shù)得 到了一個(gè)AGPase熱穩(wěn)定性提高的突變體，分析結(jié)果表明該突變體熱穩(wěn)定性提高的原因是由于AGPase大小亞基之間相互作用得到了增強(qiáng)。
雖然玉米胚乳的AGPase與馬鈴薯塊莖和菠菜葉來(lái)源的AGPases在氨基酸序列 上具有很高的同源性，但在亞細(xì)胞定位、調(diào)控性質(zhì)以及熱穩(wěn)定性等方面，玉米胚乳 的AGPase與馬鈴薯塊莖和菠菜葉來(lái)源的AGPase卻存在著很大的區(qū)別，如馬鈴薯 塊莖AGPase定位于儲(chǔ)藏器官的淀粉體內(nèi)，而玉米胚乳的AGPase主要定位于淀粉體 外的胞質(zhì)中；馬鈴薯塊莖AGPase對(duì)激活劑和抑制劑相當(dāng)敏感，在沒(méi)有激活劑存在 的情況下，其活性可以忽略不計(jì)(檢測(cè)活性比較困難)，而玉米胚乳AGPase則不同， 在無(wú)激活劑存在的情況下，酶活性仍然較高，而且激活劑的存在可以部分彌補(bǔ)抑制 劑對(duì)活性的影響；此外，馬鈴薯AGPase可以受不同水平的調(diào)控，如轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn) 錄后水平以及翻譯后還原修飾調(diào)控等，而在玉米的籽粒中，AGPase的大小亞基的含 量變化與其編碼基因幼rw Ae/7-2和Ari"7e-i"的轉(zhuǎn)錄水平一致，目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn) 其它水平的調(diào)控。
在熱穩(wěn)定性方面，Ballicora等(Ballicora MA， Laughlin MJ, Fu Y， Okita Tw, Barry GF, Preiss J. Adenosine 5'-diphosphate-glucose pyrophosphorylase from potato tuber. Significance of the N terminus of the small subunit for catalytic properties and heat stability. Plant Physiol. 1995,109:245-21)研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯塊莖中的AGPase能夠具 備很好的熱穩(wěn)定性是由于在AGPase兩個(gè)小亞基的N端均有半胱氨酸。隨后，經(jīng)過(guò) 進(jìn)一步研究，Ballicora等(Ballicora MA, Fu Y, Frueauf JB, Preiss J. Heat stability of potato tuber ADP-glucose pyrophosphorylase: role of Cys residue 12 in the small subunit. Biochem Biophys Res Commun. 1999,257:782-786)發(fā)現(xiàn)半胱氨酸的存在使得兩個(gè)小 亞基之間形成了穩(wěn)定的二硫鍵結(jié)構(gòu)，這就更好地解釋了馬鈴薯塊莖中的AGPase在 高溫下仍有很好穩(wěn)定性的原因。然而，玉米胚乳中的AGPase的大小亞基上均沒(méi)有 發(fā)現(xiàn)由半胱氨酸所形成的二硫鍵結(jié)構(gòu)。因此，對(duì)玉米胚乳AGPase的深入研究不但 有助于揭示單子葉植物與雙子葉植物在淀粉合成途徑中的異同點(diǎn)，而且有利于通過(guò) 轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)一步提高玉米中的淀粉含量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體及其編碼基因。 本發(fā)明所提供的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體，名稱為j^^w-J^H^，是如 下l)或2)的蛋白質(zhì)
1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
52)將序列表中序列l(wèi)的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺
失和/或添加且具有ADP-葡萄糖焦磷酸化酶活性的由l)衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中的序列1由475個(gè)氨基酸殘基組成，與野生型玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷 酸化酶(AGPase)相比，自氨基末端第458位由Gly突變?yōu)锳sp，自氨基末端第462位 由Thr突變?yōu)镮le，自氨基末端第323位由Ile突變?yōu)镸et，自氨基末端第449位由Met 突變?yōu)锳rg。
上述ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體^^尸a^-7i^-JJ的編碼基因也屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體^^sse-7^K^的編碼基因具體可為如下1)-4) 中任一所述的基因
1) 其核苷酸序列是序列表中的序列2;
2) 編碼序列表中的序列l(wèi)的氨基酸序列；
3) 在嚴(yán)格條件下可與序列表中序列2限定的DNA序列雜交且編碼上述ADP-葡萄 糖焦磷酸化酶突變體J6^ase-7^ -JJ的DNA分子；
4) 與l)的基因具有90%以上的同源性，且編碼上述ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突 變體^6^se-7W-M的DNA分子。
上述嚴(yán)格條件可為用O. 1XSSPE (或0. 1XSSC)， 0.1% SDS的溶液，在65 "C下雜交并洗膜。
序列表中的序列2由1428個(gè)堿基組成，其編碼序列為自其5'末端第1-1428 位堿基，編碼具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
含有上述ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體基因力6y^"-7^ -^ 的重組載體、轉(zhuǎn)基 因細(xì)胞系和重組菌，以及擴(kuò)增^^a"-720-< 堪因全長(zhǎng)或任一片段的引物對(duì)也屬于 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微 彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包 含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它的參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷 酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3，端轉(zhuǎn)錄的非翻 譯區(qū)等均具有類(lèi)似功能。
使用^7/^"-7^ -JJ構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子、根部 特異表達(dá)啟動(dòng)子等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用 本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng) 子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編 碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼 子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是人工合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自 轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
具體來(lái)講，用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可為pCAMBIA2301、 pBI121、 pCAMBIA1301或pCAMBIA1300等。
為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn) 行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因
(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡 那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物 的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
攜帶有本發(fā)明J6^aw-7^K^的植物表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、 植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)或農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化 玉米組織或細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)化的玉米組織或細(xì)胞培育成植株。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種在高溫環(huán)境下仍能夠提高植物種子中淀粉含 量的方法。
本發(fā)明所提供的在高溫環(huán)境下仍能夠提高植物種子中淀粉含量的方法，是將上述 ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體基因^ft^se-7^H^導(dǎo)入植物組織或細(xì)胞中，得到淀
粉含量提高的植物種子。
上述植物優(yōu)選為單子葉植物，如玉米。
所述ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體基因J6^ase-7iY -3J可通過(guò)含有所述ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體基因力6^a"-^^H^的植物表達(dá)載體導(dǎo)入玉米組織或細(xì) 胞。
經(jīng)檢測(cè)，本發(fā)明的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體J^ -JS經(jīng)高溫處理 后，在大腸桿菌中積累糖原的能力比野生型玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶顯著提 高；電鏡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體Z^^"-7^K^的大腸桿菌 中，糖原合成量顯著高于轉(zhuǎn)入野生型玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的大腸桿菌;動(dòng)力學(xué)及調(diào)控性質(zhì)分析結(jié)果表明，該突變體對(duì)底物(ATP和G-1-P)的親和力增強(qiáng)， 但對(duì)激活劑和抑制劑的敏感性與野生型玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶相同，該突 變體對(duì)底物親和力的增強(qiáng)是該突變體酶活提高及糖原積累能力提高的主要原因。由 于AGPase是細(xì)菌糖原和植物淀粉合成的關(guān)鍵酶，能夠催化1-磷酸葡萄糖 (1-P-Glucose)和腺苷三磷酸(ATP)生成腺苷二磷酸葡萄糖(ADPG)和焦磷酸(PPi)。 同時(shí)，ADPG作為淀粉合成的前體物質(zhì)在淀粉合成酶、淀粉分支酶和淀粉去分支酶等 的協(xié)同作用下合成直鏈淀粉和支鏈淀粉。所以，玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶活 性的高低決定了細(xì)菌中糖原和植物中淀粉含量的高低。本發(fā)明的玉米胚乳ADP-葡萄 糖焦磷酸化酶突變體將在玉米的品種改良中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。


圖1為玉米胚乳AGPase大小亞基基因的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果 圖2為玉米胚乳AGPase大小亞基基因原核表達(dá)載體pGEX-KG-Sh2-Bt2的結(jié)構(gòu) 示意圖
圖3為大腸桿菌突變菌株BL21-dglgC經(jīng)PCR反應(yīng)和碘染色鑒定的結(jié)果
圖4為玉米胚乳AGPase大小亞基經(jīng)隨機(jī)突變后的第一輪篩選結(jié)果
圖5為突變體10-3和10-3-53與對(duì)照菌的碘染色深淺比較結(jié)果
圖6為玉米胚乳AGPase大小亞基突變體基因的第三輪碘染色篩選結(jié)果
圖7為含有玉米胚乳AGPase大小亞基突變體基因的大腸桿菌與對(duì)照菌株在37
"C和44'C的碘染色篩選結(jié)果
圖8為轉(zhuǎn)入玉米胚乳AGPase大亞基基因和小亞基突變體基因的大腸桿菌的糖
原含量檢測(cè)結(jié)果
圖9為電鏡觀察轉(zhuǎn)基因大腸桿菌中的糖原積累情況
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。所用引物合成和測(cè)序工作 均由上海生工完成。
實(shí)施例1、玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體及其編碼基因的獲得 一、玉米胚乳AGPase大、小亞基cDNA的獲得 1、引物設(shè)計(jì)
根據(jù)玉米胚乳AGPase大亞基基因5"/ i7//^e"-2和小亞基基因5rj'"7e-2的cDNA 序列(GenBank號(hào)分別為:M8畫(huà)，AF334959)設(shè)計(jì)兩對(duì)RT-PCR引物(Sh和Bt)。同時(shí)為了便于載體構(gòu)建，在設(shè)計(jì)引物時(shí)針對(duì)以下2點(diǎn)做了特殊設(shè)計(jì)a.在 SAr朋Ae/2-2的5，端添加限制性內(nèi)切酶yWe I的識(shí)別位點(diǎn)，3'端添加限制性內(nèi)切 酶5i^ I和fee I的識(shí)別位點(diǎn)；b.因v5ri"2e-2的5'端ATG的位置存在一個(gè)限制 性內(nèi)切酶vVcoI識(shí)別位點(diǎn)，于是將5ri"7e-2自5'端第39位的A突變?yōu)镃，去掉 在該位點(diǎn)存在的第二個(gè)7fcoI識(shí)別位點(diǎn)，并在i^i"7e-2的3'端添加限制性內(nèi)切 酶fee I識(shí)別位點(diǎn)，擴(kuò)增玉米胚乳AGPase大亞基基因2 cDNA的引物對(duì) Sh為Sh2F: 5' -CCCATATGCAGTTTGCACTTGCATTGGACACG-3，和Sh2R: 5'-GAGAGCTCCCCGGGCTATATGACAGACCCATCGTTGATG-3，； 擴(kuò)增玉米胚乳AGPase小亞基5ri"7e-2 cDNA的引物對(duì)Bt為Bt2F:
和Bt2R: 5' -GAGCTCTCATATAACTGTTCCACTAGGGAGTAAAGC-3，。
2、 第一鏈cDNA的合成
用Trizol RNA提取試劑盒(購(gòu)自天為時(shí)代公司)并參照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取授 粉后18天玉米綜31禾屮子中(Xiaoping Chen, Zhangying Wang, Jianhua Wang,Maoyan Wang, Li Zhao, Guoying Wang. Isolation and characterization of 5W"/e2 promoter from Zea Mays and its comparison with Zel9 promoter in transgenic tobacco plants. Plant Cell Tiss Organ Cult(2007)88:l 1-20.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué))的總RNA，并以此為模板反轉(zhuǎn)錄 合成其第一鏈cDNA:取1 u L Oligo (dT) 18加到10 u L濃度為200ng/ y L的總RNA溶 液中，7(TC反應(yīng)5分鐘后置于冰上冷卻5分鐘，然后用Promega公司的AMV Reverse Transcriptase并參照說(shuō)明書(shū)加入以下成分5X反轉(zhuǎn)錄緩沖液(試劑盒自帶)5 u L， dNTPs (每種lOraM) 2. 5 u L， RNasin核糖核酸酶抑制劑(濃度為50U/ u L) 1 u L， AMV反轉(zhuǎn)錄酶(30U/ixL) 3uL，用DEPC處理水定容至25 u L。反應(yīng)條件為室溫 lOmin， 42°C 60min， 70°C lOmin，冰浴2min。
3、 PCR擴(kuò)增
以步驟2合成的第一鏈cDNA為模板，分別在引物對(duì)Sh和引物對(duì)Bt的引導(dǎo)下， PCR擴(kuò)增幼i7/7^e/7-2和5Wf"e-2的cDNA,反應(yīng)體系為10X緩沖液5uL， dNTPs(每種10mM) 1 u L，引物Sh2F(Bt2F)(濃度為10 u M) 1 u L，引物Sh2R(Bt2R) (濃度為10uM) ltiL， Ex-Taq (5U/yL， TaKaRa公司)1 u L，第一鏈cDNA (濃 度為10ng/uL) 5uL，用滅菌水定容至50ixL。 PCR反應(yīng)條件為先94°C 5min; 然后94。C lmin， 62°C 45s， 72°C 2min， 10個(gè)循環(huán)；再94°C lmin， 65°C 45s， 72°C 2min， 25個(gè)循環(huán)；最后72°C 10min， 4t:保存。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 進(jìn)行0. 7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。其中，M為1Kb的DNA分 子量標(biāo)準(zhǔn)。泳道Sh2為PCR擴(kuò)增的5i^w^e/7-么泳道Bt2為PCR擴(kuò)增的5ri"7e-么 經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出約1. 5 kbp的SAraMe/7-2cDNA片段和1. 4 kbp的2cDNA 片段，與預(yù)期結(jié)果相符?；厥詹⒓兓@兩個(gè)目的片段，將其分別克隆入載體pGEM⑧-T Easy (購(gòu)自Promega公司)中，對(duì)含有幼rw^e"-2的cDNA片段的克隆載體用限制 性內(nèi)切酶I和6k3 I進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)酶切獲得了 1. 5 kbp和3. 0 kbp的 DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符；對(duì)含有5n'"7e-2的cDNA片段的克隆載體用限制性 內(nèi)切酶fcoR I進(jìn)行單酶切鑒定，經(jīng)酶切獲得了 1.4 kbp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果 相符；再將上述克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，除了預(yù)期的^^'"7e-2自5' 端第39位的堿基A突變?yōu)镃外，其它序列均與GenBank上登錄的序列一致，表明 經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得序列正確的玉米胚乳AGPase大亞基基因6^^/ 7^/7-^和小亞基 基因^ri"7e-2的cDNA。
二、玉米胚乳AGPase大小亞基基因及其突變體在無(wú)glgC活性的大腸桿菌突變 菌株中的異源表達(dá)
1、原核表達(dá)載體pGEX-KG多克隆位點(diǎn)的改造
由于馬鈴薯塊莖AGPase大小亞基的N端和C端對(duì)該酶的調(diào)控性質(zhì)起到重要作 用，所以為使玉米胚乳AGPase大小亞基基因在利用載體pGEX-KG (購(gòu)自Invitrogen 公司，該載體的物理圖譜參見(jiàn)文獻(xiàn)，Guan KL, Dixon JE. Eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli: an improved thrombin cleavage and purification procedure of fUsion proteins with glutathione S-tmnsferase. Anal Biochem. 1991, 192(2):262-7)進(jìn)行原核表 達(dá)時(shí)不產(chǎn)生融合蛋白，現(xiàn)對(duì)該載體進(jìn)行改造，使載體上的GST蛋白既能提前終止表
達(dá)，不產(chǎn)生融合蛋白，又不影響目的蛋白的表達(dá)，設(shè)計(jì)的多克隆位點(diǎn)(MCS)如下 CTA GGA TCC TAA TAA CCG GGC AGG TCT AGA CCA TGG GAG CTC
SamHI stopcodon Xibal A/col Sacl
CAC CAC CAC CAC CAC CAC AAG CTT ACC His Tag H刷l
合成該多克隆位點(diǎn)片段，對(duì)其用限制性內(nèi)切酶"aMH和^i/2d m進(jìn)行雙酶切后， 與經(jīng)相同酶雙酶切的原核表達(dá)載體pGEX-KG用T4 DNA連接酶相連，連接體系及反 應(yīng)條件如下10X連接酶緩沖液2ul， pGEX-KG ^a/zfl I和歷V2d III雙酶切片段2ul， MCS feydl I和#i/2d III雙酶切片段10ul， T4 DNA連接酶(TaKaRa公司)lul，滅菌蒸餾水5ul， 16。C連接12-24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞在37'C下培養(yǎng)12-24小時(shí)，挑取在LB抗性平板(含 100mg/L氨芐青霉素)上長(zhǎng)出的單克隆，提質(zhì)粒，分別用限制性內(nèi)切酶I、 ^boR I、 J力oI和XteI進(jìn)行單酶切鑒定，結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符。再挑取其中一個(gè)單克隆 進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明新合成的多克隆位點(diǎn)片段替代了原載體中的多克隆位點(diǎn)， 將改造后的載體pGEX-KG命名為pGEX-KG1 。
2、 玉米胚乳AGPase大小亞基基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建
對(duì)步驟一擴(kuò)增的玉米胚乳AGPase大亞基基因5"力r朋Ae/2-2的cDNA用限制性內(nèi) 切酶I和5"ac I進(jìn)行雙酶切后，與經(jīng)相同酶雙酶切的載體pET30a(+)(購(gòu)自 Novagen公司)連接，得到含有幼/7/z^e/ -2 cDNA的重組載體，命名為pET30Sh2; 對(duì)步驟一擴(kuò)增的玉米胚乳AGPase小亞基基因5ri"幾-2的cDNA用限制性內(nèi)切酶 餘ol和5"acl進(jìn)行雙酶切后，與經(jīng)相同酶雙酶切的載體pET28a(+)(購(gòu)自Novagen 公司)，得到含有5rj'"Je-2cDNA的重組載體，命名為pET28Bt2;再以pET28Bt2 為模板，在引物SD: 5， -CGGAGCTCTTTAAGAAGGAGATATACC-3'禾B Bt2R的引導(dǎo)下，PCR 擴(kuò)增5n'"^-2的cDNA及其上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，擴(kuò)增結(jié)束后，回收約3.0kbp 的目的片段，將其用限制性內(nèi)切酶&cl進(jìn)行單酶切后，與經(jīng)相同酶酶切的重組載 體pET30Sh2連接，經(jīng)鑒定后，得到連接有玉米胚乳AGPase大小亞基基因及各自核 糖體結(jié)合位點(diǎn)的重組載體，命名為pET30Sh2-Bt2;最后用限制性內(nèi)切酶I和 &c I對(duì)pET30Sh2-Bt2進(jìn)行雙酶切，回收并純化約3. 0kbp的具有各自核糖體結(jié)合 位點(diǎn)的玉米胚乳AGPase大小亞基基因，將其命名為AGPase-Sh2-Bt2 。將 AGPase-Sh2-Bt2與經(jīng)相同酶雙酶切的載體pGEX-KG1連接，得到玉米胚乳AGPase 大小亞基基因的原核表達(dá)載體，命名為pGEX-KG-Sh2-Bt2，其結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖2。
3、 大腸桿菌W^7突變菌株BL21-dglgC的獲得
通過(guò)同源重組的方法，將適于原核表達(dá)的大腸桿菌BL21(DE3，購(gòu)自北京天為時(shí) 代公司)中的g^^C基因缺失突變，以便使玉米AGPase大小亞基在其中異源表達(dá)時(shí)， 消除該菌株本身產(chǎn)生的糖原所形成的背景色。
提取大腸桿菌BL21(DE3)的DNA并以其為模板，運(yùn)用cross-over PCR技術(shù)，用 弓I物No-SmaI(No-Smal:5 ， -TGTCCCGGGCGTTGTTGCTCTCCCAGGGT-3 ，)和Ni (Ni: 5, -CCCATCCACTAAACTTAAACACTTCTCTAAACTAACCATGA-3，)擴(kuò)增BL21 (DE3)的glgC 基因上游序列，用引物Ci (Ci:5， -TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGACGGAAGTTAGGGCATAAACAGG-3，)和Co-Sail (Co-Sail: 5， -GGCCGTCGACTGCACAGTAAACACCGACTT-3，) 擴(kuò)增glgC基因的下游序列。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行0.7y。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，瓊脂 糖凝膠回收試劑盒(購(gòu)自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司)分別回收目的片段， 即得到含有g(shù)lgC基因上游序列的DNA片段和含有g(shù)lgC基因下游序列的DNA片段。 將兩個(gè)DNA片段各取2uL混勻，并以此為模板，用No-Smal和Co-Sall為引物進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為先94。C 10rain;然后94°C 5min， 60°C 5min， 72 °C 10rain， 1個(gè)循環(huán)；再94°C lmin， 65°C 45s， 72°C lmin， 35個(gè)循環(huán)；最后72 °C 10min， 4"C保存。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行0. 7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。 PCR產(chǎn)物經(jīng)5)肪I和5"aZt雙酶切后，連到經(jīng)同樣酶切的pK0V載體(WU Wu-Wei, WANG Jing-Wen, XIE Fei， LONG Qing-Xin， WANG Xun-Zhang。 Baculovirus p74 Gene is a Species-specific Gene。 ACTA BIOCH蘭CA et BIOPHYSICA SINICA 2003， 35(9): 864-872。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué))上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21篩選無(wú)glgC活性 的大腸桿菌突變菌株。將篩選得到的無(wú)glgC活性的大腸桿菌突變菌株命名為 BL21-dglgC。大腸桿菌突變菌株BL21-dglgC經(jīng)PCR反應(yīng)和碘染色鑒定的結(jié)果如圖3 所示。圖3A為大腸桿菌突變菌株BL21-dglgC PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果， 其中M為1Kb的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1、3、4和6為未轉(zhuǎn)基因的大腸桿菌BL21 (DE3) PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，泳道2、 5和7為大腸桿菌突變菌株BL21-dglgC PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；圖3B為大腸桿菌突變菌株BL21-dglgC的碘染色 鑒定結(jié)果，其中mt2、 mt5和rat7為大腸桿菌突變菌株BL21-dglgC的碘染色鑒定結(jié) 果，wt為未轉(zhuǎn)基因的大腸桿菌BL21 (DE3)的碘染色鑒定結(jié)果。 4、玉米胚乳AGPase大小亞基的隨機(jī)突變
鹽酸羥胺突變劑0. 2084g鹽酸羥胺，1. 488mL ddH20， 1. 2mL 125mM焦磷酸鈉 (pH7.0) ， 0. 3mL 1M NaCl， 12W 500mM EDTA(pH 8.0)。
用限制性內(nèi)切酶M/e I和5ac I對(duì)pGEX-KG-Sh2-Bt2進(jìn)行雙酶切，回收并純化 約3. 0kbp的玉米胚乳AGPase大小亞基cDNA片段，然后取鹽酸羥胺突變劑1-3roL， 將純化的待突變的20-30 P g玉米胚乳AGPase大小亞基cDNA片段加到lmL突變劑 溶液中，75。C溫浴條件下進(jìn)行隨機(jī)突變，分別于IO、 20、 30、 45、 50、 55、 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95、 100、 105、 110、 115、 120、 130分鐘時(shí)各取出50ul， 立即放置冰上，待樣品取完后，統(tǒng)一回收DNA片斷，然后將隨機(jī)突變片段連接入原 核表達(dá)載體pGEX-KG1中，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌^ 《C突變菌株BL21-dglgC。挑取上述轉(zhuǎn)入玉米胚乳AGPase大小亞基突變體基因菌株的單菌落，接種于2mL LB液體培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)12-24小時(shí)。然后于Conberg加富培養(yǎng)基(磷酸二 氫鉀8.5g，磷酸氫二鉀llg，酵母提取物6g，葡萄糖10g，瓊脂15g，用水定容 至1L，最終pH7)上進(jìn)行劃線，37。C培養(yǎng)12-24小時(shí)，用碘-碘化鉀(12-KI)溶液 (0. lmol/L碘和0.3mol/L碘化鉀)進(jìn)行染色，根據(jù)染色結(jié)果篩選突變菌株。
進(jìn)行第一輪篩選時(shí)，大部分突變菌株經(jīng)碘染色后呈淺黃色； 一部分突變菌株經(jīng) 染色后的顏色與轉(zhuǎn)化有野生型玉米胚乳AGPase大小亞基的大腸桿菌g7^C突變菌株 (對(duì)照)相似，呈棕色，只有少量的突變菌株經(jīng)染色后變成深棕色。此輪篩選共挑 選出大約12000個(gè)單克隆，接種于96孔板中，37'C下振蕩培養(yǎng)12-24小時(shí)，然后 劃線于Conberg加富培養(yǎng)基上，再37'C培養(yǎng)12-24小時(shí)，用碘染色法進(jìn)行篩選，經(jīng) 3輪篩選后，獲得了 2個(gè)碘染色顏色比對(duì)照深的突變菌株，分別命名為8-2和10-3。 第一輪篩選的最后結(jié)果如圖4所示，其中CK為未轉(zhuǎn)入外源基因的大腸桿菌。
提取篩選到的2個(gè)突變菌株的質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明10-3和8-2均 是野生型玉米胚乳AGPase小亞基基因5r""e-2的自5'端第1345-1347位由編碼 Met的堿基突變?yōu)榫幋aArg的堿基。
再以突變菌株10-3為原始材料，用與上述相同的方法進(jìn)行第二次隨機(jī)突變， 以獲得活性更高的突變菌株。結(jié)果共獲得了 4個(gè)較好的突變菌株，分別命名為 10-3-14、 10-3-24、 10-3-33和10-3-53。經(jīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，突變菌株10-3-53重復(fù)性 較好，其中，突變菌株10-3-53與突變菌株10-3及對(duì)照菌株(CK)的碘染色情況 如圖5所示，圖5中10-3表示突變菌株10-3的染色情況，53表示突變菌株10-3-53 的染色情況，CK表示對(duì)照菌株的染色情況。
提取突變菌株10-3-53的質(zhì)粒，測(cè)序，結(jié)果該突變株中的玉米胚乳AGPase小 亞基突變體基因是在突變菌株10-3的玉米胚乳AGPase小亞基基因的基礎(chǔ)上突變 的，與野生型玉米胚乳AGPase小亞基基因相比，自5'末端第967-969位堿基編碼 突變氨基酸殘基Met，自5'末端第1345-1347位堿基編碼突變氨基酸殘基Arg。突 變菌株10-3-53中所含的玉米胚乳AGPase小亞基基因(名稱為^ft^se-M-J-5J) 的核苷酸序列是序列表中的序列3。
再以突變菌株10-3-53為原始材料，用與上述相同的方法進(jìn)行第三次隨機(jī)突變， 以獲得活性更高的突變菌株。結(jié)果共獲得了 4個(gè)碘染色顏色比對(duì)照深的突變菌株， 分別命名為120、 60、 30和7，第三輪篩選的結(jié)果如圖6所示。以突變菌株120和30為原始材料，用與上述相同的方法進(jìn)行第四次隨機(jī)突變， 突變溫度變?yōu)?4°C，以獲得耐高溫且酶活性高的突變菌株。結(jié)果僅獲得了 2個(gè)較好 的突變菌株，分別命名為120-33和30-18。經(jīng)三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，突變菌株120-33重 復(fù)性較好。具體的染色情況如圖7所示。其中，4為突變菌株10-3-53， 5為突變菌 株120-33， 6為突變菌株30-7， 7為突變菌株30-17， 8為突變菌株30-18。
提取突變菌株120-33的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該突變菌株120-33的玉米 胚乳AGPase小亞基的編碼基因是在突變菌株10-3-53的玉米胚乳AGPase小亞基編 碼基因的基礎(chǔ)上突變的，與突變菌株10-3-53相比，自5，末端第1372-1374位堿 基編碼突變氨基酸殘基Asp，自5，端第1384-1386位堿基編碼突變氨基酸殘基Ile。 突變菌株120-33中所含有的玉米胚乳AGPase小亞基基因(名稱為l尸ase-7，-") 的核苷酸序列是序列表中的序列2，由1428個(gè)堿基組成，編碼序列表中序列l(wèi)所示 的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，將該蛋白命名為AGPase-120-33。 ^Pase-7W-^是 將上述玉米胚乳AGPase小亞基基因突變體基因^ 尸ase-^ -J-5^自5，端第 1372-1374位由編碼Gly的堿基突變?yōu)榫幋aAsp的堿基，自5'端第1384-1386位 由編碼Thr的堿基突變?yōu)榫幋alie的堿基，自序列2的5'末端第1-1428位為 JMase-7^K J的編碼基因。
實(shí)施例2、轉(zhuǎn)基因大腸桿菌中玉米胚乳AGPase突變體糖原含量測(cè)定
1、 玉米胚乳AGPase突變體載體的構(gòu)建
分別人工合成玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體基因Jft^se-7^K 3和 ^"尸^e-M-3-5^的小亞基基因價(jià)么在其5，端分別引入tVco I酶切位點(diǎn)，在其3， 端引入5"ac I酶切位點(diǎn)。將合成的玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體基因 //CMe-7^K J和力"戶ase-M-J-M的小亞基基因5C分別用Wcol禾Q &c I進(jìn)行雙 酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并回收目的條帶。將實(shí)施例l構(gòu)建的載體 pGEX-KG-Sh2-Bt2同時(shí)用7Vco I和&c I進(jìn)行雙酶切，將去除小亞基基因價(jià)i"后的 6.5Kb的大片段切膠回收。然后用T4 DNA連接酶(大片段liU，小亞基基因片段 1， T4 DNA ligase 1 u 1， ddH20 1 u 1， 16°C 12小時(shí))將大小兩個(gè)片段進(jìn)行連接， 構(gòu)建玉米胚乳AGPase大小亞基突變體l/^se-M和^6^se-^-^-M的載體。
2、 玉米胚乳AGPase突變體糖原含量測(cè)定
將實(shí)例1中構(gòu)建的野生型玉米胚乳AGPase大小亞基基因載體和上述步驟1構(gòu) 建的玉米胚乳AGPase大小亞基突變體Z6^se-J^K^和^f尸ase-"-J-^的載體轉(zhuǎn)化實(shí)施例1獲得的大腸桿菌W^:突變菌株BL21-dglgC。分別挑取上述轉(zhuǎn)入野生型 玉米胚乳AGPase大小亞基基因的大腸桿菌g^^突變菌株pGEX-SB、轉(zhuǎn)入玉米胚乳 AGPase大小亞基突變體基因l/^e-7iYK^的大腸桿菌^/^7突變菌株120-33和轉(zhuǎn) 入玉米胚乳AGPase大小亞基突變體基因^CPase-^^-J-的大腸桿菌g7《C突變菌 株10-3-53的單菌落，接種于Conberg加富液體培養(yǎng)基(含100嗎/mL的氨芐青霉 素)中，44。C培養(yǎng)12-24小時(shí)，然后12000rpm離心10min，收集菌體，稱重后用蒸 餾水重懸菌體，再在IO(TC下培養(yǎng)15min，然后加入DMSO和鹽酸，60。C培養(yǎng)30min， 用0.5M NaOH溶液調(diào)培養(yǎng)液pH值至4.5，加3-5U的淀粉糖苷酶，在醋酸鈉(含有 50mM醋酸納，pH5.2)培養(yǎng)緩沖液中，55。C反應(yīng)40min降解糖原，然后按葡萄糖的 測(cè)定方法測(cè)定由糖原降解產(chǎn)生的葡萄糖含量加10" 1培養(yǎng)物于250ul糖反應(yīng)緩沖 液(100mM p朋.9 Imidazao-HCl， 5raM MgCl2， 2mM NAD， lmM ATP)中，加入1-2W (1-2)Li/W) 6-磷酸葡萄糖脫氫酶，室溫反應(yīng)10min，在340nm波長(zhǎng)測(cè)吸光值，加入 l-2W己糖激酶(Hexokinase， HK)，測(cè)葡萄糖含量。
實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，糖原含量的具體測(cè)定結(jié)果如圖8所示。其中，突變株10-3-53 的糖原含量為0.5um/L，突變株120-33的糖原含量為1.58um/L。這個(gè)結(jié)果與實(shí) 施例1的碘染色結(jié)果基本一致，即碘染色淺的菌株其糖原含量低，而碘染色深的菌 株其糖原含量相對(duì)較高。上述檢測(cè)結(jié)果表明，與野生型玉米胚乳AGPase相比，高 溫環(huán)境下本發(fā)明的玉米胚乳AGPase突變體的活性得到了提高，而且其在大腸桿菌 中積累糖原的能力也得到了相應(yīng)的提高。
3、電鏡觀察轉(zhuǎn)基因大腸桿菌中糖原積累量
挑取轉(zhuǎn)入野生型玉米胚乳AGPase大小亞基基因的大腸桿菌^7^7突變菌株 pGEX-SB、轉(zhuǎn)入玉米胚乳AGPase大小亞基突變體基因J6Fase-J^ -3J的大腸桿菌 W^C突變菌株120-33和轉(zhuǎn)入玉米胚乳AGPase大小亞基突變體基因v^尸sse-3-5^ 的大腸桿菌W^7突變菌株10-3-53的單菌落，分別在44i:往復(fù)振蕩搖床中培養(yǎng)至 穩(wěn)定期。用含有4%戊二醛的0. 1M 二甲砷酸鹽緩沖液(PH 7. 3)在4。C下預(yù)固定2 小時(shí)，隨后用含有0.25M蔗糖的0. 1M二甲砷酸鹽緩沖液洗滌兩次。再用含有1%鋨 酸的磷酸鹽緩沖液(PH 7.3)在4"C下固定2.5小時(shí)，隨后用巴比妥(PH 7.4)洗 兩次。將菌體包埋在Epon-812中，進(jìn)行超薄切片后將切片放于鎳載網(wǎng)上。為了提 高嗜碘的多聚糖細(xì)菌顯色效果，將切片在室溫下用1%高碘酸鈉處理30分鐘，然后 用亞氯酸鈉處理IO分鐘，再用超純水洗滌三次。最后用乙酸雙氧鈾和擰檬酸鉛分別后著色30分鐘和15分鐘。電鏡下觀察染色結(jié)果如圖9所示。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)高 溫染色處理后，突變株120-33在高溫處理后糖原積累明顯，仍然能夠積累很多糖 原，而突變株10-3-53和pGEX-SB則在高溫下糖原積累量明顯減少，說(shuō)明高溫能夠 抑制突變株10-3-53和pGEX-SB中ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的酶活，而對(duì)突變株 120-33的影響卻很小，高溫對(duì)突變株120-33的酶活影響較小。序列表
<160〉 3
<210> 1
〈211〉 475
<212〉 PRT
<213> 玉米屬玉米(ZeamapL.)
〈400〉 1
Met Asp Met Ala Leu Ala Ser Lys Ala Ser Pro Pro Pro Trp Asn Ala
15 10 15
Thr Ala Ala Glu Gin Leu lie Pro Lys Arg Asp Lys Ala Ala Ala Asn
20 25 30
Asp Ser Thr Tyr Leu Asn Pro Gin Ala His Asp Ser Val Leu Gly lie
35 40 45
lie Leu Gly Gly Gly Ala Gly Thr Arg Leu Tyr Pro Leu Thr Lys Lys
50 55 60
Arg Ala Lys Pro Ala Val Pro Leu Gly Ala Asn Tyr Arg Leu lie Asp 65 70 75 80
lie Pro Val Ser Asn Cys Leu Asn Ser Asn lie Ser Lys lie Tyr Val
85 90 95
Leu Thr Gin Phe Asn Ser Ala Ser Leu Asn Arg His Leu Ser Arg Ala
100 105 110
Tyr Gly Ser Asn lie Gly Gly Tyr Lys Asn Glu Gly Phe Val Glu Val
115 120 125
Leu Ala Ala Gin Gin Ser Pro Asp Asn Pro Asn Trp Phe Gin Gly Thr
130 135 140
Ala Asp Ala Val Arg Gin Tyr Leu Trp Leu Phe Glu Glu His Asn Val 145 150 155 160Met Glu Phe Leu lie Leu Ala Gly Asp His Leu Tyr 165
Gin Ala His
Glu Lys Ala Ala
Phe
lie 180 Pro
Gly Arg
His 170
Thr Asn Ala
Met
Leu 195
Asp Glu Glu
Lys lie 210
Gly Glu Gin Leu Lys 225
Asp Asp Val Arg
Asp Gly
Glu
Lys 200 lie
Glu 185
Arg Ala Thr Ala
Arg Asp
Met
Asp 175 Thr
Arg 215
Met Met Val Asp
Ala 230
Lys Glu Met Pro
lie Glu Phe Ala 220
Thr lie Leu Gly
Ala 245
Lys Asp Val Met
Thr 235
lie Ala Ser Met
Tyr Val Phe Ser 260
Asn Asp Phe Gly
Tyr 250
Gin Leu Leu Arg
Pro Glu Ala 275
Lys Arg Val Gin
Leu 265
Glu Val lie Pro
Gly 255 Gin
lie Gly 290
lie Gly Thr lie Ala 305
Lys Pro Met Pro
Ser 280
Tyr Leu Tyr Asp
Ala 295
Phe Tyr Asn Ala
Ala 310
Phe Ser Phe Tyr
Gly 300 Leu
Gly 285 Tyr
Gly
Thr Gin Pro Arg 340 Val
Asp 325
His Leu Pro Pro
Asn 315
Arg Phe Ala Pro
Asp 330
Lys Val Leu Asp
lie
Thr Asp Ser 355
Asn His Ser Val Val 370
lie Glu Asp Ser Leu 385
Gly
Gly
Leu 390
Glu
Leu 375 Met
Gly 360 Arg
Ser 345
Cys Val lie Lys
Ser Cys lie
Cys Gly Ala Asp
Tyr 395
Ser 380
Tyr Glu Thr Glu
Tyr Val
lie 190
Gly Leu Met
Phe 205
Glu Lys Pro Lys
Leu 240 lie
Phe
Glu 270
Ala Thr Ser Trp Glu Asp lie
Thr
lie 335 Asp
Lys 320 Tyr
Val
Ala 350
Cys Lys lie
Asn 365
Glu Gly Ala lie
Ala 400Asp Lys Lys Leu Leu Ala Glu Lys Gly Gly lie Pro lie Gly lie Gly
405 410 415
Lys Asn Ser Cys lie Arg Arg Ala lie lie Asp Lys Asn Ala Arg lie
420 425 430
Gly Asp Asn Val Lys lie Leu Asn Ala Asp Asn Val Gin Glu Ala Ala
435 440 445
Arg Glu Thr Asp Gly Tyr Phe lie Lys Asp Gly lie Val lie Val lie
450 455 460
Lys Asp Ala Leu Leu Pro Ser Gly Thr Val lie
〈210〉 2 〈211〉 1428 〈212〉 DNA
<213〉 玉米屬玉米(Zeamaj^L.) <400> 2
atggacatgg ctttggcgtc taaagcctcc cctccgccct ggaatgccac cgccgccgag 60
cagctaattc caaagcgtga caaagccgct gcaaatgatt caacatacct caatcctcaa 120
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ttgacaaaga agcgtgccaa gcctgcagtg ccattgggtg ccaactatag actgattgat 240
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aactctgctt ccctcaaccg tcacctctca agagcctacg ggagcaacat tggagggtac 360
aagaatgaag ggtttgttga agtcttagct gcacagcaga gcccagataa tccaaactgg 420
tttcagggta ctgcagatgc tgtaaggcag tacttgtggt tgtttgagga gcataatgtg 480
atggaatttc taattcttgc tggcgatcac ctgtaccgga tggactatga aaagttcatt 540
caggcacaca gagaaacaaa tgctgatatt accgttgctg ccctaccgat ggatgagaaa 600
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〈210〉 3
<211> 1428
<212〉 廳
<213〉 玉米屬玉米(ZeawapL.)
〈400〉 3
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權(quán)利要求
1、一種蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有ADP-葡萄糖焦磷酸化酶活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2、 權(quán)利要求l所述蛋白的編碼基因。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦耹) -4)中任一所述的基因1) 其核苷酸序列是序列表中的序列2;2) 編碼序列表中的序列l(wèi)的氨基酸序列；3) 在嚴(yán)格條件下可與序列表中序歹U2限定的DNA序列雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋 白的DNA分子；4) 與l)的基因具有90%以上的同源性，且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子。
4、 含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和重組菌。
5、 擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因的全長(zhǎng)或任一片段的引物對(duì)。
6、 一種提高植物種子中淀粉含量的方法，是將權(quán)利要求2或3所述的編碼基因 轉(zhuǎn)入植物中，得到淀粉含量提高的植物種子。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述權(quán)利要求2或3所述的編碼 基因通過(guò)含有所述權(quán)利要求2或3所述編碼基因的植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物中。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述植物為單子葉植物，優(yōu) 選為玉米。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體及其編碼基因與應(yīng)用。該蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有ADP-葡萄糖焦磷酸化酶活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突變體及其編碼基因?qū)⒃谟衩椎钠贩N改良中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101580822SQ20081010647
公開(kāi)日2009年11月18日 申請(qǐng)日期2008年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月14日
發(fā)明者衡 林, 王國(guó)英, 王建華 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)