專利名稱：肝臟x受體激動(dòng)劑的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肝臟X受體(Liver X receptor, LXR)激動(dòng)劑(agonist)
的篩選方法，以及利用此方法篩選得肝臟X受體的激動(dòng)劑。
背景技術(shù)：
核受體(nuclear receptor ， NR )為具有誘發(fā)轉(zhuǎn)錄活性的超級(jí)家族 (superfamily )，肝臟X受體(Liver X receptor, LXR)屬于核受體的成員之 一，其含量以肝臟與脂肪組織(adipose tissue)為最多，LXRs在人體內(nèi)負(fù)責(zé) 調(diào)控膽固醇(cholesterol )、脂肪酸(fatty acid)和葡萄糖(glucose)的代謝與 平衡，且其為代謝脂質(zhì)和脂蛋白質(zhì)的重要調(diào)控因子。在哺乳動(dòng)物中存在有兩種 結(jié)構(gòu)相近^f旦表達(dá)形式不同的LXRs:肝臟X受體alpha (liver X receptor alpha, LXR-a)以及肝臟X受體beta (liver X receptor beta, LXR-卩)(Willy, P, J" Umesono, K.， Ong, E. S.， Evans, R. M., Heyman, R. A., and Mangelsdorf, D. J. 1995. LXR, a nuclear receptor that defines a distinct retinoid response pathway. Genes Dev. 9 (9) :1033-45.)，其中，LXR-a主要分部于肝臟和代謝旺盛的組 織如腎臟、小腸、脂肪組織和巨噬細(xì)胞等少數(shù)器官組織，而LXR-P則普遍存 在于各組織。
典型的核受體作用方式是當(dāng)專一性小分子配體(ligand)與核受體結(jié)合后， 改變核受體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使其能與靶基因啟動(dòng)子的特定序列結(jié)合，從而促進(jìn)該 基因表達(dá)，此傳訊過程稱為活化；而活化LXR以調(diào)控脂肪代謝過程為L(zhǎng)XR受 體先與另 一種受體類維生素AX受體RXR ( retinoic X receptor, RXR)形成異 質(zhì)雙體(dimer)后，再通過前述膽固醇前驅(qū)物的活化，而進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，并 結(jié)合至靶基因的啟動(dòng)子上具有特殊辨識(shí)序列的LXR反應(yīng)區(qū)(LXR response element, LXRE),進(jìn)而調(diào)控脂肪和膽固醇新陳代謝，降低血管中的膽固醇沉 淀；此外，LXR所活化的基因產(chǎn)物，已知在巨噬細(xì)胞及其他周邊組織可以造 成月旦固醇的回流運(yùn)輸(reverse cholesterol transport )，而^f吏過量的膽固醇得以形成高密度脂蛋白(HDL) (Steffensen, K.R. and Gustafsson,丄A. 2004 .Putative metabolic effects of the liver X receptor (LXR). Diabetes. 53 Suppl 1 :S36-42.)， 高密度脂蛋白具有抗炎、抗氧化、抗血栓形成和NO誘導(dǎo)的多種特性，也可有 效降低心血管疾病及動(dòng)脈粥狀硬化的發(fā)生率。
LXR激動(dòng)劑(agonist)是一種可以和LXR結(jié)合，且啟動(dòng)LXR功能并增 加LXR訊息靶基因表達(dá)的物質(zhì)，例如膽固醇前驅(qū)物(oxysterol)是活化LXR 的天然激動(dòng)劑，其包含22-羥基膽固醇(22 (R)勿droxycholesterol )、 24-羥 基膽固醇(24 ( S ) -hydroxycholestero X 27-羥基膽固醇(27-hydroxycholesterol), 以及膽固醇酸(cholestenoic acid )等氧化態(tài)的膽固醇4汙生物；人工合成的 T0901317是強(qiáng)效的LXR激動(dòng)劑，其化學(xué)全名為N-(2,2,2-三氟乙基)-N-[4 -[2,2，2_三氟-1-羥基三氟曱基)乙基]苯基]-苯磺酰胺 (N-(2,2，2-trifluoroethyl)-N-[4 - [2，2,2-trifluoro-l-hydroxy-l畫(trifluoromethyl) ethyl]phenyl]-benzenesulfonamide )。
相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)LXR的激動(dòng)劑的使用除有助于治療動(dòng)脈硬化 (atherosclerosis)及心血管疾病夕卜(cardiovascular disease), 其也具有抗發(fā)炎 效果，且對(duì)于糖尿病(diabetes ) ( Proctor, G., Jiang, T., Iwahashi， M.， Wang, Z., Li, J. and Levi, M. 2006. Regulation of renal fatty acid and cholesterol metabolism, inflammation, and fibrosis in Akita and OVE26 mice with type 1 diabetes. Diabetes. 55( 9 ):2502-9.)和阿茲海默癥(Alzheimer's disease ) ( Koldamova, R. P.， Lefterov, I. M.， Staufenbiel, M., Wolfe, D., Huang, S., Glorioso, J. C., Walter, M., Roth， M. G. and Lazo, J. S. 2005 .The liver X receptor ligand T0901317 decreases amyloid beta production in vitro and in a mouse model of Alzheimer's disease. J Biol Chem.ll, 280 ( 6 ) :4079-88.),甚至癌癥治療(Fukuchi, J.， Kokontis, J. M., Hiipakka, R.A., Chuu， C.R and Liao, S. 2004. Antiproliferative effect of liver X receptor agonists on LNCaP human prostate cancer cells. Cancer Res. Nov 1， 64 ( 21 ) :7686-9.)也 具有功效。因此，若能建立一種可篩選出活化LXR的激動(dòng)劑的方法，將有助 于動(dòng)脈粥狀硬化、心血管疾病與阿茲海默癥的治療以及糖尿病的預(yù)防，并可應(yīng) 用于抗發(fā)炎上。 發(fā)明內(nèi)容為可快速有效地找出能活化LXR的激動(dòng)劑，本發(fā)明提供一種LXR激動(dòng)劑 的篩選方法，并通過該篩選方法評(píng)估升麻(W/w'zcwM C/m/ci^^ e )中草藥是否 可有效活化LXR的表達(dá)，以篩選出具有LXR活化功用的激動(dòng)劑，進(jìn)而達(dá)到預(yù) 防或治療動(dòng)脈粥狀^^更化與心血管疾病等目的。
篩選方法構(gòu)建部份，是將可同時(shí)表達(dá)肝臟X受體alpha配體的結(jié)合區(qū)域 (LXR-a ligand binding domain, LXR-a LBD )與GAL-4脫氧核糖核酸結(jié)合 區(qū)(GAL-4 DNA binding domain, GAL-4 BD )的融合蛋白質(zhì)(fosion protein )， 以及可受GAL-4上〉游啟動(dòng)序歹'J (GAL-4 upstream activation sequence, GAL-4 UAS)調(diào)控的報(bào)告基因例如分泌型堿性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase, SEAP )構(gòu)建形成a-SEAP表達(dá)質(zhì)粒;f^并將該a-SEAP表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(transfect) 至宿主細(xì)胞例如中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary cell, CHO-kl )中， 進(jìn)行LXR激動(dòng)劑的篩選時(shí)，將待測(cè)樣品加入宿主細(xì)胞培養(yǎng)基，接著檢測(cè)培養(yǎng) 基中報(bào)告基因的表達(dá)量，對(duì)比加入待測(cè)樣品時(shí)的報(bào)告基因的表達(dá)量與未加入待 測(cè)樣品時(shí)的報(bào)告基因的表達(dá)量，當(dāng)待測(cè)樣品的報(bào)告基因的表達(dá)量高于未加入待 測(cè)樣品的報(bào)告基因的表達(dá)量時(shí)，則表示待測(cè)樣品為L(zhǎng)XR的激動(dòng)劑。
進(jìn)而利用本發(fā)明構(gòu)建的篩選方法檢測(cè)升麻是否為L(zhǎng)XR的激動(dòng)劑，其中， 升麻是毛t科升麻屬(cimicifugeae)植物，其主要用藥部位為地下根莖，古 醫(yī)書記載升麻具有清熱解毒、鎮(zhèn)痛、抗浮腫、鎮(zhèn)靜與透斑滲等效用，主治風(fēng)熱 頭疼、牙痛、咽喉腫痛及子宮脫垂等病癥。4企測(cè)時(shí)，首先將欲用作篩選測(cè)試樣 品的升麻生藥材的干燥根皮或莖以及商品化的升麻科學(xué)中藥，分別以水與有機(jī) 溶劑進(jìn)行萃取，由此取得含有生物活性成分的升麻生藥材與升麻科學(xué)中藥的水 萃取物或有機(jī)溶劑萃取物。其中，有機(jī)溶劑可包括醇類(例如甲醇、乙醇或丙 醇)、酯類(例如乙酸乙酯)、烷類(例如己烷)或鹵烷(氯甲烷、氯乙烷)， 但并不以此為限，其中較佳者為醇類，更佳為70%乙醇。
接著在篩選方法中的該宿主細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，加入前述制備好的升麻生藥材以 及升麻科學(xué)中藥的水萃取物與有機(jī)溶劑萃取物。當(dāng)待測(cè)樣品中含有可與肝臟X 受體配體的結(jié)合區(qū)域相結(jié)合的配體時(shí)，便會(huì)驅(qū)動(dòng)分泌型堿性磷酸酶報(bào)告基因的
表達(dá)，因此通過分析分泌型堿性磷酸酶的活性表達(dá)量，即可評(píng)估升麻生藥材以 及升麻科學(xué)中藥是否能有效活化LXR，進(jìn)而得知升麻生藥材以及升麻科學(xué)中藥是否為L(zhǎng)XR的激動(dòng)劑。
通過前述以轉(zhuǎn)染有a-SEAP表達(dá)質(zhì)粒的中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO-kl)的 篩選平臺(tái)，可快速且有效地評(píng)估各種待測(cè)樣品是否具有活化LXR-a的功效， 且由實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)升麻生藥材以及升麻科學(xué)中藥的水萃取物與有機(jī)溶劑萃 取物皆可有效活化LXR-a,因此升麻生藥材以及升麻科學(xué)中藥是LXR-a的激 動(dòng)劑，并可用以促使LXR-a驅(qū)動(dòng)其下游基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控脂肪和膽固醇 新陳代謝，達(dá)到預(yù)防及治療動(dòng)脈粥狀硬化與心血管疾病的目的，且也可應(yīng)用于 阿茲海默癥的治療、糖尿病的預(yù)防以及抗發(fā)炎方面。
以下將配合附圖進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)施方式，下述所列舉的實(shí)施例是用 以闡明本發(fā)明，并非用以限定本發(fā)明的范圍，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員，在不脫離 本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，可做些許更動(dòng)與潤(rùn)飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)以在 后的權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例a-SEAP表達(dá)質(zhì)粒的示意圖。
圖2是本發(fā)明實(shí)施例用LXR激動(dòng)劑篩選方法^r測(cè)升麻科學(xué)中藥的水與 70%乙醇粗萃取物的分泌型堿性磷酸酶的活性倍率結(jié)果。
圖3是本發(fā)明實(shí)施例利用LXR激動(dòng)劑篩選方法檢測(cè)升麻生藥材的水與 700/。乙醇粗萃取物的分泌型堿性磷酸酶的活性倍率結(jié)果。
圖4是本發(fā)明實(shí)施例升麻科學(xué)中藥水粗萃取物經(jīng)Sephadex LH-20管柱進(jìn) 行膠體過濾層析所得180管分液于254 nm吸收光波長(zhǎng)下的分布圖。圖中數(shù)字 1 14是依據(jù)主要吸收峰與吸收光波長(zhǎng)由180管分液再分成14管分液的管數(shù)， 數(shù)字下方的橫線為各14管分液的包含范圍。
圖5是本發(fā)明實(shí)施例升麻科學(xué)中藥水粗萃取物經(jīng)Sephadex LH-20分離純 化所得180管分液再分為14管分液后，以LXR激動(dòng)劑篩選方法檢測(cè)14管分 液的分泌型堿性磷酸酶的活性倍率結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
制備轉(zhuǎn)染有能篩選LXR激動(dòng)劑的a-SEAP表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞抹，并在培養(yǎng) 該細(xì)胞抹時(shí)，分別在其培養(yǎng)液中加入空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組 T0901317以及待測(cè)樣品，當(dāng)待測(cè)樣品為L(zhǎng)XR的激動(dòng)劑時(shí)，便會(huì)驅(qū)動(dòng)a- 8表達(dá)質(zhì)粒上報(bào)告基因的表達(dá)。其中，本發(fā)明實(shí)施例所測(cè)試的樣品是升麻
(c/m/cz/z《a racemoM )生藥材與升麻科學(xué)中藥的水萃耳又物與有機(jī)溶劑萃耳又物， 其是將升麻生藥材以及升麻科學(xué)中藥，利用公知萃取方式，以水或有機(jī)溶劑進(jìn) 行萃取，由此取得升麻生藥材以及升麻科學(xué)中藥的水萃取物或有機(jī)溶劑萃取 物。萃取時(shí)所用有機(jī)溶劑可包括醇類(例如曱醇、乙醇或丙醇)、酯類(例如 乙酸乙酯)、烷類(例如己烷)或卣烷(例如氯甲烷、氯乙烷)，但并不以此為 限。其中較佳者為醇類，更佳者為乙醇。而由本發(fā)明下述具體實(shí)施例中報(bào)告基 因增加的表達(dá)量，證實(shí)升麻生藥材以及升麻科學(xué)中藥的水萃取物與有機(jī)溶劑萃 取物皆能有效活化LXR，且由陽性對(duì)照組T0901317活化LXR的程度，也可 知本發(fā)明所構(gòu)建的a-SEAP表達(dá)質(zhì)粒篩選平臺(tái)，確實(shí)可有效且準(zhǔn)確評(píng)估出能有 效活化LXR的激動(dòng)劑，這對(duì)于快速篩選可活化LXR的激動(dòng)劑將有莫大幫助。 現(xiàn)對(duì)前述測(cè)試方法詳盡說明如下 實(shí)施例1:
構(gòu)筑a-SEAP表達(dá)質(zhì)粒
為能快速篩選得可活化LXR的激動(dòng)劑，本發(fā)明實(shí)施例是構(gòu)建一種可篩選 LXR激動(dòng)劑的a-SEAP表達(dá)質(zhì)粒，該表達(dá)質(zhì)粒包含可同時(shí)表達(dá)肝臟X受體alpha 配體的結(jié)合區(qū)域(LXR-aLBD)與GAL-4脫氧核糖核酸結(jié)合區(qū)(GAL-4 BD ) 的融合蛋白質(zhì)(flision protein),以及受GAL-4上游啟動(dòng)序列(GAL-4 UAS ) 調(diào)控的分泌型堿性磷酸酶(SEAP )。
其中，分泌型堿性磷酸酶(SEAP)是由人類胎盤堿性磷酸酶(placental alkaline phosphatase, PLAP)經(jīng)修飾而得，SEAP報(bào)告基因的最大優(yōu)點(diǎn)為可分 泌至細(xì)胞外例如細(xì)胞培養(yǎng)基中，因此，可以直接取部份細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行非破壞 性的酶活性分析，且分析完畢還可再做其他研究用途。
GAL4為酵母菌的轉(zhuǎn)錄活化子(transcriptional activator )，其可凈爭(zhēng)錄啟動(dòng)半 乳糖苷酶基因gall,以活化半乳糖的新陳代謝。GAL4是由功能相對(duì)獨(dú)立的且 在結(jié)構(gòu)上可以分開的位于N端的GAL-4脫氧核糖核酸結(jié)合區(qū)(GAL-4 BD) 以及位于C端的GAL-4轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域(GAL-4 activation domain GAL-4 AD ) 共同構(gòu)成。其中GAL-4脫氧核糖核酸結(jié)合區(qū)(GAL-4 BD)可識(shí)別位于GAL4 效應(yīng)基因的GAL-4上游啟動(dòng)序列(GAL-4 UAS )，并可與之結(jié)合；而GAL-4轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域(GAL-4 AD )則可與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中其他成分結(jié)合，啟動(dòng)GAL-4 上游啟動(dòng)序列的下游基因的轉(zhuǎn)錄。
構(gòu)建a-SEAP表達(dá)質(zhì)粒詠是以人類肝臟數(shù)據(jù)庫(human liver cDNA library ) 為模板(template),同時(shí)利用引物L(fēng)XR-a-LBD-2-F ( SEQ ID NO: 1)與 LXR-a-LBD-l-R ( SEQ ID NO: 2 )進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),這些引物的 序列如下
(1 )正向引物(forward primer): LXR-a-LBD-2-F ( SEQ ID NO: 1 )
5 ，-AAGGATCCCTGTCAGAAGAACAGATC-3 ，；以及 (2 )反向引物(reverse primer): LXR-a-LBD-1陽R ( SEQ ID NO: 2 )
5 ，-AAAAGCTTTTCG TGCACATCCCAG AT-3'
將PCR復(fù)制的產(chǎn)物經(jīng)過純化之后，以BamH I與HindIII限制性內(nèi)切酶處 理，并接合至已預(yù)先以BamH I與HindIII限制性內(nèi)切酶處理的pCMV-BD (購 自stratagene ),形成pCMV-BD LXR-a LBD;接著以phRL-TK (購自Promega) 為模板，mTK-l-F ( SEQ ID NO: 3 )與mTK-2-R (SEQ ID NO: 4)為引物，進(jìn) 行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，這些引物的序列如下 (3)正向引物:mTK-l-F (SEQ ID NO: 3)
5,畫AAGTCG ACGGCCCCGCCCAGCGTCTTGT畫3 ，；以及 (4 )反向引物mTK畫2-R ( SEQ ID NO: 4 )
5，-AGATCTGCGGCACGCTGTTGACGCTGTTAAGCGGGTCGCTGCAG-
3，
將PCR復(fù)制的產(chǎn)物經(jīng)過純化之后，接合至pGEM easy vector (購自 Promega )，再經(jīng)Sph I與Sal I限制性內(nèi)切酶作用后接合至pG5SEAP vector(購 自BD Biosciences);再以上述pG5SEAP (含TK)為模板，利用引物SEAP cassette F與Beta-lactamase R進(jìn)4亍聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，這些51物的序列如下 (5 )正向引物SEAP cassette F ( SEQ ID NO: 5 )
5 ，-TACCGGTTCACACAGGAAACAGCTATGACC-3 ，；以及 (6 )反向引物(3-lactamase R ( SEQ ID NO: 6 ) 5 ，-GGGCGAC ACGGAAATGTTGAATACTC-3'
PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化之后，以DraIII限制性內(nèi)切酶作用后，接合到同樣以DraIII限制性內(nèi)切酶處理的pCMV-BD LXR-a LBD中，該P(yáng)CR產(chǎn)物是插置于 該質(zhì)粒的復(fù)制起始點(diǎn)fl ori處，如此即為a-SEAP表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建(請(qǐng)參閱圖1 )。 實(shí)施例2:
LXR激動(dòng)劑篩選方法的構(gòu)建
本發(fā)明前述構(gòu)建的a-SEAP表達(dá)質(zhì)?？蛇M(jìn)一步用于篩選LXR激動(dòng)劑的方 法中，該方法包含下述步驟
(a) 構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，該表達(dá)質(zhì)粒至少包括肝臟X受體alpha配體結(jié)合區(qū) 域(LXR-a ligand binding domain )的序歹'j、 GAL-4脫氧核糖核酸結(jié)合區(qū)域(DNA binding domain )的序列、可受該GAL-4脫氧核糖核酸結(jié)合區(qū)域辨識(shí)的GAL-4 上游啟動(dòng)序歹'J ( GAL-4 upstream activation sequence )以及可受該GAL畫4上游 啟動(dòng)序列調(diào)控的報(bào)告基因(reportergene);
(b) 將該表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(transfect)至宿主細(xì)胞； (c )在該宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中加入待測(cè)樣品；
(d)檢測(cè)培養(yǎng)基中該報(bào)告基因的表達(dá)量；
(e )對(duì)比加入該待測(cè)樣品時(shí)的該報(bào)告基因的表達(dá)量與未加入該待測(cè)樣品 時(shí)的該報(bào)告基因的表達(dá)量；以及
(f)當(dāng)步驟(e)中該待測(cè)樣品的該報(bào)告基因的表達(dá)量高于未加入該待測(cè) 樣品的該報(bào)告基因的表達(dá)量，則表示該待測(cè)樣品含有可與肝臟X受體alpha配 體結(jié)合區(qū)域(LXR-a LBD )相結(jié)合的配體(ligand),并判定該待測(cè)樣品為可活 化肝臟X受體(LXR)的激動(dòng)劑。
其中，步驟(a)的表達(dá)質(zhì)?？蔀楸景l(fā)明所構(gòu)建的a-SEAP表達(dá)質(zhì)粒，或 其他包含步驟(a)所述這些序列元件(element)的表達(dá)載體；報(bào)告基因可為 本發(fā)明的分泌型堿性磷酸酶(SEAP)或其他容易被測(cè)知的表型且具備靈敏、 可定量與可一再分析等特點(diǎn)的報(bào)告基因例如P-galatosidase或如熒光素酶 (luciferase)的熒光蛋白等，并不以此為限。在步驟(b)，宿主細(xì)胞可表達(dá) GAL-4脫氧核糖核酸結(jié)合區(qū)域(GAL-4 BD)與肝臟X受體alpha配體結(jié)合區(qū) 域(LXR-a LBD)蛋白質(zhì)。在步驟(c),當(dāng)待測(cè)樣品中含有可與肝臟X受體 alpha配體結(jié)合區(qū)域(LXR-a LBD)相結(jié)合的配體時(shí)，GAL-4脫氧核糖核酸結(jié) 合區(qū)域(GAL-4 BD )會(huì)與GAL-4上游啟動(dòng)序列(GAL-4 UAS )相結(jié)合，進(jìn)而驅(qū)動(dòng)a-SEAP表達(dá)質(zhì)粒上報(bào)告基因的表達(dá)，并利用報(bào)告基因的表達(dá)與否評(píng)估待 測(cè)樣品是否可活化LXR,因此通過本發(fā)明建立的篩選方法可快速篩選檢測(cè)得 LXR的激動(dòng)劑。 實(shí)施例3:
LXR激動(dòng)劑篩選方法的測(cè)試
本實(shí)驗(yàn)是通過實(shí)施例2所建立的LXR激動(dòng)劑篩選方法，以人工合成的 T0901317強(qiáng)力激動(dòng)劑評(píng)估該方法的可行性，并檢測(cè)升麻是否為L(zhǎng)XR的激動(dòng)劑。 將前述制備好能篩選LXR激動(dòng)劑的a-SEAP表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞抹中，并在 培養(yǎng)該細(xì)胞株時(shí)，分別在其培養(yǎng)液中加入陽性對(duì)照組T0901317以及下述制備 好的升麻生藥材與升麻科學(xué)中藥的粗萃取物，當(dāng)這些待測(cè)樣品中含有可與肝臟 X受體alpha配體結(jié)合區(qū)域(LXR-a LBD )相結(jié)合的配體時(shí)，便會(huì)驅(qū)動(dòng)a-SEAP 表達(dá)質(zhì)粒上報(bào)告基因的表達(dá)，再偵測(cè)報(bào)告基因表達(dá)量以得知這些待測(cè)樣品是否 為活化LXR的激動(dòng)劑。其實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)說明如下 (1 )升麻活性成分的萃取
本試驗(yàn)分別采用升麻生藥材與升麻科學(xué)中藥進(jìn)行粗萃取。其中，取生升麻 生藥材的干燥根皮或莖壓碎研磨，此升麻生藥材的品種包含三葉升麻 (C7附/《wga /zerac/ezyb//o Kom.)、 興安升麻(C/m/czy^ga da/zwWco ( Turcz.) Maxim.)或升麻(C7/w'c一伊/o幼Wa L.)，其中，三葉升麻分布于東北各地， 興安升麻分布于東北、華北與華中各地，升麻分部于華南、華中、華北和華西 各地；同時(shí)取商品化升麻科學(xué)中藥(購自順天堂科學(xué)中藥)，該升麻科學(xué)中藥 是由升麻(C7w'cz/w伊/o幼'^ L.)所組成的單方，其中l(wèi)克的升麻科學(xué)中藥含 0.68克的浸膏(升麻經(jīng)熬煮去除部份水分后留下的物質(zhì))以及0.32克的賦形 劑，再將這兩種升麻分別以水及有機(jī)溶劑進(jìn)行粗萃取。水萃取部份，加入藥材 的IO倍體積的二次去離子水(ddH20)，以旋轉(zhuǎn)的方式進(jìn)行混合，4小時(shí)后請(qǐng)爭(zhēng) 置于4。C冰箱，隔天離心取上清液，所得的萃取液冷凍干燥后計(jì)算回收率；有 機(jī)溶劑萃取部份，加入藥材的10倍體積的70%乙醇，以旋轉(zhuǎn)的方式進(jìn)行混合， 4小時(shí)后靜置于4X:水箱，隔天離心取上清液，所得的萃取液冷凍干燥后計(jì)算 回收率。將經(jīng)粗萃取過后的升麻生藥材與升麻科學(xué)中藥的水萃取物與乙醇萃取 物儲(chǔ)藏備用，以在后續(xù)篩選時(shí)用作待測(cè)樣品。(2 )利用LXR激動(dòng)劑篩選方法檢測(cè)升麻萃取物是否為活化LXR的激動(dòng)
劑
將前述a-SEAP表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至中國倉鼠卵巢細(xì)胞4朱(CHO-kl)中，并 將轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞林培養(yǎng)于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，置入二氧化碳培養(yǎng)箱于37。C下 培養(yǎng)5小時(shí)后，分別加入濃度為0.1嗎/ml、 1嗎/ml及10嗎/ml的前述制備好 的升麻生藥材與升麻科學(xué)中藥的水粗萃取物與乙醇粗萃取物，同時(shí)以細(xì)胞無轉(zhuǎn) 染a-SEAP表達(dá)質(zhì)粒且無添加任何藥物的培養(yǎng)基為空白對(duì)照組(mock control )、 無添加任何藥物的培養(yǎng)基為陰性對(duì)照組(negative control),并以添加有2 fiM T0901317 (購自Merck, USA )的培養(yǎng)基為陽性對(duì)照組，其中T0901317的化學(xué) 全名為N-(2，2，2-trifluoroethyl)-N畫[4-[2，2，2-trifluoro畫l-hydroxy畫1-(trifluoromethyl) ethyl]phenyl]-benzenesulfonamide，研究證實(shí)T0901317為L(zhǎng)XR-a與LXR-J3的 激動(dòng)劑，其可通過活化LXR受體與RXR受體間的異質(zhì)雙體化 (heterodimerization dimer)過程，而誘發(fā)ABC 1基因轉(zhuǎn)化膽固醇運(yùn)輸?shù)谋磉_(dá)， 這可促進(jìn)膽固醇自腸道細(xì)胞中釋出，進(jìn)而抑制腸道吸收膽固醇，達(dá)到抗動(dòng)脈粥 狀硬化的目的，故試驗(yàn)中是將其當(dāng)作陽性對(duì)照組以測(cè)試本發(fā)明所構(gòu)建的LXR 激動(dòng)劑篩選方法的效用。
在培養(yǎng)基中加入上述待測(cè)物質(zhì)并處理24 48小時(shí)后，收集各培養(yǎng)液，以進(jìn) 行細(xì)胞存活率與分泌型堿性磷酸酶(SEAP)報(bào)告基因活性的偵測(cè)。其中細(xì)胞 存活率是以MTT分析法進(jìn)行的，此方法是一種生物學(xué)上常用以測(cè)定細(xì)胞存活 率或增殖作用的方法，其主要依賴活細(xì)胞內(nèi)線粒體中的琥珀酸脫氫酶的作用將 MTT的四唑鹽(tetrazolium)轉(zhuǎn)為藍(lán)色的產(chǎn)物MTT曱膊(formazan)，堆積于 細(xì)胞中，當(dāng)加入DMSO將其溶解，則可利用測(cè)OD值得知細(xì)胞還原MTT的能 力(formazan形成量)，此OD值代表了線粒體的活性，即活細(xì)胞數(shù)目。測(cè) 試時(shí)，取前述處理后的細(xì)胞，在避光的環(huán)境下于加入2.5 mg/ml的MTT,反應(yīng) 4小時(shí)后再于每一孔內(nèi)加入100 )il的lysis buffer終止反應(yīng)。最后以酶標(biāo)儀在 570 nm吸光波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值，以此計(jì)算細(xì)胞的存活率。
分泌型堿性磷酸酶(SEAP)報(bào)告基因活性通過檢測(cè)其吸收光方式測(cè)得， 該方法收取培養(yǎng)液至1.5 ml微量離心管內(nèi)，以65。C加熱5分鐘，于10,000 rpm 轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，接著將各個(gè)樣品加入96孔板測(cè)試活性，基于各受測(cè)樣品表達(dá)活性可能高低不一，為避免當(dāng)受測(cè)樣品可能因其表達(dá)活性較高時(shí)，若取樣 體積過多會(huì)使測(cè)得吸收值超過線性范圍，或者當(dāng)測(cè)樣品可能因其表達(dá)活性較差 時(shí)，若取樣體積過少會(huì)造成無法測(cè)得吸收值的狀況，因此該試驗(yàn)中每一個(gè)樣品 分別取低、中和高三種量進(jìn)行分析，且也可達(dá)重復(fù)三次的試驗(yàn)?zāi)康?，每一個(gè)樣
品取三種體積分別為10^1、 20^1和50^1，再加入二次去離子水(ddH20)至總 體積為100 (il，最后加入100 ^呈色劑(含40 mg pNPP的8 ml 2倍SEAP緩 沖液)，以動(dòng)力學(xué)模式(kinetic mode )利用酶標(biāo)儀于A4q5吸收波長(zhǎng)下每5分鐘 測(cè)一次共測(cè)60分鐘，并以下列式子計(jì)算得分泌型堿性磷酸酶(SEAP )活性變 化
分泌型堿性磷酸酶活性(mU/ml) =[ ( 60分鐘的A4G5吸光值-0分鐘的A405 吸光值)/60/0.04] x ( 1000/樣品體積)
其中l(wèi)mU ( milliunits )是等于每分鐘0.04的A4Q5吸光值的增加量。此外， 本發(fā)明為確認(rèn)分泌型堿性磷酸酶活性的數(shù)值高低是源自于藥物的作用而非細(xì) 胞數(shù)不同所產(chǎn)生的差異，所測(cè)出的活性需以細(xì)胞存活率標(biāo)準(zhǔn)化，亦即將測(cè)得的 分泌型堿性磷酸酶活性除以MTT的OD值，即為每單位細(xì)胞活性，也就是分 泌型堿性磷酸酶活性的標(biāo)準(zhǔn)化。并求得實(shí)驗(yàn)組所測(cè)得數(shù)值與陰性對(duì)照組的數(shù)值 間的比值，此即為活化LXR因子的活性倍率(activation fold),其結(jié)果如圖2 與圖3所示。
請(qǐng)同時(shí)參閱圖2與圖3,圖2為利用LXR激動(dòng)劑篩選方法檢測(cè)升麻科學(xué) 中藥的水與70%乙醇粗萃取物的分泌型堿性磷酸酶的活性倍率結(jié)果；圖3為利 用LXR激動(dòng)劑篩選方法檢測(cè)升麻生藥材的水與70%乙醇粗萃取物的分泌型堿 性磷酸酶的活性倍率結(jié)果。由圖2中可知，各濃度的升麻科學(xué)中藥的水及乙醇 粗萃取物所測(cè)得的分泌型堿性磷酸酶(SEAP)活性倍率皆相對(duì)高于陰性對(duì)照 組(N),這表示這些萃取物都可活化LXR,增進(jìn)其表達(dá)量，其中又以濃度為 10pg/ml的升麻科學(xué)中藥水粗萃取物的活性倍率數(shù)值為最高，其所呈現(xiàn)的分泌 型堿性磷酸酶(SEAP)活性倍率約為陰性對(duì)照組的兩倍。由圖3中可知，除 濃度為O.l嗎/ml的升麻生藥水粗萃取物的活性倍率與陰性對(duì)照組相近外，其 他濃度的升麻生藥的水及乙醇粗萃取物所表達(dá)出的分泌型堿性磷酸酶(SEAP ) 活性倍率皆較高于陰性對(duì)照組，這表示升麻生藥水粗萃取物的濃度大于0.1嗎/ml時(shí)，方能有效活化LXR的表達(dá)，而濃度為0.1 |ig/ml~10 |ig/ml的升麻生 藥乙醇粗萃取物則皆可活化LXR,增進(jìn)其表達(dá)量，其中又以濃度為10嗎/ml 的升麻生藥乙醇粗萃取物的活性倍率數(shù)值為最高，其所呈現(xiàn)的分泌型堿性磷酸 酶(SEAP)活性倍率約為陰性對(duì)照組的1.7倍。這些結(jié)果顯示升麻科學(xué)中藥 與升麻生藥的水與乙醇粗萃取物含有可與肝臟X受體alpha配體結(jié)合區(qū)域 (LXR-aLBD)相結(jié)合的配體，因此其可用作活化LXR的激動(dòng)劑。另一方面，由圖2與圖3中可觀察到，相對(duì)于陰性對(duì)照組，本身即為L(zhǎng)XR組，此預(yù)期中的活性倍率結(jié)果顯示，本發(fā)明利用轉(zhuǎn)染有cc-SEAP表達(dá)質(zhì)粒的中 國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO-kl )所建立的LXR激動(dòng)劑篩選方式，確實(shí)可有效篩選 出能活化LXR的激動(dòng)劑，且于該篩選方法中，只要待側(cè)樣品的報(bào)告基因的活 性倍率高于陰性對(duì)照組，和/或該待側(cè)樣品在不同濃度時(shí)所表現(xiàn)活性與其濃度 高低成正相關(guān)時(shí)，即可判定該待測(cè)樣品為可活化LXR的激動(dòng)劑。此外，同時(shí)比較升麻科學(xué)中藥與升麻生藥的水與乙醇粗萃取物的活性倍率 時(shí)，可發(fā)現(xiàn)濃度為10嗎/ml升麻科學(xué)中藥水粗萃取物所呈現(xiàn)的分泌型堿性磷 酸酶(SEAP )活性倍率顯著高于其他這些萃取物，因此，本發(fā)明是將此10嗎/ml 升麻科學(xué)中藥水粗萃取物以膠體過濾層析作進(jìn)一步的分離純化，之后再針對(duì)每 一分液(fraction )進(jìn)行LXR激動(dòng)劑的篩選試驗(yàn)，找出升麻萃取物中可活化LXR 的有效成分。(3 )利用LXR激動(dòng)劑篩選方法檢測(cè)升麻科學(xué)中藥水萃取物中所含可活化 LXR的有效成分本試驗(yàn)是取10g升麻科學(xué)中藥回溶于100ml水中進(jìn)行萃取，萃取后離心 所得的上清液冷凍干燥后凈重為2.4g,再回溶于8ml水后，以SephadexLH-20 管柱進(jìn)行膠體過濾層析，該Sephadex LH-20是依據(jù)管柱內(nèi)所充填的膠體孔徑 及萃取物分子量大小以達(dá)到分離效果。SephadexLH-20管柱預(yù)先以3倍體積的 去離子水進(jìn)行平衡，然后于管柱中加入體積為8 ml且濃度為300嗎/ml的升麻 科學(xué)中藥水粗萃取物，以二次去離子水(ddH20)為沖堤液以0.5 ml/min的流 速進(jìn)行分離純化，并將濾出物以每管5毫升的體積量分管收集，共收集180 管的分液(fraction )。分別取前述所收集的各分液200 pi置入石英盤中，以酶標(biāo)儀(ELISA reader)于254 nm吸光波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值，各分液的254 nm 吸光波長(zhǎng)分布圖如圖4所示，再依據(jù)圖4中254 nm吸光波長(zhǎng)的分布狀態(tài)，若 可以明顯區(qū)分成不同區(qū)域即視為一主要吸收峰，再由所呈現(xiàn)的主要吸收峰，將 這180管的分液再歸納分成14個(gè)分液，這14個(gè)分液的主要吸收峰分布范圍及 其OD254數(shù)值如表1所示，并將濃度為0.01呢/ml的這14個(gè)分液以LXR激動(dòng) 劑篩選方法檢測(cè)各分液是否含有可活化LXR因子的有效成分，測(cè)得各分液的 分泌型堿性磷酸酶(SEAP)活性，并以濃度為0.01嗎/ml的升麻科學(xué)中藥水 粗萃取物的分泌型堿性磷酸酶活性數(shù)值為基準(zhǔn)，求得各分液所測(cè)分泌型堿性磷 酸酶活性數(shù)值與升麻科學(xué)中藥水粗萃取物的分泌型堿性磷酸酶活性數(shù)值間的 比值，此即為各分液的活化LXR因子的活性倍率(activation fold),其結(jié)果如 圖5所示。表1 14個(gè)分液的主要吸收峰分布范圍及其OD254數(shù)值請(qǐng)參閱圖5,該圖為升麻科學(xué)中藥水粗萃取物經(jīng)Sephadex LH-20分離純化 所得各分液，以LXR激動(dòng)劑篩選方法檢測(cè)后的分泌型堿性磷酸酶活性倍率結(jié) 果。由圖中可知，經(jīng)Sephadex LH-20分離純化后的升麻科學(xué)中藥水萃取物各 分液中，除分液11至14的活性倍率與升麻科學(xué)中藥水粗萃取物相近外，其他 各分液(分液1至10)所呈現(xiàn)的活性倍率皆相對(duì)高于升麻科學(xué)中藥水粗萃取 物，其中又以分液6的分泌型堿性磷酸酶活性倍率為最高，其活性倍率約為升 麻科學(xué)中藥水粗萃取物的2倍，此結(jié)果顯示，升麻科學(xué)中藥水粗萃取物經(jīng) Sephadex LH-20分離純化后所得的分液6 (即180管分液中的第58管~第66 管的收集液)具有較佳活化LXR的功效。因此，具有活化LXR功效的升麻生藥材的水與70%乙醇粗萃取物、升麻 科學(xué)中藥的水與70%乙醇粗萃取物以及上述分液6可誘發(fā)LXR下游基因的表 達(dá)，進(jìn)而達(dá)到預(yù)防動(dòng)脈粥狀硬化及心血管的目的；此外，含可有效活化LXR 成分的這些物質(zhì)也可用作活化LXR的激動(dòng)劑，并制備成醫(yī)藥組成物，以將其 應(yīng)用于抗動(dòng)脈粥狀硬化、預(yù)防糖尿病以及抗發(fā)炎等醫(yī)學(xué)方面。其中，前述醫(yī)藥 組成物除包含有效劑量的該些物質(zhì)之外，尚可包括藥學(xué)上可接受的載體。載體 可為賦形劑(如水)、填充劑(如蔗糖或淀粉)、黏合劑(如纖維素衍生物)、 稀釋劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑或甜味劑，但并未僅限于此。本發(fā)明醫(yī)藥組成物 可依一般公知藥學(xué)的制備方法生產(chǎn)制造，將前述這些物質(zhì)的有效成分劑量與一 種以上的載體相混合，制備出所需的劑型，此劑型可包括錠劑、粉劑、粒劑、 月交嚢或其它液體制劑，-f旦未以此為限。序列表<110>國鼎生物科技股份有限公司 <120〉肝臟X受體激動(dòng)劑的篩選方法<130> OITW083318<160> 6<170> Patentln version 3.3<210> 1<211> 26<212> DNA <213>人工序列<220><223>以人類肝臟數(shù)據(jù)庫(human liver cDNA 1 ibrary)為模板的正向引物<400> 1aaggatccct gtcagaagaa cagatc 26<210> 2<211> 26<212〉 ■ <213>人.丁序列<220><223>以人類肝臟數(shù)據(jù)庫(human liver cDNA library)為模板的反向引物<400> 2aaaagctttt cgtgcacatc ccagat 26<210〉 3<211> 28<212〉 DNA <213>人工序列<220〉<223>以phRL-TK為模板的正向引物 <400〉 3aagtcgacgg ccccgcccag cgtcUgt 28<210> 4<211〉 44<212> DNA <213>人工序列<220〉<223〉以phRL-TK為模板的反向引物 <400> 4agatctgcgg cacgctgttg acgctgttaa gcgggtcgct gcag 44<210〉 5<211〉 30<212> DNA <213〉人工序列<220><223>以pG5SEAP為模板的正向引物 <■〉 5taccggttca cacaggaaac agctatgacc 30<210> 6<211> 26<212> DNA <213〉人工序列<220〉<223〉以pG5SEAP為模板的反向引物 <400〉 6gggcgacacg gaaatgttga atactc 2權(quán)利要求
1.一種肝臟X受體alpha(liver X receptor alpha，LXR-α)激動(dòng)劑(agonist)的篩選方法，其步驟包含(a)構(gòu)建一種表達(dá)質(zhì)粒，該表達(dá)質(zhì)粒至少包括肝臟X受體alpha配體結(jié)合區(qū)域(LXR-αligand binding domain)的序列、GAL-4脫氧核糖核酸結(jié)合區(qū)域(DNA binding domain)的序列、可受該GAL-4脫氧核糖核酸結(jié)合區(qū)域辨識(shí)的GAL-4上游啟動(dòng)序列(GAL-4 upstream activation sequence)以及可受該GAL-4上游啟動(dòng)序列調(diào)控的報(bào)告基因(reporter gene)；(b)將該表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(transfect)至宿主細(xì)胞；(c)在該宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中加入待測(cè)樣品；(d)檢測(cè)培養(yǎng)基中該報(bào)告基因的表達(dá)量；(e)對(duì)比加入該待測(cè)樣品時(shí)的該報(bào)告基因的表達(dá)量與未加入該待測(cè)樣品時(shí)的該報(bào)告基因的表達(dá)量；以及(f)當(dāng)步驟(e)中該待測(cè)樣品的該報(bào)告基因的表達(dá)量高于未加入該待測(cè)樣品的該報(bào)告基因的表達(dá)量，則表示該待測(cè)樣品含有可與肝臟X受體alpha配體結(jié)合區(qū)域相結(jié)合的配體(ligand)，并判定該待測(cè)樣品為可活化肝臟X受體alpha的激動(dòng)劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述報(bào)告基因的產(chǎn)物為能被偵測(cè) 及量化的酶或焚光蛋白。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述報(bào)告基因?yàn)榉置谛蛪A性磷酸 酶(secreted alkaline phosphatase ， SEAP )。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述報(bào)告基因的表達(dá)量通過酶標(biāo) 儀(ELIS A reader)分析。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為中國倉鼠卵 巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary cell, CHO畫kl )。
7. —種升麻萃取物用以制備可活化肝臟X受體alpha (liver X receptor alpha LXR-a)的藥物的用逸該升麻萃取物分離自升麻(i^/zowa生藥或升麻科學(xué)中藥。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中，所述升麻生藥選自由三葉升麻(C7m/"/， /^rac/e*//a Kom.)、興安升麻(CVm/"/， tfoW/ca ( Turcz.) Maxim.)以及升麻(CV附/"/wga/o幼Wa L.)所組成的組中。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中，所述升麻科學(xué)中藥為由升麻 (CV附/"/wga L.)所組成的單方。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的用途，其中，所述升麻萃取物為醇類萃取物。
11. 根據(jù)權(quán)利要求IO所述的用途，其中，所述醇類為乙醇。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的用途，其中，所述乙醇濃度為70%。
13. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的用途，其中，所述升麻萃取物為水萃取物。
14. 一種用于活化肝臟X受體alpha (liver X receptor alpha, LXR-a )的激 動(dòng)劑(agonist )，其至少包括有效劑量的升麻(i /z/2r0ma CV/w'"/wgae)生藥乙醇 萃取物以及醫(yī)學(xué)上可接受的載體，其中，所述升麻生藥選自由三葉升麻(CVw/"/wga /7erac/ez》/z'a Kom.)、興安升麻(CV附/"y^a tfo/w/r/ca ( Turcz.) Maxim.)以及升麻(C/w/cz/wgo/o"zV/a L.)所組成的組中。
15. —種用于活化肝臟X受體alpha (liver X receptor alpha, LXR-a)的 激動(dòng)劑(agonist),其至少包括有效劑量的升麻科學(xué)中藥水萃取物以及醫(yī)學(xué)上 可接受的載體，其中，所述升麻科學(xué)中藥為由升麻(C7w/c訴/伊/o"/^L.)所 組成的單方。
16. —種可活化肝臟X受體alpha (liver X receptor alpha, LXR-a)的升麻 (i /2/加ma C/w/cz/wgae )萃取物的制備方法，其步驟包含(a) 取300 |ig/ml升麻科學(xué)中藥水萃取物8 ml經(jīng)Sephadex LH-20膠體 過濾層析以0.5 ml/min流速進(jìn)行，并將濾出物以每管5毫升的體積量分管收集 而得到180管分液(fraction),其中，所述升麻科學(xué)中藥為由升麻(CV/w'cz/wga /oW(iaL.)所纟且成的單方；(b) 通過酶標(biāo)〗義(ELISA reader)于254 nm吸收光波長(zhǎng)下測(cè)定這些分液 的吸光值，再劃分成14管分液；以及(c )利用如權(quán)利要求1的肝臟X受體(LXR)激動(dòng)劑(agonist)的篩選方法檢測(cè)該14管分液的報(bào)告基因表達(dá)量，以獲得可活化肝臟X受體(LXR) 的第6管分液。
17. —種用于活化肝臟X受體alpha (liver X receptor alpha, LXR-a )的激 動(dòng)劑(agonist),其至少包括有效劑量的如權(quán)利要求16所述的第6管分液以及 醫(yī)學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明是涉及一種肝臟X受體(LXR)激動(dòng)劑(agonist)的篩選方法，尤其是涉及一種利用本發(fā)明構(gòu)建的α-SEAP表達(dá)質(zhì)粒所建立的篩選平臺(tái)以供篩選可活化LXR的激動(dòng)劑的方法；同時(shí)利用此方法篩選得升麻生藥與升麻科學(xué)中藥的水及酒精萃取物為L(zhǎng)XR的激動(dòng)劑。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101592648SQ200810109808
公開日2009年12月2日 申請(qǐng)日期2008年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月30日
發(fā)明者劉勝勇, 溫武哲, 郭茂田 申請(qǐng)人:國鼎生物科技股份有限公司