專利名稱：一種增強(qiáng)基因表達(dá)的dna分子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)基因表達(dá)的DNA分子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的廣泛應(yīng)用，植物基因工程為培育作物優(yōu)良品種開辟 了一條嶄新的途徑，通過導(dǎo)入外源基因使植物獲得新性狀并能穩(wěn)定遺傳是植物基因 工程的最終目的。然而大量研究結(jié)果表明，外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中由于位置效應(yīng)、 DNA甲基化、共抑制及反式失活等原因，導(dǎo)致在DNA水平、轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后修飾水 平等基因表達(dá)的不同時(shí)期發(fā)生失活現(xiàn)象。因此，有效地提高外源基因的表達(dá)水平， 克服外源基因失活現(xiàn)象對基因工程的研究有重要意義。
隨著研究的深入，人們在染色質(zhì)水平利用核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列是近年發(fā)展起來的 克服外源基因失活的一種比較有效的方法。核基質(zhì)結(jié)合區(qū)(Matrix Attachment Regions, MAR)序列，又稱核骨架結(jié)合區(qū)(Scaffold Attachment Regions, SARs) 序列，是存在于真核細(xì)胞染色質(zhì)中的一段與核基質(zhì)或核骨架特異結(jié)合的DNA序列， MAR常作為邊界元件出現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄單位的兩側(cè)以及像增強(qiáng)子這樣的調(diào)節(jié)序列附近,大小 在200bp到幾個(gè)kb之間。MAR序列主要特征是富含AT及其它特征序列，包含 A-box (AATAAAAA/CAA)或T-box(TTTTATTTTT) 、TATAA結(jié)構(gòu)域及拓?fù)洚悩?gòu)酶II識(shí)別切割 序列。這些特殊的DNA結(jié)構(gòu)，使MAR與細(xì)胞中的核基質(zhì)結(jié)合，把染色質(zhì)分成一個(gè)個(gè)獨(dú) 立的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，從而使環(huán)內(nèi)基因免受周圍染色質(zhì)的影響。根據(jù)MAR的特性，研究人員 將MAR序列構(gòu)建到外源基因表達(dá)框兩側(cè)，使它們在轉(zhuǎn)基因植物的染色質(zhì)中形成獨(dú)立的 區(qū)域，以此來克服位置效應(yīng)及其他原因造成的基因失活，進(jìn)而穩(wěn)定和提高外源基因 的表達(dá)水平。Breyne等人最先把MAR用于轉(zhuǎn)化植物的研究中。他們用來源于大豆凝集 素基因附近的1.55kb長的MAR序列構(gòu)建在P-葡糖醛酸酶(P-glucuronidase, GUS) 基因(w'必)的兩側(cè)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MAR可以穩(wěn)定GUS的表 達(dá)水平，帶有MAR的轉(zhuǎn)化體與對照相比，GUS表達(dá)的變異幅度降低了20倍，但是沒有 提高報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)量。Allen等利用與煙草核基質(zhì)結(jié)合力極強(qiáng)的自身MAR轉(zhuǎn)化煙草， 以GUS作報(bào)導(dǎo)基因，GUS的表達(dá)量提高了60倍，但并不能消除轉(zhuǎn)化體間的變異。LIU等 將從擬南芥中分離的MAR序列構(gòu)建在植物表達(dá)載體中，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草，在轉(zhuǎn)化植物中發(fā)現(xiàn)GUS表達(dá)量比對照提高了5-10倍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種增強(qiáng)基因表達(dá)的DNA分子及其應(yīng)用。 本發(fā)明所述增強(qiáng)基因表達(dá)的DNA分子是如下1)或2)的DNA分子
1) 其核苷酸序列是序列表中序列1;
2) 在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA分子雜交且能與核基質(zhì)或核骨架特異結(jié)合的 DNA分子。
其中，所述在嚴(yán)格條件下與序列表中序列1的DNA分子雜交且能與核基質(zhì)或核 骨架特異結(jié)合的DNA分子具體可是如下(1)至(15)任一所述的DNA分子
(1) 其核苷酸序列是序列表中的序列2;
(2) 其核苷酸序列是序列表中的序列3;
(3) 其核苷酸序列是序列表中的序列4;
(4) 其核苷酸序列是序列表中的序列5;
(5) 其核苷酸序列是序列表中的序列6;
(6) 其核苷酸序列是序列表中的序列7;
(7) 其核苷酸序列是序列表中的序列8;
(8) 其核苷酸序列是序列表中的序列9;
(9) 其核苷酸序列是序列表中的序列10;
(10) 其核苷酸序列是序列表中的序列l(wèi)l;
(11) 其核苷酸序列是序列表中的序列12;
(12) 其核苷酸序列是序列表中的序列13;
(13) 其核苷酸序列是序列表中的序列14;
(14) 其核苷酸序列是序列表中的序列15。 上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC， 0.5。/。SDS的溶液中，在65。C下雜交，然后用
2XSSC, 0. 1% SDS和1XSSC， 0. 1% SDS各洗膜一次。
所述增強(qiáng)基因表達(dá)的DNA分子能與核基質(zhì)或核骨架特異結(jié)合，命名為BnMAR。 含有BnMAR的表達(dá)盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
所述表達(dá)盒自上游至下游依次為至少一個(gè)BnMAR、啟動(dòng)子、外源基因、轉(zhuǎn)錄終 止子；所述BnMAR的方向與所述外源基因的轉(zhuǎn)錄方向相同。
所述表達(dá)盒中，存在兩個(gè)或兩個(gè)以上的BnMAR時(shí)，所述兩個(gè)或兩個(gè)以上的BnMAR的方向相同。
含有BnMAR或其表達(dá)盒的重組表達(dá)載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
本發(fā)明提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將含有BnMAR和外源目的基因的重組 表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞或組織中獲得轉(zhuǎn)基因植物。
攜帶有BnMAR的植物表達(dá)載體可通過Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接
DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并 將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。所述植物既可以是玉米、水稻、小麥等單子葉植物， 也可以是大豆、油菜、棉花等雙子葉植物。本發(fā)明中所述植物具體為煙草。
含BnMAR的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或擴(kuò)增BnMAR全長及其任意片段的引物對也 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明將BnMAR插入到外源基因GUS的啟動(dòng)子前，構(gòu)建成重組表達(dá)載體 pBI-BnMAR，將重組表達(dá)載體導(dǎo)入煙草中獲得轉(zhuǎn)基因煙草，GUS染色和GUS活性定量 測定結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草中外源基因的表達(dá)增強(qiáng)。本發(fā)明的BnMAR可以增強(qiáng)外源基 因的表達(dá)，將在培育轉(zhuǎn)基因植物中得到廣泛應(yīng)用。


圖1為BnMAR與其它來源的MAR序列比較 圖2為BnMAR同源性比較
圖3為植物表達(dá)載體pBI121和pBI-BnMAR示意圖
P-35S，花椰菜花葉病毒35S(CaMV35S)蛋白基因啟動(dòng)子；T-nos，胭脂堿合成酶 (Nos)基因中止子；^/5f艮告基因；LB和RB為T-DNA左右邊界。
圖4為轉(zhuǎn)基因煙草植株GUS活性檢測
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l、核基質(zhì)結(jié)合區(qū)(BnMAR)的獲得
取培養(yǎng)20天的甘藍(lán)型油菜(5rasw'cs朋pwsL)中雙9號(hào)的葉片50mg，采用SDS 法提取油菜基因組DNA。根據(jù)Genbank收錄的油菜四段DNA序列(DU103638、 BH689221、 BZ463404、 BZ445495)，利用生物學(xué)軟件進(jìn)行序列拼接得到大小為920bp的序列，經(jīng) 分析該序列具有MAR序列特征，據(jù)此序列設(shè)計(jì)PCR引物Pn和Pr2，引物序列如下
正向引物Pr" 5' - TCGCGAGGGATATCACTTCCTCGGA-3';
反向引物Pr" 5' -TACGTAAGGACCTTATCCCACTCT-3'。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94。C預(yù)變性4min;然后94。C變性30s， 55。C復(fù)性30s， 72。C延 伸30s， 30個(gè)循環(huán)；最后72。C保溫10min。
電泳回收純化約920bp大小的DNA片段，將該DNA片段與載體pGEM-T Easy連 接構(gòu)建載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，酶切鑒定。隨機(jī)挑選20個(gè)鑒定正確的克隆進(jìn)行 測序，共獲得15個(gè)不同序列的DNA片段，其同源性在97%以上，如圖2。
序列表中序列1所示的DNA分子命名為BnMARl，其他14個(gè)不同序列的DNA片 段分別命名為BnMAR2 BnMAR15。含有BnMARl的重組表達(dá)載體命名為pGEM-BnMARl， BnMAR2 BnMAR15的重組表達(dá)載體分別命名為pGEM-BnMAR2 pGEM-BnMARl5。
對所獲得的序列進(jìn)行生物信息分析，它們均含有MAR序列的典型結(jié)構(gòu)特征如 富含AT堿基，A-box (AATAAAAA/CAA)或T-box (TTTTATTTTT) 、 TATAA結(jié)構(gòu)域及拓?fù)?異構(gòu)酶II識(shí)別切割序列等。
將油菜的MAR序列(BN, ^Sra^ica朋/w^與來源于擬南芥(AT， AraZ^Vopw's t力a7ia朋)，大豆(GM， 67yc_z./ e鵬x)，煙草(NT， 7VYco".a/7a ^Z ac)，豌豆(PS，尸j'6"咖 M"V咖)，玉米(ZM， Ze柳sj^)的區(qū)R序列進(jìn)行同源性比較分析發(fā)現(xiàn)，植物的MAR序列 之間同源性比較低，與BnMAR同源性最高的是來自擬南芥的MAR，為34%，結(jié)果見圖l。
實(shí)施例2、植物表達(dá)載體的構(gòu)建及煙草轉(zhuǎn)化
將BnMAR用fcoRI從pGEM-BnMARl中酶切下來，回收純化約920bp的片段，再用pfu 酶補(bǔ)平；將質(zhì)粒pBI121用歷V^ III酶切，pfu酶補(bǔ)平歷V^ III位點(diǎn)；T4DNA連接酶將 具有平末端的BnMAR片段與載體片段連接，獲得植物表達(dá)載體pBI-BnMARl,如圖3。
將構(gòu)建好的載體pBI-BnMARl通過電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，利用葉盤轉(zhuǎn)化法 轉(zhuǎn)化煙草NC89品種。在含有卡那霉素(100mg/L)的MS培養(yǎng)基上篩選抗性植株，將獲得 的抗性植株進(jìn)行PCR檢測，分別獲得轉(zhuǎn)pBI-BnMARl陽性植株35株；轉(zhuǎn)pBI121載體的陽 性植株25株；
實(shí)施例3、轉(zhuǎn)化煙草的GUS染色
取生長在培養(yǎng)瓶中的成熟煙草葉片進(jìn)行GUS染色。每株煙草均取相同部位的組 織，即距頂端第四片展開的葉片。煙草葉片去除葉脈，剪成面積相等的葉盤。 GUS染色方法如下
GUS染色液100. Ommol/L磷酸二氫鈉、0. 5mmol/L高鐵氰化鉀、0. 5mmol/L 亞鐵氰化鉀、L0畫1/L X-gluc、 50mg/mL DMSO、 0.1% Triton X-100。
將相同數(shù)量的煙草葉盤浸入GUS染色液，37°C，過夜染色，然后用95%乙醇脫
7色，統(tǒng)計(jì)染色結(jié)果。
將GUS染色結(jié)果按葉片所著藍(lán)色的深淺分為四個(gè)等級(jí)，用"+ "表示，即脫色 后整個(gè)葉片都染上藍(lán)色的為GUS表達(dá)程度強(qiáng)(+++);葉片的絕大部分染上藍(lán)色的為 表達(dá)程度較強(qiáng)(++);葉片只有少部分染上藍(lán)色的為表達(dá)程度弱(+ );脫色后葉片 觀察不到藍(lán)色的視為沒有表達(dá)(-)。
GUS染色結(jié)果見表l。
表1. GUS染色結(jié)果
得到的染色等級(jí)(+表示)
力'轉(zhuǎn)基因++++++幾乎沒有染染色率
植株
強(qiáng)較強(qiáng)弱出顏色
pBI121254113964%
pBI121-BnMAR352042974.3%
GUS染色結(jié)果表明，BnMARl插入到35S啟動(dòng)子前可以顯著提高轉(zhuǎn)基因植株中報(bào) 告基因GUS的表達(dá)量，與未插入BnMARl的對照載體相比，可觀察到的報(bào)告基因表達(dá) 的植株數(shù)量及報(bào)告基因表達(dá)強(qiáng)度都顯著增加。
實(shí)施例4、轉(zhuǎn)化煙草的GUS活性定量測定
取生長在培養(yǎng)瓶中的成熟煙草葉片進(jìn)行GUS活性定量檢測。為減少誤差，每株 煙草的取材部位是一致的，是距頂端第四片展開的葉片。
按照下述文獻(xiàn)的方法測定成熟的轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的GUS活性Jefferson RA. Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system. Plant Mol Biol R印，1987,5:387-405。用Hoefer DyNA Quant 200型熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長為 350nm、發(fā)射波長455nm下測定熒光值。
總蛋白含量按標(biāo)準(zhǔn)Bradford的方法測定。GUS活性以MU納摩爾數(shù)與總蛋白含量 及時(shí)間的比值nmolMU mg —'蛋白 min —'表示。
轉(zhuǎn)化煙草的GUS活性測定結(jié)果如圖4所示，表明含有BnMARl序列的轉(zhuǎn)化煙草的 GUS基因表達(dá)量比對照(轉(zhuǎn)pBI121的煙草)平均提高了l倍以上，說明BnMARl可以顯 著提高外源基因在植物體內(nèi)的表達(dá)。帶有BnMARl的轉(zhuǎn)化體與對照相比，GUS表達(dá)的變 異幅度沒有顯著降低。
8〈110〉中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
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〈213〉 蕓薹屬油菜(Brassica napusL.)
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〈211〉 899
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〈213〉蕓薹屬油菜(Brassica napus L)
〈400〉 14
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權(quán)利要求
1、一種DNA分子，是如下1)或2)1)其核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與序列表中序列1的DNA分子雜交且能與核基質(zhì)或核骨架特異結(jié)合的DNA分子。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于所述在嚴(yán)格條件下與序列表 中序列1的DNA分子雜交且能與核基質(zhì)或核骨架特異結(jié)合的DNA分子是如下(1)至(14)任--所述的DNA分子(1)其核苷酸序列是序列表中的序列2;(2)其核苷酸序列是序列表中的序列3;(3)其核苷酸序列是序列表中的序列4;(4)其核苷酸序列是序列表中的序列5;(5)其核苷酸序列是序列表中的序列6;(6)其核苷酸序列是序列表中的序列7;(7)其核苷酸序列是序列表中的序列8;(8)其核苷酸序列是序列表中的序列9;(9)其核苷酸序列是序列表中的序列10;(10) 其核苷酸序列是序列表中的序列l(wèi)l;(11) 其核苷酸序列是序列表中的序列12;(12) 其核苷酸序列是序列表中的序列13;(13) 其核苷酸序列是序列表中的序列14;(14) 其核苷酸序列是序列表中的序列15 。
3、 含有權(quán)利要求1或2所述DNA分子的表達(dá)盒，所述表達(dá)盒自上游至下游依次 為至少一個(gè)權(quán)利要求1所述DNA分子、啟動(dòng)子、外源基因、轉(zhuǎn)錄終止子；權(quán)利要求l 所述DNA分子的方向與所述外源基因的轉(zhuǎn)錄方向相同。
4、 含有權(quán)利要求1或2所述DNA分子或權(quán)利要求3所述表達(dá)盒的重組表達(dá)載體。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體的出發(fā) 載體為pBI121。
6、 含有權(quán)利要求1或2所述DNA分子或權(quán)利要求3所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系 或重組菌。
7、 一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將含有權(quán)利要求1或2所述的DNA分子和外源目的基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞或組織中獲得轉(zhuǎn)基因植物。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述植物為煙草。
9、 擴(kuò)增權(quán)利要求1或2所述DNA分子全長及其任意片段的引物對。
10、 權(quán)利要求1或2所述DNA分子、權(quán)利要求3所述的表達(dá)盒或權(quán)利要求4或5 所述重組表達(dá)載體和/或權(quán)利要求6所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在培育轉(zhuǎn)基因植物的 應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種增強(qiáng)基因表達(dá)的DNA分子及其應(yīng)用。該DNA分子，是如下1)或2)1)其核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA分子雜交且能與核基質(zhì)或核骨架特異結(jié)合的DNA分子。本發(fā)明還公開了含有所述DNA分子的表達(dá)盒，所述表達(dá)盒自上游至下游依次為至少一個(gè)所述DNA分子、啟動(dòng)子、外源基因、轉(zhuǎn)錄終止子；所述DNA分子的方向與所述外源基因的轉(zhuǎn)錄方向相同。同時(shí)公開了含有所述DNA分子或所述表達(dá)盒的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。本發(fā)明的增強(qiáng)基因表達(dá)的DNA分子在培育轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101580842SQ200810111629
公開日2009年11月18日 申請日期2008年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月15日
發(fā)明者磊 王, 范云六 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所