專利名稱：菁染料在檢測g-四鏈體結(jié)構(gòu)dna中的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及菁染料在檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA中的新用途。
背景技術(shù)：
單鏈的端粒DNA很容易通過鳥嘌呤堿基之間的氫鍵發(fā)生四個(gè)堿基配對(duì)，形成平 面的G-四鏈體結(jié)構(gòu)。人體端粒DNA序列d (TTAGGG) 4可以在鉀離子或納離子的作 用下形成不同結(jié)構(gòu)的G-四鏈體。在體外與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中識(shí)別G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA (主要 是與線性的雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA相區(qū)別)，對(duì)于確定G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA在人體內(nèi)的生理
功能和抗腫瘤藥物的研發(fā)等方面都有非常重要的作用。
目前，在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中識(shí)別G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA已有一些文獻(xiàn)報(bào)道。體內(nèi)實(shí) 驗(yàn)中識(shí)別G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA較為困難，目前仍存在較大的爭議。體外實(shí)驗(yàn)中識(shí)別 G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA，大都采用生物方法，最常見的是利用與G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA特異 性相互作用的蛋白質(zhì)(主要為各種DNA酶類)。目前發(fā)現(xiàn)的在體外實(shí)驗(yàn)中能與G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA特異性相互作用的蛋白質(zhì)已經(jīng)超過二十種("ioe^sa/s. 2007， 155-165)。但是以純度較高的蛋白質(zhì)作為檢測物，難以分離純化，加上蛋白質(zhì)活 性不易保存，價(jià)格也非常昂貴，大大的限制了以上方法的使用范圍。有報(bào)道采用單 一熒光分子來特異性的標(biāo)記G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA，但是這種方法檢測手段復(fù)雜，儀器 要求非常高，基本上不能普及使用。如有文獻(xiàn)報(bào)道了一種熒光染料分子分別與G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA、雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA結(jié)合時(shí)，表現(xiàn)出不同的熒光壽命"朋7/"ca7 67 e;z^iT. 2004， 7《4490-4494)。
菁染料是一種常用染料，具有獨(dú)特的光敏感性質(zhì)，幾個(gè)世紀(jì)以來，伴隨其獨(dú)特 的理化、光學(xué)性質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，逐漸被用做顯影劑、光敏劑、非線性光學(xué)材料等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供菁染料在檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA中的新用途。 本發(fā)明提供了菁染料在檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA中的應(yīng)用。 應(yīng)用菁染料，可以通過如下方法檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA: 1)將待測DNA溶于pH值6. 0 8. 0的緩沖液，得到溶液A;將菁染料溶解，再 用pH值6. 0 8. 0的緩沖液稀釋，得到溶液B;2)將溶液A和溶液B混合，使混合液中待測DNA與菁染料分子的摩爾比大于 等于1. 5小于等于4，避光條件下反應(yīng)，對(duì)反應(yīng)后溶液進(jìn)行紫外可見吸收光譜分析， 如果菁染料聚集體特征峰(659.5nm)的峰值小于0.01，則待測DNA為G-四鏈體結(jié) 構(gòu)DNA。
應(yīng)用菁染料，還可以通過如下方法檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA:
1) 將待測DNA溶于pH值6. 0 8. 0的緩沖液，得到溶液A;將雙鏈結(jié)構(gòu)DNA溶 于pH值6.0 8.0的緩沖液，得到溶液A'，溶液A'與溶液A的濃度相同；將菁染 料溶解，再用pH值6. 0 8. 0的緩沖液稀釋，得到溶液B;
2) 將溶液A和溶液B混合，使混合液中待測DNA與菁染料分子的摩爾比大于 等于0.5小于1.5;將溶液A'和溶液B混合，使混合液中雙鏈結(jié)構(gòu)DNA與菁染料 分子的摩爾比大于等于0.5小于1.5，作為對(duì)照；避光條件下反應(yīng)，對(duì)兩種反應(yīng)后 溶液進(jìn)行紫外可見吸收光譜分析，如果待測DNA溶液菁染料聚集體特征峰(659. 5nm) 的峰值小于對(duì)照的0. 6倍，則待測DNA為G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA。
應(yīng)用菁染料，還可以通過如下方法檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA:
1) 將待測DNA溶于pH值6. 0 8. 0的緩沖液，得到溶液A;將雙鏈結(jié)構(gòu)DNA溶 于pH值6.0 8.0的緩沖液，得到溶液A'，溶液A'與溶液A的濃度相同；將菁染 料溶解，再用pH值6. 0 8. 0的緩沖液稀釋，得到溶液B;
2) 將溶液A和溶液B混合，使混合液中待測DNA與菁染料分子的摩爾比大于 等于1.5小于等于4;將溶液A'和溶液B混合，使混合液中雙鏈結(jié)構(gòu)DNA與菁染 料分子的摩爾比大于等于1.5小于等于4，作為對(duì)照；避光條件下反應(yīng)，對(duì)兩種反 應(yīng)后溶液進(jìn)行紫外可見吸收光譜分析，如果待測DNA溶液菁染料單體特征峰(584nm ) 的峰值大于對(duì)照的1. 25倍，則待測DNA為G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA。
應(yīng)用菁染料，還可以通過如下方法檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA:
1) 將待測DNA溶于pH值6.0 8.0的緩沖液，得到溶液A;將菁染料溶解，再 用pH值6. 0 8. 0的緩沖液稀釋，得到溶液B;
2) 將溶液A和溶液B混合，使混合液中待測DNA與菁染料分子的摩爾比大于 等于0.5小于1.5，避光條件下反應(yīng)，對(duì)反應(yīng)后溶液進(jìn)行紫外可見吸收光譜分析， 如果菁染料單體特征峰(584nm)的峰值大于0. 1，則待測DNA為G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA。
應(yīng)用菁染料，還可以通過如下方法檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA:
1)將待測DNA溶于pH值6.0 8.0的緩沖液，得到溶液A;將菁染料溶解，再用pH值6. 0 8. 0的緩沖液稀釋，得到溶液B;
2)將溶液A和溶液B混合，使混合液中待測DNA與菁染料分子的摩爾比大于 等于0.5小于等于4;避光條件下反應(yīng)，對(duì)反應(yīng)后溶液進(jìn)行熒光光譜分析，如果待 測DNA溶液菁染料單體特征峰(600nm)的峰值為DNA濃度(u M)的3倍以上，則 待測DNA為G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA。
所述緩沖液具體可為磷酸緩沖液。
所述菁染料具體可用甲醇溶解。
所述避光反應(yīng)的時(shí)間具體可為9 15小時(shí)。
應(yīng)用菁染料，還可以通過如下方法檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA:
將待測DNA組裝到Au表面后放入如下菁染料溶液中，避光染色10-300分鐘后 取出Au片，用pH值6.0 8.0的緩沖液沖洗，再對(duì)該Au片進(jìn)行共聚焦激光掃描顯 微鏡檢測，所述共聚焦激光掃描顯微鏡檢測中所用的激發(fā)光波長為559mn，如果只 出現(xiàn)600-610nm的熒光，則待測DNA為G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA;所述菁染料溶液按照如 下方法配制將菁染料溶解，再用pH值為6.0 8.0的緩沖溶液稀釋，使菁染料分 子濃度為0.5-20 uM。
所述緩沖液具體可為磷酸緩沖液。
所述菁染料濃度為IO"M時(shí)，所述避光染色時(shí)間為1小時(shí)。 可通過任何常規(guī)方法將DNA組裝到Au片表面，如將待測DNA與巰基十一酸處 理后的Au片反應(yīng)。
菁染料由于其分子結(jié)構(gòu)的特殊性，具有如下性質(zhì) 1)在特定溶液中，可以依靠范德華力的作用形成聚集體。 在磷酸緩沖溶液體系中，菁染料聚集體與G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA相互作用較強(qiáng)，而 與典型的雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA的相互作用相對(duì)較弱。當(dāng)G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA與菁染料分子 的摩爾比大于等于1.5: l時(shí)，G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA可使菁染料從J-聚集體完全解聚 為單體。同時(shí)，在G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA與菁染料分子的摩爾比約為1.5: l時(shí)，可使 菁染料單體的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)80多倍。在雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA與菁染料分子的摩爾比大 于3: l的情況下，菁染料仍主要以J-聚集體的形式存在。同時(shí)，雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA 與染料分子的摩爾濃度比約為1.5: l時(shí)，只能使菁染料單體的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)30多 倍。因此，通過檢測菁染料聚集體與待測DNA相互作用后的熒光強(qiáng)度，能快捷有效 的識(shí)別待測DNA的結(jié)構(gòu)，判斷待測DNA是G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA還是雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA。
6雖然線性雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA與菁染料聚集體的相互作用較弱，但二者仍有一定的作用， 且作用效果和G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA類似。因此，必須控制溶液中待測DNA與菁染料聚 集體的摩爾比在(0.5-4) :1的范圍內(nèi)。
2)在與特定模板分子相互作用的過程中，菁染料很容易受到模板分子自身結(jié) 構(gòu)的影響，表現(xiàn)出不同的分子聚集狀態(tài)，形成具有不同結(jié)構(gòu)和特性的超分子體系。
組裝在金(Au)片表面的DNA與菁染料聚集體有一定的相互作用，能夠吸附菁 染料聚集體，而直接吸附在Au表面的菁染料聚集體則會(huì)被磷酸緩沖溶液沖洗掉。 因此，在共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)下用559nm的激光激發(fā)，Au片上只有組裝 了DNA的部分，才能看到菁染料分子的熒光。由于G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA與菁染料聚集 體的相互作用較大，能將菁染料由J-聚集體解聚為單體狀態(tài)，同時(shí)增強(qiáng)菁染料單體 的熒光強(qiáng)度，組裝有G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA的Au片在CLSM下觀察到的主要是菁染料單 體的熒光，其波長位于約600-610nm范圍內(nèi)，而線性雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA在一定的濃度 比例下不能解聚菁染料J-聚集體，雖然也能增強(qiáng)菁染料單體的熒光強(qiáng)度，但組裝有 雙螺旋DNA的Au片部分，在CLSM下觀察到的主要仍是菁染料J-聚集體的熒光，其 波長位于約660-670nm范圍內(nèi)。通過在CLSM下采集分波長的熒光圖像，即可判斷 待測DNA是G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA還是雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA。在界面對(duì)G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA 的識(shí)別過程中，用菁染料聚集體染色DNA的過程對(duì)于最終CLSM圖像的影響非常大， 不僅涉及菁染料聚集體與DNA之間的比例，還與菁染料聚集體吸附到Au表面的情 況有關(guān)。所以為了得到背景清晰，結(jié)果正確的識(shí)別結(jié)果，優(yōu)選使用10uM的菁染料 聚集體染色，染色時(shí)間為l小時(shí)。
由于溶液的酸堿性不僅會(huì)影響聚集體中染料單分子的排列模式，還會(huì)影響DNA 在溶液中及界面上的結(jié)構(gòu)及表面電荷的分布，所以本發(fā)明選用的磷酸緩沖溶液的pH 值應(yīng)控制在6. 0 8. 0。本發(fā)明采用在避光條件下進(jìn)行識(shí)別，這是由于染料對(duì)光極其 敏感，在光照射下很容易發(fā)生反應(yīng)，因此光照時(shí)間過長，會(huì)影響染料的光學(xué)性質(zhì)， 只有避光保存才能保證菁染料聚集體充分與DNA反應(yīng)。
本發(fā)明提供了菁染料在檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA中的新用途。應(yīng)用菁染料檢測 G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA，具有簡單、快捷、相對(duì)廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn)，克服了現(xiàn)有檢測技術(shù)周期 長、價(jià)格高昂、技術(shù)及設(shè)備要求高的缺陷。應(yīng)用菁染料檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA，通 過紫外可見吸收光譜、熒光光譜或共聚焦激光掃描顯微鏡能迅速識(shí)別出溶液中的 DNA樣品是G-四鏈體結(jié)構(gòu)還是線性的雙螺旋結(jié)構(gòu)。利用共聚焦激光掃描顯微鏡，還能直觀的標(biāo)記出組裝在Au表面的DNA樣品，不僅能識(shí)別DNA樣品的結(jié)構(gòu)，同時(shí)還 能標(biāo)記出DNA樣品在Au表面組裝的具體位置。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的方法的優(yōu)點(diǎn)在于
1) 能夠有效的在溶液體系與界面上識(shí)別不同的G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA，如人體端 粒DNA序列，主要是實(shí)現(xiàn)G-四鏈體與線性雙螺旋DNA之間的識(shí)別。
2) 按本發(fā)明提供的比例將DNA樣品與菁染料聚集體溶液混合，用簡單的光譜 學(xué)儀器，就能識(shí)別出DNA樣品的結(jié)構(gòu)。簡單快捷，成本低廉。
3) 按本發(fā)明的方法染色組裝在Au片上的DNA樣品，在CLSM下能直觀的識(shí)別 出DNA樣品的結(jié)構(gòu)。既可以用于器件的制作，也可以適用于較大規(guī)模的識(shí)別。
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。


圖1為實(shí)施例1中作為對(duì)照的檢測液丙的紫外可見吸收光譜
圖2為實(shí)施例1中檢測液甲的紫外可見吸收光譜
圖3為實(shí)施例1中檢測液乙的紫外可見吸收光譜
圖4為實(shí)施例1中作為對(duì)照的檢測液丙的熒光光譜
圖5為實(shí)施例1中檢測液甲的熒光光譜
圖6為實(shí)施例1中檢測液乙的熒光光譜
圖7為實(shí)施例2中檢測液甲的紫外可見吸收光譜
圖8為實(shí)施例2中檢測液乙的紫外可見吸收光譜
圖9為實(shí)施例2中檢測液甲的熒光光譜
圖10為實(shí)施例2中檢測液乙的熒光光譜
圖11為實(shí)施例3中檢測液甲的紫外可見吸收光譜
圖12為實(shí)施例3中檢測液乙的紫外可見吸收光譜
圖13為實(shí)施例3中檢測液甲的熒光光譜
圖14為實(shí)施例3中檢測液乙的熒光光譜
圖15為實(shí)施例4中菁染料聚集體與不同結(jié)構(gòu)DNA作用后的共聚焦激光掃描熒 光顯微鏡(CLSM)圖像
具體實(shí)施例方式
樣本l: G-四鏈體結(jié)構(gòu)的DNA樣品，序列為d (TTAGGG) 4,購自英駿生物技術(shù)有 限公司。將上述序列為d (TTAGGG) 4的寡聚DNA鏈適量溶解于磷酸緩沖液中，4°C
8靜置24小時(shí)即可得到樣本1。
樣本2:線性雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA樣品，序列為d (TTAGGG) 4/ (AATCCC) 4，該 樣品由兩條序列分別為d (TTAGGG) 4和d (AATCCC) 4的互補(bǔ)DNA鏈(均購自英駿生 物技術(shù)有限公司)自行合成。將適量上述兩條DNA鏈分別溶于磷酸緩沖液中，按摩 爾比l: 1混合后置于85'C水浴中保溫15分鐘，緩慢冷卻至室溫后4r靜置24小 時(shí)即可得到樣本2。
樣本3: : G-四鏈體結(jié)構(gòu)的DNA樣品，序列為d (TTAGGG) 4-朋2，購自英駿生物 技術(shù)有限公司。將上述序列為d (TTAGGG) rNH2的寡聚DNA鏈適量溶解于磷酸緩沖 液中，4'C靜置24小時(shí)即可得到樣本3。
樣本4:線性雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA樣品，序列為d (TTAGGG) 4-NH2/ (AATCCC) 4， 該樣品由兩條序列分別為d (TTAGGG) 4-NHjB d (AATCCC) 4的互補(bǔ)DNA鏈(均購自 英駿生物技術(shù)有限公司)自行合成。將適量上述兩條DNA鏈分別溶于磷酸緩沖液中， 按摩爾比1: 1混合后置于85'C水浴中保溫15分鐘，緩慢冷卻至室溫后4"C靜置24 小時(shí)即可得到樣本4。
以下實(shí)施例中所用的菁染料的具體制備方法如下(參見文獻(xiàn)Hamer， F. M. 77 e
CAe/zu.sz^ry a/"/feterocyc7ic Co/H/ o朋僅Interscience: New York， 1964; Vol. 18. 及Ficken， G. E. T力e C力e/z isfr7 o/^5yy7f力etic "yes; Academic Press: New York,
<formula>formula see original document page 9</formula>以上合成路線所用原料，均可購自Sigma公司。 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。 實(shí)施例1、 G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA的檢測
1、 制備反應(yīng)液
1) 溶液甲
在2ml容量瓶中加入40 uL 200.0 "M的菁染料的甲醇(優(yōu)級(jí)純)溶液；加入 60uL 200 uM的樣本l的磷酸緩沖溶液(pH 6.0)，用磷酸緩沖液(pH 6.0)定 容，混勻，得到溶液甲。溶液甲中，樣本l DNA與菁染料的摩爾比為1.5: 1。
2) 溶液乙
在2ml容量瓶中加入40 uL 200.0 ^M的菁染料的甲醇(優(yōu)級(jí)純)溶液；加入 60uL 200 WM的樣本2的磷酸緩沖溶液(pH 6.0)，用磷酸緩沖液(pH 6.0)定 容，混勻，得到溶液乙。溶液乙中，樣本2 DNA與菁染料的摩爾比為1.5: 1。
3) 溶液丙
在2ml容量瓶中加入40 "L 200.0 uM的菁染料的甲醇(優(yōu)級(jí)純)溶液，用磷 酸緩沖液(PH 6.0)定容，混勻，得到溶液丙，作為對(duì)照。
2、 檢測
溶液甲、溶液乙和溶液丙中菁染料的濃度均為4 uM。避光反應(yīng)12小時(shí)，得到 檢測液甲、檢測液乙和檢測液丙。 1)紫外可見吸收光譜分析
將檢測液進(jìn)行紫外可見吸收光譜分析，測液丙的紫外可見吸收光譜見圖1，檢 測液甲的紫外可見吸收光譜見圖2，檢測液乙的紫外可見吸收光譜見圖3。 由圖可見，結(jié)果如下
檢測液丙(沒有DNA)的吸收譜上只有菁染料聚集體的吸收峰(659.5nm)，強(qiáng) 度為0. 917;檢測液甲(含有G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA)的吸收譜上菁染料聚集體的特征峰 (659.5nm)消失(小于0.01);檢測液乙(含有雙鏈結(jié)構(gòu)DNA)的吸收譜上菁染料 聚集體的吸收峰(659.5nm)強(qiáng)度為0.755。
檢測液丙(沒有DNA)的吸收譜上沒有出現(xiàn)菁染料單體的特征峰(584nm);檢 測液甲(含有四鏈體結(jié)構(gòu)DNA)的吸收譜上菁染料單體的特征峰(584nm)強(qiáng)度為 0. 1482;檢測液乙(含有雙鏈結(jié)構(gòu)DNA)的吸收譜上菁染料單體的特征峰(584nm)強(qiáng) 度為0.1165。2)熒光光譜分析
將檢測液進(jìn)行熒光光譜分析，測液丙的熒光光譜見圖4，檢測液甲的熒光光譜 見圖5，檢測液乙的熒光光譜見圖6。 由圖可見，結(jié)果如下
檢測液丙(沒有DNA)的發(fā)射熒光光譜上只有菁染料聚集體的熒光發(fā)射峰 (662nm)，強(qiáng)度為0.647，而沒有菁染料單體的熒光發(fā)射峰(600nm);檢測液甲 (含有G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA)的熒光光譜上出現(xiàn)很強(qiáng)的菁染料單體熒光發(fā)射峰 (600nm)，強(qiáng)度為22. 83;檢測液乙(含有雙鏈結(jié)構(gòu)DNA)的熒光光譜上出現(xiàn)較弱 的菁染料單體熒光發(fā)射峰(600nm)，強(qiáng)度為8. 576。
3、結(jié)果分析
進(jìn)行紫外可見吸收光譜分析時(shí)，當(dāng)溶液中沒有DNA樣品時(shí)，菁染料呈聚集體狀 態(tài)，只有聚集體的吸收峰(659.5nm)，不會(huì)出現(xiàn)單體的峰(584nm)。當(dāng)加入G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA時(shí)，菁染料與G-四鏈體結(jié)構(gòu)的DNA發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，由聚集體 狀態(tài)轉(zhuǎn)為單體狀態(tài)，聚集體的峰消失，出現(xiàn)單體峰。當(dāng)加入雙鏈結(jié)構(gòu)DNA時(shí)，只有
少部分菁染料由聚集體狀態(tài)轉(zhuǎn)為單體狀態(tài)，聚集體的吸收峰強(qiáng)度稍有下降，同時(shí)出 現(xiàn)單體吸收峰。
進(jìn)行熒光光譜分析時(shí)，當(dāng)溶液中沒有DNA樣品時(shí)，菁染料呈聚集體狀態(tài)，只有 聚集體的熒光發(fā)射峰(662nm)，不會(huì)出現(xiàn)單體的峰(600nm)。當(dāng)加入G-四鏈體結(jié) 構(gòu)DNA時(shí)，菁染料與G-四鏈體結(jié)構(gòu)的DNA發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，由聚集體狀態(tài)轉(zhuǎn)為 單體狀態(tài)，出現(xiàn)很強(qiáng)的單體熒光發(fā)射峰。當(dāng)加入雙鏈結(jié)構(gòu)DNA時(shí)，只有少部分菁染 料由聚集體狀態(tài)轉(zhuǎn)為單體狀態(tài)，因此只出現(xiàn)較弱的單體熒光發(fā)射峰。
實(shí)施例2、 G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA的檢測
1、制備反應(yīng)液
1) 溶液甲
在2ml容量瓶中加入40uL 200.0 uM的菁染料的甲醇溶液；加入20n L200 uM 的樣本l的磷酸緩沖溶液(pH6.0)，用磷酸緩沖液(pH6.0)定容，混勻，得到 溶液甲。溶液甲中，樣本l DNA與菁染料的摩爾比為0.5: 1。
2) 溶液乙
在2ml容量瓶中加入40 uL 200.0 w M的菁染料的甲醇溶液；加入20 u L 200 uM 的樣本2的磷酸緩沖溶液(pH6.0)，用磷酸緩沖液(pH6.0)定容，混勻，得到溶液乙。溶液乙中，樣本2 DNA與菁染料的摩爾比為0.5: 1。 3)溶液丙
在2ml容量瓶中加入40 uL 200.0 u M的菁染料分子的甲醇溶液，用磷酸緩沖 液(pH 6.0)定容，混勻，得到溶液丙，作為對(duì)照。 2、檢測
溶液甲、溶液乙和溶液丙中菁染料的濃度均為4 PM。避光反應(yīng)9小時(shí)，得到 檢測液甲、檢測液乙和檢測液丙。
1) 紫外可見吸收光譜分析
將檢測液進(jìn)行紫外可見吸收光譜分析，檢測液丙的紫外可見吸收光譜圖同實(shí)施 例1中的檢測液丙的紫外可見吸收光譜圖，檢測液甲的紫外可見吸收光譜見圖7， 檢測液乙的紫外可見吸收光譜見圖8。
由圖可見，結(jié)果如下
檢測液丙(沒有DNA)的吸收譜上只有菁染料聚集體的吸收峰(659.5nm)，強(qiáng) 度為0. 917;檢測液甲(含有四鏈體結(jié)構(gòu)DNA)的吸收譜上菁染料聚集體的特征峰
(659.5nm)明顯減弱，強(qiáng)度為0. 5483;檢測液乙(雙鏈結(jié)構(gòu)DNA)的吸收譜上菁染 料聚集體的吸收峰(659.5nm)強(qiáng)度基本沒有發(fā)生變化，為0.921。
檢測液丙(沒有DNA)的吸收譜上沒有出現(xiàn)菁染料單體的特征峰(584mn);檢 測液甲(四鏈體結(jié)構(gòu)DNA)的吸收譜上菁染料單體的特征峰(584nm)強(qiáng)度為0. 1029; 檢測液乙(雙鏈結(jié)構(gòu)DNA)的吸收譜上沒有出現(xiàn)菁染料單體的特征峰(584nm)。
2) 熒光光譜分析
將檢測液進(jìn)行熒光光譜分析，檢測液丙的熒光光譜圖同實(shí)施例1中的檢測液丙 的熒光光譜圖，檢測液甲的熒光光譜見圖9，檢測液乙的熒光光譜見圖10。 由圖可見，結(jié)果如下
檢測液丙(沒有DNA)的發(fā)射熒光光譜上只有菁染料聚集體的熒光發(fā)射峰 (662nm)，強(qiáng)度為0.647，而沒有菁染料單體的熒光發(fā)射峰(600nm);檢測液甲 (含有G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA)的熒光光譜上出現(xiàn)菁染料單體熒光發(fā)射峰(600nm)， 強(qiáng)度為8.585;檢測液乙(含有雙鏈結(jié)構(gòu)DNA)的熒光光譜上出現(xiàn)較弱的菁染料單 體熒光發(fā)射峰(600nm)，強(qiáng)度為1. 737。 實(shí)施例3、 G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA的檢測 1、制備反應(yīng)液1) 溶液甲
在2ml容量瓶中加入40 u L 200. 0 u M的菁染料的純甲醇溶液；加入160 u L 200 uM的樣本l的磷酸緩沖溶液(pH 8.0)，用磷酸緩沖液(pH 6.0)定容，混勻， 得到溶液甲。溶液甲中，樣本l DNA與菁染料的摩爾比為4: 1。
2) 溶液乙
在2ml容量瓶中加入40 u L 200. 0 u M的菁染料的純甲醇溶液；加入160 y L 200 !iM的樣本2的磷酸緩沖溶液(pH 8.0)，用磷酸緩沖液(pH 6.0)定容，混勻， 得到溶液乙。溶液乙中，樣本2 DNA與菁染料的摩爾比為4: 1。
3) 溶液丙
在2ml容量瓶中加入40 uL 200.0 y M的菁染料分子的純甲醇溶液，用磷酸緩 沖液(pH 8.0)定容，混勻，得到溶液丙，作為對(duì)照。 2、檢測
溶液甲、溶液乙和溶液丙中菁染料的濃度均為4 uM。避光反應(yīng)15小時(shí)，得到 檢測液甲、檢測液乙和檢測液丙。
1) 紫外可見吸收光譜分析
將檢測液進(jìn)行紫外可見吸收光譜分析，檢測液丙的紫外可見吸收光譜圖同實(shí)施 例1中的檢測液丙的紫外可見吸收光譜圖，檢測液甲的紫外可見吸收光譜見圖11， 檢測液乙的紫外可見吸收光譜見圖12。
由圖可見，結(jié)果如下
檢測液丙(沒有DNA)的吸收譜上只有菁染料聚集體的吸收峰(659.5nm);檢 測液甲(四鏈體結(jié)構(gòu)DNA)的吸收譜上菁染料聚集體的特征峰(659.5nm)消失；檢測 液乙(雙鏈結(jié)構(gòu)DNA)的吸收譜上菁染料聚集體的吸收峰(659.5nm)強(qiáng)度稍有降低， 為0. 6238。
檢測液丙(沒有DNA)的吸收譜上沒有出現(xiàn)菁染料單體的特征峰(584nm);檢 測液甲(四鏈體結(jié)構(gòu)DNA)的吸收譜上菁染料單體的特征峰(584rnn)強(qiáng)度為0. 3079; 檢測液乙(雙鏈結(jié)構(gòu)DNA)的吸收譜上菁染料單體的特征峰(584nm)強(qiáng)度為0. 1494。
2) 熒光光譜分析
將檢測液進(jìn)行熒光光譜分析，檢測液丙的熒光光譜圖同實(shí)施例1中的檢測液丙 的熒光光譜圖，檢測液甲的熒光光譜見圖13，檢測液乙的熒光光譜見圖14。 由圖可見，結(jié)果如下檢測液丙(沒有DNA)的發(fā)射熒光光譜上只有菁染料聚集體的熒光發(fā)射峰 (662nm)，強(qiáng)度為0.647，而沒有菁染料單體的熒光發(fā)射峰(600nm);檢測液甲 (含有G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA)的熒光光譜上出現(xiàn)極強(qiáng)的菁染料單體熒光發(fā)射峰 (600nm)，強(qiáng)度為51. 56;檢測液乙(含有雙鏈結(jié)構(gòu)DNA)的熒光光譜上出現(xiàn)相對(duì) 較弱的菁染料單體熒光發(fā)射峰(600nm)，強(qiáng)度為22. 5。
實(shí)施例4、 G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA的檢測
1) 將樣本3和樣本4分別與巰基十一酸處理過的Au片反應(yīng)，使DNA分別組裝 到Au片表面，得到Au片甲和Au片乙；
2) 將處理好的Au片放入濃度為10 uM的菁染料磷酸緩沖溶液(pH 6.0)中 常溫下避光染色1小時(shí)；
3) 取出Au片后用磷酸緩沖液反復(fù)沖洗，洗掉直接吸附到Au片表面的菁染料
聚集體；
4) 用氮?dú)獯登Ш髮u片放到共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)下，用559nm的 激光激發(fā)菁染料分子的熒光，并分波長的接收菁染料分子的發(fā)射熒光圖像。
見圖15，從CLSM熒光圖像上可以很清楚的看到菁染料聚集體標(biāo)記出了 Au片表 面組裝有DNA樣品的部分，并且能夠識(shí)別出組裝在Au片表面的不同結(jié)構(gòu)的DNA樣 cm o
實(shí)施例5、 G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA的檢測
1) 將樣本3和樣本4分別與巰基十一酸處理過的Au片反應(yīng)，使DNA分別組裝 到Au片表面，得到Au片甲和Au片乙；
2) 將處理好的Au片放入濃度為0. 5 WM的菁染料磷酸緩沖溶液(PH6.0)中 常溫下避光染色I(xiàn)O分鐘；
3) 取出Au片后用磷酸緩沖液反復(fù)沖洗，洗掉直接吸附到Au片表面的菁染料 聚集體；
4) 用氮?dú)獯蹈珊髮u片放到共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)下，用559nm的 激光激發(fā)菁染料分子的熒光，并分波長的接收菁染料分子的發(fā)射熒光圖像。
從CLSM熒光圖像上可以很清楚的看到菁染料聚集體標(biāo)記出了 Au片表面組裝有 DNA樣品的部分，并且能夠識(shí)別出組裝在Au片表面的不同結(jié)構(gòu)的DNA樣品。 實(shí)施例6、 G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA的檢測
1)將樣本3和樣本4分別與巰基十一酸處理過的Au片反應(yīng)，使DNA分別組裝到Au片表面，得到Au片甲和Au片乙；
2) 將處理好的Au片放入濃度為20 UM的菁染料磷酸緩沖溶液(PH 6.0)中 常溫下避光染色300分鐘；
3) 取出Au片后用磷酸緩沖液反復(fù)沖洗，洗掉直接吸附到Au片表面的菁染料 聚集體；
4) 用氮?dú)獯蹈珊髮u片放到共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)下，用559nm的 激光激發(fā)菁染料分子的熒光，并分波長的接收菁染料分子的發(fā)射熒光圖像。
從CLSM熒光圖像上可以很清楚的看到菁染料聚集體標(biāo)記出了 Au片表面組裝有 DNA樣品的部分，并且能夠識(shí)別出組裝在Au片表面的不同結(jié)構(gòu)的DNA樣品。
權(quán)利要求
1、菁染料在檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA中的應(yīng)用。
2、 如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用中，通過如下方法檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA:1) 將待測DNA溶于pH值6.0 8.0的緩沖液，得到溶液A;將菁染料溶解，再用 pH值6. 0 8. 0的緩沖液稀釋，得到溶液B;2) 將溶液A和溶液B混合，使混合液中待測DNA與菁染料分子的摩爾比大于等 于1.5小于等于4，避光條件下反應(yīng)，對(duì)反應(yīng)后溶液進(jìn)行紫外可見吸收光譜分析，如 果菁染料聚集體特征峰的峰值小于0. 01，則待測DNA為G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA。
3、 如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用中，通過如下方法檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA:1) 將待測DNA溶于pH值6. 0 8. 0的緩沖液，得到溶液A;將雙鏈結(jié)構(gòu)DNA溶于 pH值6.0 8.0的緩沖液，得到溶液A'，溶液A'與溶液A的濃度相同；將菁染料溶 解，再用pH值6.0 8.0的緩沖液稀釋，得到溶液B;2) 將溶液A和溶液B混合，使混合液中待測DNA與菁染料分子的摩爾比大于等 于0.5小于1.5;將溶液A'和溶液B混合，使混合液中雙鏈結(jié)構(gòu)DNA與菁染料分子 的摩爾比大于等于0.5小于1.5，作為對(duì)照；避光條件下反應(yīng)，對(duì)兩種反應(yīng)后溶液進(jìn) 行紫外可見吸收光譜分析，如果待測DNA溶液菁染料聚集體特征峰的峰值小于對(duì)照的 0.6倍，則待測DNA為G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA。
4、 如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用中，通過如下方法檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA:1) 將待測DNA溶于pH值6. 0~8. 0的緩沖液，得到溶液A;將雙鏈結(jié)構(gòu)DNA溶于 pH值6.0 8.0的緩沖液，得到溶液A'，溶液A'與溶液A的濃度相同；將菁染料溶 解，再用pH值6.0 8.0的緩沖液稀釋，得到溶液B;2) 將溶液A和溶液B混合，使混合液中待測DNA與菁染料分子的摩爾比大于等 于1.5小于等于4;將溶液A'和溶液B混合，使混合液中雙鏈結(jié)構(gòu)DNA與菁染料分 子的摩爾比大于等于1.5小于等于4，作為對(duì)照；避光條件下反應(yīng)，對(duì)兩種反應(yīng)后溶 液進(jìn)行紫外可見吸收光譜分析，如果待測DNA溶液菁染料單體特征峰的峰值大于對(duì)照 的1. 25倍，則待測DNA為G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA。
5、 如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用中，通過如下方法檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA:1) 將待測DNA溶于pH值6.0 8.0的緩沖液，得到溶液A;將菁染料溶解，再用 pH值6. 0 8. 0的緩沖液稀釋，得到溶液B;2) 將溶液A和溶液B混合，使混合液中待測DNA與菁染料分子的摩爾比大于等 于0.5小于1.5，避光條件下反應(yīng)，對(duì)反應(yīng)后溶液進(jìn)行紫外可見吸收光譜分析，如過 菁染料單體特征峰的峰值大于0. 1，則待測DNA為G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA。
6、 如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用中，通過如下方法檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA:1) 將待測DNA溶于pH值6.0 8.0的緩沖液，得到溶液A;將菁染料溶解，再用 pH值6. 0 8. 0的緩沖液稀釋，得到溶液B;2) 將溶液A和溶液B混合，使混合液中待測DNA與菁染料分子的摩爾比大于等 于0.5小于等于4;避光條件下反應(yīng)，對(duì)反應(yīng)后溶液進(jìn)行熒光光譜分析，如果待測DNA 溶液菁染料單體特征峰的峰值為DNA濃度的3倍以上，則待測DNA為G-四鏈體結(jié)構(gòu) DNA;所述DNA濃度的單位為^M。
7、 如權(quán)利要求2-6中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述緩沖液為磷酸緩沖液； 所述菁染料用甲醇溶解。
8、 如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用中，通過如下方法檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA:將待測DNA組裝到Au表面后放入如下菁染料溶液中，避光染色10-300分鐘后取 出Au片，用pH值6.0 8.0的緩沖液沖洗，再對(duì)該Au片進(jìn)行共聚焦激光掃描顯微鏡 檢測，所述共聚焦激光掃描顯微鏡檢測中所用的激發(fā)光波長為559nm，如果只出現(xiàn) 600-610nm的熒光，則待測DNA為G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA;所述菁染料溶液按照如下方法 配制將菁染料溶解，再用pH值為6.0 8.0的緩沖溶液稀釋，使菁染料分子濃度為 0.5-20 uM。
9、 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述緩沖液為磷酸緩沖液；所述菁 染料濃度為10nM時(shí)，所述避光染色時(shí)間為1小時(shí)。
10、 如權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于所述待測DNA是通過與用巰基 十一酸處理過的Au片反應(yīng)組裝到Au表面的。
全文摘要
本發(fā)明提供了菁染料在檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA中的新用途。應(yīng)用菁染料檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA，具有簡單、快捷、相對(duì)廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn)，克服了現(xiàn)有檢測技術(shù)周期長、價(jià)格高昂、技術(shù)及設(shè)備要求高的缺陷。應(yīng)用菁染料檢測G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA，通過紫外可見吸收光譜、熒光光譜或共聚焦激光掃描顯微鏡就能迅速識(shí)別出溶液中的DNA樣品是G-四鏈體結(jié)構(gòu)還是線性的雙螺旋結(jié)構(gòu)。利用共聚焦激光掃描顯微鏡，還能直觀的標(biāo)記出組裝在Au表面的DNA樣品，不僅能識(shí)別DNA樣品的結(jié)構(gòu)，同時(shí)還能標(biāo)記出DNA樣品在Au表面組裝的具體位置。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101587066SQ20081011239
公開日2009年11月25日 申請(qǐng)日期2008年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月23日
發(fā)明者向俊鋒, 唐亞林, 徐廣智, 楊千帆 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院化學(xué)研究所