欧美在线观看视频网站,亚洲熟妇色自偷自拍另类,啪啪伊人网,中文字幕第13亚洲另类,中文成人久久久久影院免费观看 ,精品人妻人人做人人爽,亚洲a视频

檢測牛羊感染細(xì)菌的基因芯片、制備及檢測方法、試劑盒的制作方法

文檔序號:565277閱讀:279來源:國知局

專利名稱::檢測牛羊感染細(xì)菌的基因芯片、制備及檢測方法、試劑盒的制作方法檢測牛羊感染細(xì)菌的基因芯片、制備及檢測方法、試劑盒技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及生物檢測
技術(shù)領(lǐng)域
,具體涉及檢瀕牛羊感染細(xì)菌病原體的基因芯片、芯片的制備方法、檢洲方法和檢淵用試劑盒。牛布氏病、綿羊布氏病、山羊布氏病、牛結(jié)核病、人結(jié)核病是世界各國動物檢疫部門重點防范的動物傳染病及人畜共患病,我國質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫局也將其列為牛羊?qū)賱游锍鋈刖硻z驗檢疫的必檢疫病。隨著大型動物及相關(guān)制品的國際貿(mào)易日益頻繁,相應(yīng)的病原徵生物檢淵技術(shù)應(yīng)運而生。常規(guī)技術(shù)包括微生物培養(yǎng)技術(shù)、免疫技術(shù)、PCR技術(shù)等,盡管這些檢測技術(shù)已發(fā)揮了巨大的作用,但仍存在如下缺陷徵生物培養(yǎng)技術(shù)繁瑣而費時;免疫技術(shù)要有特異性強的抗血清PCR技術(shù)本身的優(yōu)越性無可厚非,但反應(yīng)條件控制不當(dāng)很容易引起交叉污染,出現(xiàn)假陽性。這些缺陷的存在使得常規(guī)的檢測方法無法適應(yīng)動物疫病檢擁快速、準(zhǔn)確、髙通量的要求,新的動物疫病檢測方法的開發(fā)已迫在眉睫。病原微生物基因組計劃的突破性進(jìn)展使得從基因水平檢測病原徵生物感染成為可能,近幾年發(fā)展起來的生物芯片技術(shù)更是為病原微生物的基因檢擁提供了強有力的手段。生物芯片技術(shù)是具有微型化、高通量、并行處理及易于自動化等優(yōu)勢的前沿生物技術(shù),它將大量的靶基因片段高密度、有序地排列在玻片、硅片等載體上,用相應(yīng)的檢湖手段檢測后,通過計算機軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)比較和分析,一次試驗就可對上萬種基因進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、高效的檢測.
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種檢擁牛羊感染細(xì)菌病原體的基因芯片,以彌補傳統(tǒng)的檢測方法技術(shù)存在的不足。本發(fā)明的另一個目的是提供檢測牛羊感染細(xì)菌病原體的基因芯片的制備方法。本發(fā)明的更進(jìn)一步的目的是提供一種利用上述基因芯片來快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測牛羊感染細(xì)菌病原體的方法。本發(fā)明還有一個目的是提供用于檢測牛羊感染細(xì)菌病原體的試劑盒。為達(dá)到上述的目的,本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明的檢測牛羊感染細(xì)菌病原體的基因芯片,包括固相載體和固定在該載體上的寡聚核苷酸探針,其中寡聚核苷酸探針包括檢測探針和質(zhì)量控制探針,芯片樣品點的布局為低密度布局,樣品點少于200個;所述的寡聚核苷酸檢測探針是從牛布魯氏桿菌、山羊布魯氏桿菌、綿羊布魯氏桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌和人結(jié)核分枝桿菌中的至少一種細(xì)菌基因組對應(yīng)的核苷酸序列中選取的DNA片段。其中一個優(yōu)選的技術(shù)方案是所述的寡聚核苷酸檢測探針包括從牛布魯氏桿菌、山羊布魯氏桿菌、綿羊布魯氏桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌和人結(jié)核分枝桿菌基因組對應(yīng)的核苷酸序列中選取的DNA片段。本發(fā)明技術(shù)方案中所述的檢測探針分別具有以下序列:從牛布魯氏桿菌基因組的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如序列表中SEQIDN0:6所示的堿基序列;從山羊布魯氏桿菌基因組的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如序列表中SEQIDN0:7所示的堿基序列;從綿羊布魯氏桿菌基因組的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如序列表中的SEQIDN0:8所示的堿基序列;從牛結(jié)核分枝桿菌基因組的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如序列表中SEQIDN0:9所示的堿基序列;從人結(jié)核分枝桿菌基因組的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如序列表中SEQIDN0:10所示的堿基序列。本發(fā)明制備檢測牛羊傳染病細(xì)菌的基因芯片的方法,包括以下的步驟(1)探針的設(shè)計經(jīng)Genbank檢索,BLAST序列比對分別得到牛布魯氏桿菌、山羊布魯氏桿菌、綿羊布魯氏桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌和人結(jié)核分枝桿菌基因組對應(yīng)的核苷酸序列中的相對保守區(qū),作為靶序列,依據(jù)探針設(shè)計原則,采用PrimerPremier5.0和01igo6.0軟件,在此保守區(qū)內(nèi)分別設(shè)計針對病原體的特異性的檢測探針;(2)檢測探針的合成由專門的生物公司合成上述設(shè)計好的探針片段序列;(3)芯片的制備包括切膜、貼膜,然后將上述得到的檢測探針點膜,紫外交聯(lián)10分鐘,再經(jīng)存膜即得芯片。其中點膜后得樣品點直徑在200ura—1000um。上述基因芯片的制備方法中,所述的相對保守區(qū)的序列如下牛布魯氏桿菌基因組核苷酸序列中的相對保守區(qū)具有如序列表中SEQIDN0:1所示的堿基序列;山羊布魯氏桿菌基因組核苷酸序列中的相對保守區(qū)具有如序列表中SEQIDNO:2所示的堿基序列;綿羊布魯氏桿菌基因組核苷酸序列中的相對保守區(qū)具有如序列表中SEQIDN0:3所示的堿基序列;牛結(jié)核分枝桿菌基因組核苷酸序列中的相對保守區(qū)具有如序列表中SEQIDN0:4所示的堿基序列;人結(jié)核分枝桿菌基因組核苷酸序列中的相對保守區(qū)具有如序列表中SEQIDN0:5所示的堿基序列。所述檢測探針即為上述牛布魯氏桿菌、山羊布魯氏桿菌、綿羊布魯氏桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌和人結(jié)核分枝桿菌基因組對應(yīng)的核苷酸序列中選取的DNA片段。其序列分別如下從牛布魯氏桿菌基因組的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如序列表中SEQIDN0:6所示的堿基序列;從山羊布魯氏桿菌基因組的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如序列表中SEQIDN0:7所示的堿基序列;從綿羊布魯氏桿菌基因組的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如序列表中SEQIDN0:8所示的堿基序列;從牛結(jié)核分枝桿菌基因組的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如序列表中SEQIDN0:9所示的堿基序列;從人結(jié)核分枝桿菌基因組的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如序列表中SEQIDNO:IO所示的堿基序列。本發(fā)明牛羊感染細(xì)菌病原體的檢測方法包括以下的歩驟(1)待測樣本處理采用常規(guī)方法提取待測樣品的DNA,進(jìn)行標(biāo)記PCR擴增;(2)雜交顯色;將歩驟(1)得到的標(biāo)記后的PCR產(chǎn)物和權(quán)利要求1、2或3所述的基因芯片進(jìn)行雜交,然后顯色;(3)結(jié)果閱讀與分析利用生物芯片閱讀儀獲取雜交信號并分析鑒定雜交結(jié)果。由于步驟.(i)中提取的餘觀胖品的DNA^i總氐,必須針對^n^列ffl^HarcRrif,^Bi4行^。根據(jù)J^相對保守區(qū)的麻ij,即,U,設(shè)計以下引物用于標(biāo)記PCR擴增擴增SEQIDN0:1所用的一對引物的序列如序列表中的SEQIDNO:11和NO:12所示;擴增SEQIDNO:2所用的一對引物的序列如序列表中的SEQIDNO:13和NO:14所示;擴增SEQIDN0:3所用的一對引物的序列如序列表中的SEQIDNO:15和NO:16所示;擴增SEQIDNO:4所用的一對引物的序列如序列表中的SEQIDN0:17和N0:18所示;擴增SEQIDN0:5所用的一對引物的序列如序列表中的SEQIDN0:19和N0:20所示。本發(fā)明的用于檢測牛羊感染細(xì)菌病原體的試劑盒,包括上述基因芯片、待測樣品處理試劑、雜交和顯色試劑,以及說明書。本發(fā)明具體的實施方案如下一、基因芯片的制備1、檢測探針的設(shè)計和合成(1)檢測探針的設(shè)計經(jīng)Genbank檢索,BLAST序列比對分別得到牛布魯氏桿菌、山羊布魯氏桿菌、綿羊布魯氏桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌和人結(jié)核分枝桿菌基因組對應(yīng)的核苷酸序列中的相對保守區(qū),作為靶序列,依據(jù)探針設(shè)計原則,采用PrimerPremier5.0和0.igo6.0軟件,在此保守區(qū)內(nèi)分別設(shè)計針對病原體的特異性的檢測探針,所述的檢測探針分別具有如下所述的序列牛布魯氏桿菌的檢測探針為序列表中SEQIDN0:6所示的堿基序列,山羊布魯氏桿菌的檢測探針為序列表中SEQIDN0:7所示的堿基序列,綿羊布魯氏桿菌的檢測探針為序列表中SEQIDN0:8所示的堿基序列,牛結(jié)核分枝桿菌的檢測探針為序列表中SEQIDN0:9所示的堿基序列,人結(jié)核分枝桿菌的檢測探針為序列表中SEQIDN0:10所示的堿基序列;(2)檢測探針的合成由專門的生物公司合成上述設(shè)計好的探針片段序列。得到探針片段后,配置探針溶液,準(zhǔn)備芯片點樣。2、芯片的制備(1)切膜選用合適的硝酸纖維素膜,于切膜機中準(zhǔn)確裁剪成方形芯片。規(guī)格1.5cmX1.5crao(2)貼膜將芯片用膠固定于1.5cmXl.5cm芯片方皿中,使之緊貼芯片方皿底部,放置2溯,臓固后,芯片平^于芯片方鵬部,在芯片方皿的邊mi:作一定向標(biāo)志鄉(xiāng)號。(3)點膜:對探針分布進(jìn)行合理布局,設(shè)質(zhì)控點。再將已配制好的探針溶液逐個加入與已布局好的點樣針相應(yīng)位置的探針盤孔中。每種探針點兩針,點樣時將點樣儀推拉桿推到吸樣位置,點樣針與探針盤孔對準(zhǔn),按下頂部按鈕,吸取探針(樣品)液,停留3-5秒,吸樣完畢,放松按鈕,點樣針架自動彈起。然后將點樣儀推拉桿推到點樣位置,此時己吸液的點樣針對準(zhǔn)芯片方皿中的膜片,按下按鈕,停留3-5秒,放松按鈕,點樣針架自動彈起。重復(fù)此操作l-3次,點樣完畢。(4)存膜點樣完畢,待芯片自然千燥,將芯片方皿敬體外:kTT照浙10溯,繊4C保存。(5)芯片布局如圖1質(zhì)控主要指從芯片制備到樣本處理,'到雜交掃j^環(huán)節(jié)的監(jiān)控,目前主要的控制包括:1)點樣過程質(zhì)控用于監(jiān)控點樣過程,采用有色染料,該染料在芯片雜交過程中將被洗掉,因而不會對芯片檢獮結(jié)果造成影響;2)雜5LR控用生物素點于芯片上,監(jiān)控顯色過程;3)空白對照是不含任何基因片段的空白點樣液,作為芯片制備過程中的污染監(jiān)控指標(biāo)。本實驗中采用1倍的點樣緩沖液4)陰性內(nèi)參(質(zhì)控探針)是一段與檢測基因沒有同源性的其他基因片段,作為雜交過程中非特異性雜交的監(jiān)控指標(biāo);陰性內(nèi)參探針序列為5'-CTGGCGAATCTGAATGCAGnTAACGGCTCAACCAAGTTGAACTCAGACGC-3'(序列表中的SEQIDNO:22),由專門的生物公司合成上述探針片段序列。5)陽性內(nèi)參(質(zhì)控探針〉是一段與檢測基因沒有同源性的其他基因片段,在5種常見病原體引物擴塌的同時可以擴增該序列片段,作為PCR擴増過程中的對照,主要用于pcR擴増標(biāo)記過程的監(jiān)控。本^it^&片^mm^Hf^i偽5'-TTTGGGGTGCTTGArGAACAATTACArCGTAATAGGGGCTACAGAGATAGA-3'(序列表中的SEQIDNO:21),由專門的生物公司合成上述探針片段序列。二、芯片的使用方法以下,aii基因芯片在檢測牛羊感染細(xì)菌病原體的試劑盒中的使用,進(jìn)一步詳細(xì)說明牛羊感染細(xì)菌病原體的檢測方法。1、試劑盒組成(1)樣本處理試劑細(xì)苗處理液l:4%NaOH302ml;細(xì)茵處理液2:滅菌生理&^25mh細(xì)菌處理液3:0兩厶提取液1.261011(2)PCR體系組分PCR反應(yīng)液1:PCR虹XIIOOjiL,包括引物、生旨、dAT、dTT、dCTP、dGTP、dUTP、10XPCRbuffer、無菌^fe(C嗨1:T叫酶4pL+UNG酶(尿瞎啶DNA糖基化籌)24iLPCR陰性對照(超純水,用MilliQ純水儀制備)lnlX3管PCR陽性對照(牛布備氏桿菌、山羊布備氏桿苗、綿羊布番氏桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌、人結(jié)核分枝桿菌五種細(xì)菌質(zhì)粒的混合物〉:'larX3貧。陽性對照制備的方法如下牛肉湯培養(yǎng)基的準(zhǔn)備將10g蛋白胨、5g氣化鈉、3g牛肉裔溶解在1升水中,用10%絲氣化鈉將其班調(diào)至7.0,分裝,121X:滅菌20分鐘,備用。以下,以牛布備氏桿菌為例說明陽性對照制備的過程牛布魯氏桿苗樣品進(jìn)行PCR擴增,所得的PCR,(^!|)細(xì)市糊多雄DNA純化i^iicafcfi^化,純^WW^鵬在預(yù)先用紫外燈照射30分鐘的生物安全柜中,用接種環(huán)將大腸桿茵接種在無菌的牛肉湯培養(yǎng)基中,220轉(zhuǎn)/分鐘,37",培養(yǎng)過夜,將培養(yǎng)過夜的菌液收集后,采用質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取。將所得各質(zhì)粒分別用紫外分光光度計定量,計算拷貝數(shù),稀釋成表1中記錄的濃度后,分裝,備用。將五種質(zhì)粒等體積混合,即得陽性對照,表l五種質(zhì)粒各自稀釋后的濃度細(xì)菌名稱牛布備氏桿苗山羊布香氏桿苗綿羊布魯氏桿苗5x10°牛結(jié)核分枝桿菌5x10°人結(jié)核分枝桿菌5x10°(3)雜交、顯色試劑預(yù)雜交液12ml,含有甲醮胺(DMF)50%(體積比),20XSSC25%(體積比〉,50XDenhartds10%(糊比),魚精咖A(10mg/ml)5M(糊比),1MPBS(pH6.4)5%(㈱比〉,0.1MEDTA5%(ftSR比);雜交液t12ml,含有甲酰胺(DMF)站^(體積比),加XSSC25%(體積比),50XDenhartds2%(糊比),魚精DNA(10mg/ml)2%(糊比),1MPBS(pH6.4)2%(條比),20%琉酸葡聚糖鈉24%(㈱比)洗液l:2XSSC20ml,含有20XSSC10%(休積比〉,10%SDS1%(體積比),蒸館水89%(體積比);洗液2:0.1XSSC20ml,含,20XSSC0:5%(糊比〕,10%SDS1%(體積比),蒸餾水98.5%(體積比);封閉液20ml,0.75gBSA溶于17.5ml蒸館水中,加入2.5nllMTris-HClpH7.5;瞎聯(lián)緩沖液40ml,含有1^8~!00.1111)[17.5,MgCl22nM,TritonX-100O.O戰(zhàn)(體積比),NaCl1.0M:酶2:親和素-堿性碑酸嗨(SAv-AP)0.01ml;終止液12ml,0.5MEDTA:底物緩沖液10ml,含有Tris-HCl0.1MpH9.5,MgCl25mM,NaCl0.1M;底物l:5-溴-4-氣-3畫吲哚碟酸(BCIP)0.05ml,2.5mgBCIP溶于0.05mlDMF中底物2:氨藍(lán)四唑(NBT)0.05ml,3.75mgNBT洛于0.05ml70%DMF中。注20XSSC:NaCl17.55%,二水合擰樣酸三鈉8.82%,pH7.0:1MPBS:NaClO.挑,KC10.02%,Na^HP0,120.l楊,,12貼0.02鄉(xiāng),pH6.4;0.1MEDTA:EDTA3.72*,pH8.0;1MTris-HClpH7.5:Tris12.196,MgCl20.19%,TritonX-1000.05%(體積比),NaCl5.戰(zhàn):EDTA:乙二胺四乙酸;SDS:十二烷基碘酸鈉(Sodiumdodecylsulfate,SDS):PBS:—種碟酸鹽緩沖液;BSA:牛血淸白蛋白;TritonX-100:聚乙二醉辛基苯基醚。(4)采樣工具無菌試管。(5)點好探針的芯片18張。2、樣本處理(1)取家畜的唾液或糞便,用無菌5mL試管收集l3ml:(2)向試管中加入4倍體積的4%的Na0H,搖勻,室皿置1530分鐘待液化(3)取液化后標(biāo)本1.0ml至1.5ml離心管,12,000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘(4)去上清,沉淀加滅菌生理鹽水lnl混勻,12,000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘(5)去上淸,沉淀加滅菌生理鹽水lml混勻,12,000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘(6)去上清,沉淀中加入50H1咖A提取液(市售試劑盒,150mlDNA提取液lMTris1015ml,0.5MEDTA6d1,5MNaCl范mT,CT紐4.5g,PVF3g,琉代琉糊0.3g,瑰基乙醉充分混勻,1001C恒溫處理10分鐘;(7)2,000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘,上淸即為樣本DNA,取上請至0.2nl離心管,備用。樣品存放:制備的樣品在21C-81C條件下保存不超過24小時,若需長期保存應(yīng)置-70lC以下,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。3、樣本擴增標(biāo)記依據(jù)下表所示的PCR體系,加入各種組分,同時配制陰、陽性對照質(zhì)控體系,然后在鍵渦振蕩器上振費混勻,接著在離心機上快速離心10秒,最后放入PCR儀中按表3所述反應(yīng)程序進(jìn)行擴增'注陽性對照反應(yīng)體系中的模板為2rt陽性對照品,其他組分不變檢淵反應(yīng)體系中的模板為2til待檢樣品DNA,其他組分不變;陰性對照反應(yīng)體系中的模板為陰性對照,其他組分不變。表2擴増反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表中陽性內(nèi)參引物的序列為"上游引物3*-GGOiTSCAGTCCTCATCCAG-3'(序列表中的SEQIDNO:23〉,下游引物5'-ACGGCTCTTCCCTCCAAG-3'(序列表中的SEQIDNO:24〉,表3PCR反應(yīng)程序<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>4.雜交、顯色(1)預(yù)雜交在裝有基因芯片的方形小皿上寫上樣品編號(包括待測樣品和陰、陽性對照樣品),向小皿中加入450W預(yù)雜交液,置雜交儀上401C預(yù)雜交30分鐘;(2〉雜交在預(yù)雜交過程中,將PCR產(chǎn)物置于PCR儀中變性10分鐘,然后立刻置于冰水浴10分鐘,在雜交小皿中加45014雜交液,將PCR產(chǎn)物加入雜交小皿中于46*0雜交90分鐘(3)洗滌分別用2XSSC洗滌液450H1將雜交芯片洗滌兩次,再用0.1XSSC洗滌液450W將雜交芯片洗潘兩次,每次各3分鐘豕(4)封閉向雜交芯片中加入400W封閉液,置雜交儀上于40"封閉20分鐘;(5)酶聯(lián)取適量的瞎聯(lián)級沖液,按SAv-AP:瞎聯(lián)緩沖液-l:1200比例加入SAv-AP,振蕩混勻,取混和液400H1加入雜交芯片中,置雜交儀上于401C,聯(lián)反應(yīng)20分鐘(6)洗滌取400W的瞎聯(lián)緩沖液將雜交芯片洗滌3次,每次3分鐘;(7)顯色配制顯色液(400W底鄉(xiāng)沖液+2W'BCIP+2WNBT),在小皿中加入400W顯色液,401C顯色3分鐘,隨時觀察雜交芯片上的顯色情況及本底深淺(8)終止顯色用終止液終止顯色,然后用蒸餾水反復(fù)沖洗數(shù)次;(9)放于芯片閱讀儀上閱讀結(jié)果。5、結(jié)果閱讀(1)適用于和利時全自動芯片成像分析儀(2)雜交完畢后,將霈要閱讀的芯片連同芯片載盤一起取出,放入芯片分析儀中,并固定載盤(3)打開分析儀開關(guān),登錄實驗員帳號進(jìn)入主界面,選擇"芯片分析",進(jìn)入芯片選擇界面,選取待分析芯片所對應(yīng)的載盤位號(4)點擊"下一步"進(jìn)入芯片預(yù)處理和條形碼讀取界面,若有儀器無法識別的條形碼需在條形碼輸入界面中手動輸入條形碼編號(輸入條形碼號時注意芯片類型是否正確)(5)輸入完成后點擊"保存",然后"開始分析",分析所得結(jié)果可于"結(jié)果處理"選項中査詢,也可直接生成報告單打印或傳輸?shù)脚c此成像分析儀相連的PC機上的配套管理軟件中;(6)分析儀會經(jīng)過閱讀和計算得出各點檢測值,并與參考值(Cutoff值)進(jìn)行比較得檢淵結(jié)果。結(jié)果類型如下+:陽性一陰性芯片污染空白對照點檢測值高于參考值,該樣本需重新檢擁。非特異陰性內(nèi)參點的檢淵值高于參考值,該樣本需重新檢測。實驗失敗陽性內(nèi)參點的檢淵值低于參考值,該樣本需重新檢獮。注推薦使用軟件進(jìn)行結(jié)果分析,可減少人為誤差影響。本發(fā)明方法能在短時間內(nèi)檢淵5種牛羊感染細(xì)菌病原體,快速準(zhǔn)確地獲取樣品中的信息,檢獮效率是傳統(tǒng)檢測手段的數(shù)十倍。本發(fā)明提供了一整套芯片的制備雜交顯色過程。本發(fā)明提供了完整的探針排布,優(yōu)化方案。此方案依據(jù)實例調(diào)整,具有合理性。芯片可大規(guī)模生產(chǎn),無污染。此發(fā)iim量、糖^9r、'效率i^傳統(tǒng)細(xì)菌檢測方法均有提高,易于加工操作,使用簡便。附圉說明圖l牛羊感染細(xì)菌病原體檢擁芯片設(shè)計模式圖質(zhì)控點女點樣過程質(zhì)控隨陽性內(nèi)參爭雜交質(zhì)控;口陰性內(nèi)參眾空白對照檢測探針①山羊布氏②牛布氏③人結(jié)核④綿羊布氏⑤牛結(jié)核。圖為2牛羊感染細(xì)菌病原體險測陽性結(jié)果。為進(jìn)一步說明本發(fā)明用于檢糖牛羊感染細(xì)菌病原體的基因芯片及其檢淵方法,特舉以下的實施例進(jìn)行說明,該實施例是為了觶釋而不是以任何方式限制本發(fā)明。具體實攤方式實施例l牛布備氏桿菌(Brucellaabortus)DEHNTnONBrucellaabortusstrain544uracilpermeasehomolog(bmel6)andB咖ll(bmell)genes,partialcds.檢潿探針的設(shè)計與合成—、設(shè)計通過文獻(xiàn)檢索及美國國家生物信息中心(NCBI)的比對獲得該細(xì)茵病原體的檢淵探針。第一步,根據(jù)大量的前期文獻(xiàn)調(diào)研,確定了該病原體的目標(biāo)基因。經(jīng)Genbank檢索,BLAST序列比對得到相對保守區(qū)(祀序列)第二步,依據(jù)探針設(shè)計原則,采用PrimerPreBier5.0和01igo6.0軟件,在此保守區(qū)內(nèi)設(shè)計針對病原體的檢糖探針得到檢潿探針的序列后,由專門的生物公司去合成相應(yīng)的探針片段。相應(yīng)的核S^列如下以下是選取的牛布備氏桿菌基因組核酸序列中的相對保守區(qū)(祀序列)片段l(SEQIDNO:l)GATCAGATGCAGAAGCGTACCGCCGCAACCGATCTCGATATCGTCGGAATGTGCCTGCATCTCCTGCGCTTTTATAATGGCATCGAGCCGGT6AATATCGGCAGCGGAGAAGAAATCTCGATCAAGGAACTGGCACTCACCGTTGCACGTATCGTTGGCTATCAAG將上述細(xì)茵片段1輸入軟件Pri鵬Multiplex3.4MultiplexPCRPri鵬rDesi抑,設(shè)定好參數(shù),運行程序,(5'PRIMERO"2003,PRIMER-20(H)TM:571CTMFormulaNearestN%GC50ANYCheckprimer-primerdimmerAvoidbackgroungprimingMultiplexPCR5SpecificityMedi咖其余參數(shù)為默認(rèn)值。)選取長度合適的計算結(jié)果,嚴(yán)終作為細(xì)菌的檢測探針片段。該檢測探針為GTCGGAATGTGCCTGCATCTCCTGCGCTTTTATAATGGCATCGAGCCGGTG(SEQIDN0:6)。二、合成探針的合成將設(shè)計好的探針交給專門的生物公司去合成。實施例2山羊布備氏桿菌(Brucella.Melitensis)DEFINITIONBrucellamelit抑sisinserti加sequ抑ceIS711,partialsequ節(jié)ce.檢測探針的設(shè)計與合成方法同實施例1,選取的山羊布魯氏桿菌基因組核^列的相對保守區(qū)(靶序列)為片段2(SEQIDNO:2)TCGGCTCAGAATAATCCACAGAAGGTAGAGCAGTAATATCCAATAGACGCCAnAACAATAGCGAGATTGGAATAGCTTACCCGCCAATCTTCGCCCTGCCACCAGCCAATAACGGCAAnATCGCTGTCACTGTTGCAAGTATGGCAGCGAGCGCTCTAGCGTGACGAAGCACTGTCTTTCTGACAATTTCCAGATTCACCCCTAGGGCGTGTCTGCATTCAACGTAACCAGATCATAGCGCATGCGAGATGGACGAAGCCCATGAATGCGGTCAATGTTTTCTCGCATCG檢淵探針為ACCCGCCAATCTTCGCCCTGCCACCAGCCAATAACGGCAATTATCGCT(SEQIDNO:7),實施例3綿羊布備氏桿苗(BrucellaOvis)DEFINITIONBrucella鵬lit抓sisbiovarOvis63/290siteoflargedeletioninvolving卿25bandwboA.檢瀾探針的設(shè)計與合成方法同實施例l,選取的綿羊布備氏桿菌基因組核酸序列的相對保守區(qū)(IC^列)為片段3(SEQIDNO:3)nAAGAGTGGAGCGGGTAGCGGGAATCGAACCCGCGCGnCAGCTTGGGAAGCTGACAGGCTACCATTACATCATACCCGCACCGCATAAGCGCTTCGCACTTTTGCTGGTAAA根據(jù)片段3設(shè)計的檢獮探針GCTTGGGAAGCTGACAGGCTACCATTACATCATACCCGCACCGCATA(卿IDN0:8)。實施例4牛結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)DEFINITIONMycobacteriumbovisBCGPasteur1173P2,completegenome.檢潿探針的設(shè)計與合成方法同實施例l,選取的牛結(jié)核分枝桿菌基因組核酸序列的相對保守區(qū)(祀序列)為片段4(SEQIDN0:4〉GCCGCAAAACTCG6ACACGCTTGCATAGTCTCGGTCGACTGTGAACGCGACGACCTCATATTCCGAATCCCTTGTGAAGTAGTAATCTGCGAGCTGAGCGATGTCGCCGCTCCCAAAAATTACCAATGGnTGGTCATGACGCCTTCCTAACCAGAATTGTCAATTCATACAAGCCGTAGTCGTGCAGAAGCGCAACACTCTTGGAGTGGCCTACAACGGCGCTCTCCGCGGCGCGGGCGTACCGGATATCTTAGCTGGTCAATAGCCATTTTTCAGCAATTTCTCAGTAACGCTACGGGGCGCGCCGTGCCGTAGTAGCGTCOCCACTGATGTGGACGATGGTGCTCCTTTTGGGGnGG檢淵探針CAAGGGATTCGGAATATGAGGTCGTCGCGTTCACAGTCGACCGAGACTA(SEQIDNO:9)。實施例5人結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)DEFINITIONMycobacteriumtuberculosisH37Rvcompletegenome:segment5/13.檢擁探針的設(shè)計與合成方法同實施例l,選取的人結(jié)核分枝桿菌基因組核黢序列的相對保守區(qū)(祀序列〉為片段5(SEQIDNO:5):GAAATTGCGTGTGCATCATCTGGCAGGCTATGTTCCCGCTACGCTGCAGCCCATCATGGATCTGCGGCTAACGAAGAGGTAATGACATGGCGCAAGCGACATCGGGCATTCGCGCGGCACTTTCGCAACCTGCTGTGTATGAGGCGTATCAGCGGATTGCGGGCGCTAAAAGCGGGCTTGCGTGGATCACAACCGACCCCATCCAGTCGTTGCCAGGCAT6CGTACTCTCGACCTCGGTTGCT檢測探針GCGGCACTTTCGCAACCTGCTGTGTATGAGGCGTATCAGCGG(SEQIDNO:10)。實施例6檢測牛羊感染細(xì)苗病原體的基因芯片的制備1、探針定量用紫外分光光度計定量實施例l-5合成的檢測探針以及合成的陰、陽性內(nèi)參質(zhì)控探針,然后將探針稀釋成50ng/u1,準(zhǔn)備芯片點樣,探針的點樣量為50nl。2、切鵬朋合適的硝酸纖維素膜,于切旗機中準(zhǔn)確裁剪成方形芯片,規(guī)格為1,5cmX1.5cn3、貼膜將芯片用膠面定于i:.'5cmX1.5cm芯片方皿甲,使之緊貼芯片方皿底部,放置2分鐘,膠凝固后,芯片平整地貼于芯片方皿底部,在芯片方皿的邊框上作一定向標(biāo)志鄉(xiāng)號,4、點族按下列芯片布局對探針進(jìn)行點樣。點樣時將已配制好的探針洛液逐個加入與已布局好的點樣針相應(yīng)位置的探針盤孔中。每種探針點兩針,點樣時將點樣儀推拉桿推到吸樣位置,點樣針與探針盤孔對準(zhǔn),按下頂部按鈕,吸取探針(樣品)液,停留3-5秒,吸樣完畢,放松按鈕,點樣針架自動彈起。然后將點樣儀推拉桿推到點樣位置,此時已吸液的點樣針對準(zhǔn)芯片方皿中的膜片,按下按鈕,停留3-5秒,放松按鈕,點樣針架自動彈起。重復(fù)此操作1-3次,點樣完畢。芯片布局如圖1所示點樣過程質(zhì)控所用試劑為有色染料;雜交質(zhì)控所用試劑為生物素;空白對照所用試劑為1倍的點樣緩沖液(1,籌糖溶液〉;陰、陽性內(nèi)參質(zhì)控探針的序列及合成如以上本發(fā)明具體的實施方案er基因芯片制備"—節(jié)中所述。5、交聯(lián)把點好樣的芯片放入在紫外燈下照射10分鐘,封裝后4"C保存。實施例7試劑盒在五種細(xì)菌檢擁中的應(yīng)用1、樣本的處理過程(1〉取病畜的唾液,用無菌5mL試管收集l3nL:(2)向玻璃管中加入4倍體積的4免的NaOH,描勻,室溫放置1530分鐘待液化(3)取液化后標(biāo)本1.0mL至1.5mL離心管,12,000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘(4)去上清,沉淀加滅菌生理鹽水lBL混勻,12,000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘;(5)去上淸,沉淀加滅苗生理鹽水lmL混勻,12,000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘豕(6)去上清,沉淀中加入50WDNA提取液充分混勻,100TC恒溫處理10分鐘(7)2,000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘,上清即為樣本咖A,取上淸至0.&1離心管,備用2、5種細(xì)菌病原體DNA的PCR擴增標(biāo)記標(biāo)記PCR擴塌的反應(yīng)體系和程序按本說明書的具體實施方案中所述進(jìn)行,循環(huán)條件和次數(shù)如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>40次循環(huán)3.PCR標(biāo)記產(chǎn)物變性sPCR循環(huán)后的產(chǎn)物置PCR儀中991C加熱變性10分鐘,然后迅i&i&入冰上驟冷10分鐘。4.雜交、顯色(1)預(yù)雜交在裝有基因芯片的方形小皿上寫上樣品編號(包括待淵樣品和陰、陽性對照樣品),向小皿中加入450H1預(yù)雜交液,置雜交儀上40"C預(yù)雜交30分鐘;(2〉雜交在預(yù)雜交過程中,將PCR產(chǎn)物置于PCR儀中變性IO分鐘,然后立刻置于冰水浴IO分鐘,在雜交小皿中加450W雜交液,將PCR產(chǎn)物加入雜交小皿中于461C雜交90分鐘(3)洗滌分別用2XSSCiSfe滌液45(mi將雜交芯片洗潘兩次,再用O.IXSSC洗錄液450W將雜交芯片洗滌兩次,每次各3分鐘(4)封閉向雜交芯片中加入400W封閉液,置雜交儀上于401C封閉20分鐘(5)酶聯(lián)取適量的酶聯(lián)緩沖液,按SAv-AP:酶聯(lián)緩沖液-l:1200比例加入SAv-AP,振蕩混勻,取混和液400W加入雜交芯片中,置雜交儀上于40t!籌聯(lián)反應(yīng)20分鐘;(6)洗滌取400W的酶聯(lián)緩沖液將雜交芯片洗錄3次,每次3分鐘(7)顯色配制顯色液(40(HH底物液+2Ji1BCIP+2WNBT),在小皿中加入400W顯色液,40"顯色3分鐘,隨時觀察雜交芯片上的顯色情況及本底深淺(8)終止顯色用終止液終止顯色,然后用蒸餾水反復(fù)沖洗數(shù)次;(9)放于芯片閱讀儀上閱讀結(jié)果。5.結(jié)果觀察結(jié)果見圖2按照本試劑盒的檢潿方法操作,芯片雜交后各點的顯色情況較好。芯片閱讀結(jié)果_牛羊細(xì)菌病原體基因'芯片檢測結(jié)果戶主姓名王力送檢單位北京檢fi^采樣時間20071210病畜ID:07121001牲畜類別羊送檢醫(yī)生,王奇檢糖時間2007-12-19樣本編號07121001畜齡辨臨床診斷::無樣本類型t唾液芯片ID:060000000007中文名稱結(jié)果參考值山羊布魯氏桿菌陽性陰性縮羊布魯RfF菌陽性陰性牛布餐氏桿菌陽性陰性牛結(jié)核分枝桿菌陽性陰性人結(jié)核分枝桿菌陽性陰性錄入時間,2007-12-19報告時間:2007-12-19檢#:左靜審核者梁濤注此報吿只對本樣本負(fù)賁!SEQUENCELISTING<110>北京愛普益生物科技有限公司<120>檢測牛羊感染細(xì)菌病原體的基因芯片、試劑盒及其制備方法、檢測方法<130〉SGF<160>24〈170〉Patentlnversion3.2<210>1<211〉166<212>DM〈213〉牛布魯氏桿菌<德1gatcagatgcagaagcgtaccgccgcaaccgatctcgatatcgtcggaatgtgcctgcat60ctcctgcgcttttataatggcatcgagccggtgaatatcggcagcggagaagkaatctcg120atcaaggaactggcactcaccgttgcacgtatcgttggctatgaag166<210>2<211>292<212>DNA〈213〉山羊布魯氏桿菌<2tcggctcagaataatccacaga鄉(xiāng)t卿gcagtaatstccaatagacgccattaacaat60agcgagattggaatagcttacccgccaatcttcgccctgccaccagccaataacggcaat120tatcgctgtcactgttgcaagtatggcagcgagcgctctagcgtgacgaagcactgtctt180tctgacaatttccagattcacccctagggcgtgtctgcattc幼cgtaaccagatcatag240cgcatgcgagatggacgaagcccatgaatgcggtcaatgttttctcgcateg292<21.0>3<211>114<212〉■<213>綿羊布魯氏桿菌<400〉3ttaagagtggagcgggtagcgggaatcgaacccgcgcgttcagcttgggaagctgacagg60ctaccattacatcatacccgcaccgcataagcgcttcgcacttttgctgg114<210〉4<211>361<212>DNA<213〉牛結(jié)核分枝桿菌<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><210〉14<211>18<212〉DNA<213〉artificialsequence<220〉<223〉primer<400〉14cgatgcgagaaaacattg18<210〉15<211>19<212〉DNA<213〉artificialsequence<220><223〉primer<400〉15tttaccagcaaaagtgcga19<210〉16《211〉18<212>腿<213〉artificialsequence<220><223>primer<400>16ttaagagtggagcgggta<210>17<211>16<212〉DNA<213〉artificialsequence<220><223>primer<400>17gccgcaaaactcggac16<210>18<211>16<212〉DNA<213>artificialsequence<220><223>primer<400>18ccaaccccaaaaggag16<210>19<211〉6<212>DNA<213>artificialsequence<220〉<223>primer<400>19gccgcaaaactcggac16<210>20<211〉16<212>腿<213>artificialsequence<220〉<223>primer<柳〉20ccaaccccaaaaggag16<210〉21<211〉51<212>DNA<213>陽性內(nèi)參<400>215,-Utggggtgcttgatgaacaattacatcgt;aataggggctacag卿taga-3'<210>22<211〉51<212〉DNA<213>artificialsequence<220><223>陰性內(nèi)參<400>22ctggcgaatctgaatgcagtttaacggctcaaccaagttgaactcagacgc51<210>23<211〉20<212>DM<213〉artificialsequence<220><223>primer<400>23ggcatacagtcctcatccag20<210〉24〈211〉18<212>DNA<213〉artificialsequence<220><223〉primer〈400〉24acggctcttccctccaag18權(quán)利要求1、一種檢測牛羊感染細(xì)菌病原體的基因芯片,包括固相載體硝酸纖維素膜和固定在該載體上的寡聚核苷酸探針,其中寡聚核苷酸探針包括檢測探針和質(zhì)量控制探針,其特征在于芯片樣品點的布局為低密度布局,樣品點少于200個;所述的寡聚核苷酸檢測探針是從牛布魯氏桿菌、山羊布魯氏桿菌、綿羊布魯氏桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌和人結(jié)核分枝桿菌中的至少一種細(xì)菌基因組對應(yīng)的核苷酸序列中選取的DNA片段。2、如權(quán)利要求l所述的檢測牛羊感染細(xì)菌病原體的的基因芯片,其特征在于所述的寡聚核苷酸檢測探針包括從牛布魯氏桿菌、山羊布魯氏桿菌、綿羊布魯氏桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌和人結(jié)核分枝桿菌基因組對應(yīng)的核苷酸序列中選取的DNA片段。3、如權(quán)利要求1或2所述的檢測牛羊感染細(xì)菌病原體的的基因芯片,其特征在于所述的從牛布魯氏桿菌基因組的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如序列表中SEQIDN0:6所示的堿基序列;從山羊布魯氏桿菌基因組的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如序列表中SEQIDN0:7所示的堿基序列;從綿羊布魯氏桿菌基因組的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如序列表中SEQIDN0:8所示的堿基序列;從牛結(jié)核分枝桿菌基因組的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如序列表中SEQIDN0:9所示的堿基序列;從人結(jié)核分枝桿菌基因組的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如序列表中SEQIDNO:IO所示的堿基序列。4、制備權(quán)利要求1所述的檢測牛羊感染細(xì)菌病原體的基因芯片的方法,其特征是包括以下的步驟(1)檢測探針的設(shè)計經(jīng)Genbank檢索,BLAST序列比對分別得到牛布魯氏桿菌、山羊布魯氏桿菌、綿羊布魯氏桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌和人結(jié)核分枝桿菌基因組對應(yīng)的核苷酸序列中的相對保守區(qū),作為靶序列,依據(jù)探針設(shè)計原則,采用PrimerPremier5.0和01igo6.0軟件,在此保守區(qū)內(nèi)分別設(shè)計針對病原體的特異性的檢測探針;(2)檢測探針的合成由專門的生物公司合成上述設(shè)計好的探針片段序列;(3)芯片的制備包括切膜、貼膜,然后將上述得到的檢測探針點膜,紫外交聯(lián)10分鐘,再經(jīng)存膜即得芯片,其中點膜后所得樣品點的直徑在200iim—1000um。5、如權(quán)利要求4所述的方法,其中所述的相對保守區(qū)的序列如下牛布魯氏桿菌基因組核苷酸序列中的相對保守區(qū)具有如序列表中SEQIDN0:1所示的堿基序列;山羊布魯氏桿菌基因組核苷酸序列中的相對保守區(qū)具有如序列表中SEQIDN0:2所示的堿基序列;綿羊布魯氏桿菌基因組核苷酸序列中的相對保守區(qū)具有如序列表中SEQIDN0:3所示的堿基序列;牛結(jié)核分枝桿菌基因組核苷酸序列中的相對保守區(qū)具有如序列表中SEQIDN0:4所示的堿基序列;人結(jié)核分枝桿菌基因組核苷酸序列中的相對保守區(qū)具有如序列表中SEQIDN0:5所示的堿基序列。6、一種利用權(quán)利要求1、2或3所述的基因芯片檢測牛羊感染細(xì)菌病原體的方法,其特征是包括以下的歩驟(1)待測樣本處理采用常規(guī)方法提取待測樣品的DNA,進(jìn)行標(biāo)記PCR擴增;(2)雜交顯色;將歩驟(1)得到的標(biāo)記后的PCR產(chǎn)物和權(quán)利要求1、2或3所述的基因芯片進(jìn)行雜交,然后顯色;(3)結(jié)果閱讀與分析利用生物芯片閱讀儀獲取雜交信號并分析鑒定雜交結(jié)果。7、如權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于歩驟(1)所述的標(biāo)記PCR擴Jt(^用以下引物擴增SEQIDN0:1所用的一對引物的序列如序列表中的SEQIDNO:11和NO:12所示擴增SEQIDN0:2所用的一對引物的序列如序列表中的SEQIDN0:13和N0:14所示;擴增SEQIDN0:3所用的一對引物的序列如序列表中的SEQIDNO:15和NO:16所示;擴增SEQIDN0:4所用的一對引物的序列如序列表中的SEQIDN0:17和N0:18所示;擴增SEQIDN0:5所用的一對引物的序列如序列表中的SEQIDNO:19和NO:20所示。8、用于檢測牛羊感染細(xì)菌病原體的試劑盒,其特征是包括權(quán)利要求l、2或3所述的基因芯片、待測樣品處理試劑、雜交和顯色試劑,以及說明書。全文摘要本發(fā)明涉及一種檢測牛羊感染細(xì)菌病原體的基因芯片,其中基因芯片包括固相載體和固定在該載體上的寡聚核苷酸探針,所述寡聚核苷酸探針包括檢測探針和質(zhì)量控制探針,檢測探針是從牛布魯氏桿菌、山羊布魯氏桿菌、綿羊布魯氏桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌和人結(jié)核分枝桿菌基因組的核苷酸序列中選取的DNA片段。本發(fā)明還涉及該芯片的制備方法、利用該芯片檢測牛羊五種感染細(xì)菌病原體的方法,包括合成探針,制備芯片,與處理標(biāo)記好的待測樣品進(jìn)行雜交的過程。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及由上述芯片和樣品處理試劑、雜交和顯色試劑,以及說明書組成的牛羊感染細(xì)菌病原體的檢測試劑盒。利用本發(fā)明的基因芯片可達(dá)到同時檢測五種細(xì)菌的目的,操作簡便、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性強,對于實驗室研究和生產(chǎn)實踐都具有重要的意義。文檔編號C12Q1/68GK101333556SQ200810114428公開日2008年12月31日申請日期2008年6月5日優(yōu)先權(quán)日2008年6月5日發(fā)明者騁周,姚志建,存姜,逄建濤申請人:北京愛普益生物科技有限公司
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1
麻栗坡县| 方城县| 象州县| 竹山县| 洛阳市| 聂荣县| 隆子县| 综艺| 阳泉市| 镶黄旗| 馆陶县| 安新县| 门源| 府谷县| 洛川县| 南阳市| 左贡县| 绩溪县| 墨玉县| 巴彦淖尔市| 吐鲁番市| 永新县| 马龙县| 上思县| 安仁县| 工布江达县| 通海县| 泸定县| 柘城县| 绍兴县| 岫岩| 怀化市| 息烽县| 博客| 邢台市| 弋阳县| 沿河| 留坝县| 武乡县| 赣榆县| 额尔古纳市|