專(zhuān)利名稱(chēng)：一步法病毒氣溶膠的采集及其濃度的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對(duì)病毒氣溶膠進(jìn)行直接采樣并檢測(cè)其濃度的方法，屬于 生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
我國(guó)二十多年來(lái)醫(yī)院感染皆以呼吸道感染為主，而且還有增加趨勢(shì)。在 呼吸道感染的病原體中病毒比細(xì)菌和真菌的種類(lèi)多、毒力強(qiáng)、診療困難，且 新的病毒不斷出現(xiàn)。國(guó)際氣溶膠學(xué)會(huì)早已提出，全球應(yīng)加強(qiáng)對(duì)病毒性氣溶膠 感染的研究，雖然對(duì)呼吸道病原體的分析化驗(yàn)水平較高，方法較全，但如果 采不到病毒氣溶膠標(biāo)本，就只能是紙上談兵，為此病毒氣溶膠采樣的研究就 顯得十分重要了。病毒氣溶膠采樣技術(shù)比細(xì)菌復(fù)雜、難度大、資料少，但應(yīng)用廣泛，在國(guó) 防、科研及實(shí)踐中都具有重要意義。目前對(duì)病毒氣溶膠的采樣主要是二步法， 即先將采樣介質(zhì)涂抹于采樣器皿上，再去進(jìn)行病毒氣溶膠采樣，然后將帶病 毒的采樣介質(zhì)洗下來(lái)，把它放在敏感細(xì)胞上培養(yǎng)，通過(guò)數(shù)噬斑來(lái)計(jì)算采到的 病毒氣溶膠的數(shù)量。這種采樣方式由于采樣后需經(jīng)過(guò)洗脫、轉(zhuǎn)移等中間環(huán)節(jié)， 靈敏度大大降低。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種新的一步法病毒氣溶膠的采集及 檢測(cè)方法，該方法將病毒氣溶膠直接采到富集敏感細(xì)胞的環(huán)境中，采樣后立即拿去培養(yǎng)，不需要經(jīng)過(guò)洗脫、轉(zhuǎn)移等中間環(huán)節(jié)，最后可通過(guò)數(shù)噬斑判斷計(jì) 算采樣的病毒氣溶膠數(shù)量，提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的 一步法病毒氣溶膠的采集及其濃度的檢測(cè)方法，包括以下步驟(1) 將與待檢測(cè)的病毒相配對(duì)的敏感細(xì)胞進(jìn)行富集培養(yǎng)，得到富集有大 量敏感細(xì)胞的培養(yǎng)體；(2) 當(dāng)步驟(1)所制備的富集有大量敏感細(xì)胞的培養(yǎng)體中的敏感細(xì)胞處于敏感期時(shí)，利用空氣微生物采樣器將待檢測(cè)的病毒氣溶膠直接采到該培養(yǎng)體上，培養(yǎng)，使病毒與敏感細(xì)胞作用形成噬斑，通過(guò)噬斑數(shù)量計(jì)算待檢測(cè)的病毒氣溶膠的濃度，計(jì)算式如下所示c = ， (1)式中，C——病毒氣溶膠濃度，pfu/m3; N——采樣到的病毒所形成的噬斑 數(shù)，pfu (噬斑形成單位)；V——微生物采樣器的采樣流量，L/min; ts—— 采樣時(shí)間，min。舉例說(shuō)明如下如用安德森采樣器，采樣2分鐘得到5個(gè)病毒(數(shù)噬斑得來(lái)的)。則病毒氣溶膠的濃度由下式計(jì)算5 (6節(jié)平皿上的總斑數(shù))pfu (噬斑形成單位)數(shù)/米3=-x1000=88 pfu/米328.3升/分X2至于與待檢測(cè)的病毒相配對(duì)的敏感細(xì)菌具體是何種細(xì)菌，取決于待檢測(cè)病毒的具體種類(lèi)，例如，如果待檢測(cè)的是f2、 MS-2、 QP、 T系列噬菌體，則 與之相配對(duì)的敏感細(xì)菌是大腸桿菌；如果待檢測(cè)的是28 3①噬菌體，則與之 相配對(duì)的敏感細(xì)菌是沙門(mén)氏菌；如果待檢測(cè)的是流感病毒，則與之相配對(duì)的 敏感細(xì)胞是雞胚纖維母細(xì)胞；如果待檢測(cè)的是炭疽桿菌、霍亂弧菌、鼠疫桿菌(注意嚴(yán)格防護(hù))或其他菌種相對(duì)應(yīng)的噬菌體，則與之相配對(duì)的敏感細(xì)菌是 相應(yīng)的炭疽桿菌、霍亂弧菌、鼠疫桿菌或其他菌體?？傊绢I(lǐng)域技術(shù)人員 可根據(jù)待檢測(cè)病毒的具體種類(lèi)很容易確定與之相配對(duì)的敏感細(xì)胞，并按照本 領(lǐng)域的常規(guī)方法制備富集有該敏感細(xì)菌的培養(yǎng)體。作為參考，所述的培養(yǎng)體可分別按照以下兩種方法制備(1) 用于感染性病毒的采樣將與待檢測(cè)的病毒氣溶膠相配對(duì)的敏感細(xì) 胞，加到裝有培養(yǎng)該敏感細(xì)胞的培養(yǎng)液的采樣器皿上貼壁(如玻璃平皿、瓊 脂條等)，通過(guò)繁殖形成富集有大量敏感細(xì)胞的培養(yǎng)體；上述所得到的培養(yǎng)體 主要用于感染性病毒在室內(nèi)的采樣，當(dāng)在臟的環(huán)境中采樣，采樣時(shí)宜在上述 培養(yǎng)體中加入濃度約為4萬(wàn)單位/ml青霉素或鏈霉素的抗菌素去抑制空氣中的 雜菌(如培養(yǎng)液中有抗菌素不必再加入)。采樣時(shí)間以不出現(xiàn)雜菌為宜。(2) 對(duì)于噬菌體的采樣將與待檢測(cè)的病毒氣溶膠相配對(duì)的敏感細(xì)胞斜 面培養(yǎng)20小時(shí)，用營(yíng)養(yǎng)肉湯沖洗轉(zhuǎn)移，在肉湯中37'C震蕩培養(yǎng)3小時(shí)，再將 其制成約1-5億個(gè)菌/ml的菌液，取少許，加到裝有營(yíng)養(yǎng)瓊脂的采樣器皿上部， 再以最快速度加入等量溶化了的5(TC營(yíng)養(yǎng)瓊脂液(要求既不能燙死敏感細(xì) 菌，又不能使溶化了的營(yíng)養(yǎng)瓊脂在未鋪平時(shí)凝固)，立即混勻，制成薄薄一層菌墊，加入的菌液與營(yíng)養(yǎng)瓊脂液等量，形成半固體，其量約為原培養(yǎng)基的1/10;待半固體凝固后，立即用于細(xì)菌的病毒(即噬菌體)的采樣。采樣后放入37 'C恒溫箱培養(yǎng)4-6小時(shí)左右，數(shù)噬斑。按照上述方法對(duì)病毒氣溶膠進(jìn)行采樣時(shí)，宜注意以下幾點(diǎn)(l)待采樣的 病毒氣溶膠是感染性病毒若是在干凈環(huán)境中采樣則可以直接拿去培養(yǎng)(該 培養(yǎng)方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知)；如果在臟的環(huán)境中采樣，采樣時(shí)要在上述培養(yǎng)體中加適當(dāng)濃度的抗菌素去抑制空氣中的雜菌(如培養(yǎng)液中有抗菌素不必再加入)。(2)待采樣的病毒氣溶膠是噬菌體不必加任何東西，不用任何處理即可去采樣培養(yǎng)，顯示噬斑。本發(fā)明具有快速、敏感、抗干擾能力強(qiáng)、準(zhǔn)確可靠、方便經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單實(shí) 用的優(yōu)點(diǎn)，是對(duì)病毒氣溶膠進(jìn)行采樣的理想方法，便于大規(guī)模推廣使用。其 主要特點(diǎn)表現(xiàn)為①快速最快的4-6小時(shí)即可出結(jié)果，它比二步法至少可 節(jié)省一半的時(shí)間；②敏感因?yàn)榇朔ǖ南葲Q條件就是將細(xì)菌或病毒氣溶膠與 敏感細(xì)胞配對(duì)，不用再去沖洗、轉(zhuǎn)移病毒，更不會(huì)產(chǎn)生損失或失活，因而敏 感，只要采到一個(gè)病毒，即可顯示一個(gè)噬斑；③抗干擾能力強(qiáng)本發(fā)明將空 氣中的病毒(噬菌體)直接采到敏感細(xì)胞上，不怕空氣中其他雜菌，因?yàn)樵?-6 小時(shí)即可出結(jié)果，在這樣短的時(shí)間里雜菌還未來(lái)得及繁殖，噬斑已經(jīng)很明顯 了，因此不怕雜菌干擾；④準(zhǔn)確可靠上面已提及只要有病毒碰到敏感細(xì)胞， 就會(huì)有噬斑，因此準(zhǔn)確可靠； 省時(shí)省力不用將采到的病毒用介質(zhì)再?zèng)_洗 下來(lái)，省時(shí)省力，至少可節(jié)省一半的時(shí)間及工作量。⑥對(duì)人體無(wú)害，不怕污 染環(huán)境，它是模擬感染性病毒防恐防生物戰(zhàn)的理想標(biāo)本。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些小的修改和替 換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。試驗(yàn)材料(1) T系列噬菌體L、大腸菌B株一中國(guó)科學(xué)院微生物所菌種保存管理中心；(2) 味精噬菌體、味精發(fā)酵菌(T6B菌)一可從全國(guó)各大味精廠(chǎng)購(gòu)買(mǎi)得到;(3) 流感病毒(疫苗株)一購(gòu)自蘭州生物制品所；(4) Sindbis病毒、雞胚纖維母細(xì)胞一購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院五所； 實(shí)施例1將對(duì)T系列噬菌體敏感的大腸菌B株制成半固體大腸菌B株斜面培養(yǎng) 20小時(shí)，用營(yíng)養(yǎng)肉湯沖洗轉(zhuǎn)移，在肉湯中37'C震蕩培養(yǎng)3小時(shí)，再將其制成 約l-5億個(gè)菌/ml的菌液，取少許，加到裝有營(yíng)養(yǎng)瓊脂的采樣器皿上部，再以 最快速度加入等量溶化了的5(TC營(yíng)養(yǎng)瓊脂液(要求既不能燙死敏感細(xì)菌， 又不能使溶化了的營(yíng)養(yǎng)瓊脂在未鋪平時(shí)凝固)，立即混勻，制成薄薄一層菌墊， 加入的菌液與營(yíng)養(yǎng)瓊脂液等量，形成半固體，其量約為原培養(yǎng)基的1/10;待 半固體凝固后，立即用于細(xì)菌的病毒(即噬菌體)的采樣；采樣前將上述達(dá)到敏感時(shí)期的大腸菌B株的培養(yǎng)體置于空氣微生物采樣 器(如購(gòu)自遼陽(yáng)應(yīng)用技術(shù)研究所的LWC-1采樣器)中，再用該空氣微生物采 樣器去采樣，將采集的T系列噬菌體氣溶膠樣品直接放入37'C溫箱培養(yǎng)，4 一6小時(shí)后計(jì)數(shù)噬斑，判斷計(jì)算所采樣的T系列噬菌體的氣溶膠濃度。 一個(gè)具 體的實(shí)例是用LWC-1采樣器采6分鐘，得到30個(gè)噬斑(l個(gè)噬菌體形成l 個(gè)噬斑)，噬菌體的濃度按下式計(jì)算；30 (瓊脂條上總噬斑數(shù))病毒數(shù)/米3= -1000 二 125個(gè)病毒/米340升/分X6分計(jì)算結(jié)果為噬菌體氣溶膠的濃度為125個(gè)病毒/米3。實(shí)施例2將對(duì)味精噬菌體敏感對(duì)數(shù)期的味精發(fā)酵菌(T6B菌)加到等量的培養(yǎng)該菌 的5(rC的帶有專(zhuān)用培養(yǎng)基(專(zhuān)用培養(yǎng)基配方蛋白胨P/。-2y。、牛肉膏0. 3%-0. 5%、氯化鈉0. 5%、玉米漿0, 1%-0. 2%、葡萄糖1%_2%、瓊脂1. 8%、 Ph=6. 8-7. 0) 的玻璃平皿或無(wú)毒平皿上，制成薄薄一層菌墊，立即用JWL-1型采樣器采集 味精噬菌體氣溶膠，采樣后直接放36t:培養(yǎng)6-12小時(shí)后計(jì)數(shù)噬斑數(shù)。(用 JWL-1型采樣器3分鐘采到18個(gè)噬菌體，按下式計(jì)算噬菌體數(shù))18 (平皿上總噬斑數(shù))噬菌體數(shù)/米3= -____ x 1000 = 240個(gè)噬菌體/米325升/分x3分計(jì)算結(jié)果為噬菌體氣溶膠的濃度為240個(gè)噬菌體/米3。 實(shí)施例3用8-9日齡雞胚，通過(guò)常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)法，去頭、爪、內(nèi)臟，按病毒專(zhuān)業(yè) 常規(guī)法，用Hanks液洗，用1%的胰酶消化，并加入生長(zhǎng)液，經(jīng)過(guò)濾，計(jì)數(shù)， 配成150-200萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml的濃度，然后按每個(gè)噬斑瓶(60cm2)加入12ml的 比例，加入各種不同大小潔凈的采樣器皿中，于37t培養(yǎng)24小時(shí)，制成單層 貼壁細(xì)胞。然后去采空氣中的流感或Sindbis病毒氣溶膠。主要在試驗(yàn)室中 采樣，接著加入1.8%的瓊脂覆蓋，37。C培養(yǎng)48小時(shí)后，計(jì)數(shù)噬斑。計(jì)算病毒 氣溶膠的濃度。如用JWL-1型采樣器，采5分鐘，采到15個(gè)病毒，則結(jié)算結(jié) 果為15 (采到的總噬斑數(shù))Pfu (噬斑形式單位)數(shù)/米3= -X 1000=120 Pfu/米325升/分鐘X5分鐘注Hanks液、消化液和生長(zhǎng)液的具體組成成分和配制詳見(jiàn)文獻(xiàn)(《醫(yī)用實(shí)驗(yàn)病毒學(xué)》, 主編杜平，1985年出版)。
權(quán)利要求
1、一步法病毒氣溶膠的采集及其濃度的檢測(cè)方法，包括以下步驟(1)、將與待檢測(cè)的病毒相配對(duì)的敏感細(xì)胞進(jìn)行富集培養(yǎng)，得到富集有大量敏感細(xì)胞的培養(yǎng)體；(2)、當(dāng)步驟(1)所制備的富集有大量敏感細(xì)胞的培養(yǎng)體中的敏感細(xì)胞處于敏感期時(shí)，采用空氣微生物采樣器將待檢測(cè)的病毒氣溶膠直接采到該培養(yǎng)體上，培養(yǎng)，使病毒與敏感細(xì)胞作用形成噬斑，計(jì)數(shù)噬斑數(shù)量，按照以下公式計(jì)算待檢測(cè)病毒氣溶膠的濃度<maths id="math0001" num="0001" ><math><![CDATA[ <mrow><mi>C</mi><mo>=</mo><mfrac> <mrow><mn>1000</mn><mi>N</mi> </mrow> <mrow><mi>V</mi><mo>·</mo><msub> <mi>t</mi> <mi>s</mi></msub> </mrow></mfrac><mo>-</mo><mo>-</mo><mo>-</mo><mrow> <mo>(</mo> <mn>1</mn> <mo>)</mo></mrow> </mrow>]]></math></maths>式中，C病毒氣溶膠濃度，單位pfu/m3；N采樣到的病毒所形成的噬斑數(shù)；V微生物采樣器的采樣流量，單位L/min；ts采樣時(shí)間，單位min。
2、 按照權(quán)利要求1的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(1)中所述的培養(yǎng)體按照以下方法制備將與待檢測(cè)的感染性病毒氣溶膠相配對(duì)的敏感細(xì)胞，加到裝有培養(yǎng)該敏感細(xì)胞的培養(yǎng)液的采樣器皿上貼壁培養(yǎng)，通過(guò)繁殖形成富 集有大量敏感細(xì)胞的培養(yǎng)體，用于感染性病毒的采樣。
3、 按照權(quán)利要求1的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(1)中所述的培養(yǎng)體按照以下方法制備將與待檢測(cè)的噬菌體氣溶膠相配對(duì)的敏感細(xì)胞斜面培養(yǎng)20小時(shí)，用營(yíng)養(yǎng)肉湯沖洗轉(zhuǎn)移，在肉湯中37-C震蕩培養(yǎng)，再將其制成約 1-5億個(gè)菌/ml的菌液；取少許菌液加到裝有營(yíng)養(yǎng)瓊脂的采樣器皿上部，再迅 速加入等重量的溶化了的溫度為5(TC的營(yíng)養(yǎng)瓊脂，立即混勻，制成薄薄一層 菌墊，形成半固體；待半固體凝固后，立即用于噬菌體的采樣。
4、 按照權(quán)利要求1或3的檢測(cè)方法，其特征在于所述待檢測(cè)的病毒氣 溶膠選自f2、 MS-2、 QP或T系列噬菌體；所述的相對(duì)應(yīng)的敏感細(xì)菌是大腸桿菌。
5、 按照權(quán)利要求1或3的檢測(cè)方法，其特征在于所述待檢測(cè)的病毒氣 溶膠為28^①噬菌體；所述的相對(duì)應(yīng)的敏感細(xì)菌是沙門(mén)氏菌。
6、 按照權(quán)利要求1或3的檢測(cè)方法，其特征在于所述待檢測(cè)的病毒氣溶膠為味精噬菌體；所述的相對(duì)應(yīng)的敏感細(xì)菌是味精發(fā)酵菌(T6B菌)。
7、 按照權(quán)利要求1或3的檢測(cè)方法，其特征在于所述待檢測(cè)的病毒氣 溶膠是炭疽桿菌、霍亂弧菌、鼠疫桿菌或其他菌種對(duì)應(yīng)的噬菌體；所述的相 對(duì)應(yīng)的敏感細(xì)菌是炭疽桿菌、霍亂弧菌、鼠疫桿菌或其他菌種。
8、 按照權(quán)利要求1或2的檢測(cè)方法，其特征在于所述待檢測(cè)的病毒氣 溶膠是流感病毒氣溶膠；所述的相對(duì)應(yīng)的敏感細(xì)胞是雞胚纖維母細(xì)胞。
9、 按照權(quán)利要求1或2的檢測(cè)方法，其特征在于所述待檢測(cè)的病毒氣 溶膠是Sindbis病毒；所述的相對(duì)應(yīng)的敏感細(xì)胞是雞胚纖維母細(xì)胞。
10、 按照權(quán)利要求1或2的檢測(cè)方法，其特征在于所述待檢測(cè)的病毒 氣溶膠是特定感染性病毒；所述的敏感細(xì)胞是與該感染性病毒相配對(duì)的特定 敏感細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一步法病毒氣溶膠的采集及其濃度的檢測(cè)方法，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。該方法包括以下步驟(1)將與待檢測(cè)的病毒氣溶膠相配對(duì)的敏感細(xì)胞進(jìn)行富集培養(yǎng)，得到富集有大量敏感細(xì)胞的培養(yǎng)體；(2)將待檢測(cè)的病毒氣溶膠直接采到步驟(1)所制備的處于敏感期的培養(yǎng)體之上，培養(yǎng)，使病毒與敏感細(xì)胞作用形成噬斑，通過(guò)噬斑數(shù)量計(jì)算待檢測(cè)的病毒氣溶膠的濃度。本發(fā)明方法將病毒氣溶膠直接采到富集敏感細(xì)胞的培養(yǎng)體上，采樣后立即培養(yǎng)，不需要經(jīng)過(guò)洗脫、轉(zhuǎn)移等中間環(huán)節(jié)，通過(guò)數(shù)噬斑判斷計(jì)算采樣的病毒氣溶膠濃度，避免了現(xiàn)有方法即間接采樣法中所存在的諸多缺點(diǎn)，具有快速敏感、準(zhǔn)確可靠、抗干擾能力強(qiáng)、方便經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單實(shí)用，不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101603069SQ200810114610
公開(kāi)日2009年12月16日 申請(qǐng)日期2008年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月10日
發(fā)明者于璽華, 張益昭, 曹?chē)?guó)慶 申請(qǐng)人:于璽華;中國(guó)建筑科學(xué)研究院