專利名稱：衣原體蛋白酶體樣活性因子的活性片段及其表達方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及衣原體蛋白酶體樣活性因子的活性片段及其表達方法。
背景技術(shù)：
衣原體是自然界中傳播很廣泛的病原體。它是既不同于細菌也不同于病毒的一 種微生物，專營寄生在真核細胞內(nèi)。衣原體廣泛寄生于人類、哺乳動物及禽類。根 據(jù)衣原體的抗原結(jié)構(gòu)和DNA同源性的特點，將衣原體屬(Chlamydiae)分為四個種， 包括沙目艮衣原體(Chlamydiatrachomatis)、月巿炎衣原體(Chlamydiapneumoniae)、 鸚鵡熱衣原體(Chlamydiapsittaci)和獸類衣原體(Chlamydiapecorum)。與人 類疾病有關(guān)的衣原體有三種，分別是鸚鵡熱衣原體、沙眼衣原體和肺炎衣原體。目 前由衣原體感染所致的性傳播疾病增加很快，生殖道感染的發(fā)病率已超過淋病奈瑟 菌感染，成為最常見的性傳播疾病。這三種衣原體均可引起肺部感染。
衣原體對宿主細胞的毒性作用一般認為是通過CPAF (chlamydial protease/proteasome-like activity factor) 蛋白來實現(xiàn)的-
衣原體為了能在受感染宿主細胞生存，進化出了逃避、以及應付宿主免疫識別 的能力。其中一個策略就是衣原體通過抑制宿主主要組織相容性復合物(MHC) I類 和II類抗原的表達從而逃脫T淋巴細胞的免疫識別(Zhong et al. ， 1999, 2000)。 現(xiàn)在已經(jīng)找到分泌到宿主細胞質(zhì)中的衣原體蛋白酶或蛋白酶體樣活性因子CPAF (chlamydial protease/proteasome-like activity factor) ， CPAF對降角牟宿主主 要組織相容性復合物(MHC)的轉(zhuǎn)錄因子rfx5和上游刺激因子l (USF-1)不僅是足 夠的，而且是必須的(Zhong et al.， 2001)。
抑制宿主受感染細胞凋亡是衣原體成功生存和繁殖所采用的另一個策略 (Byrne and Ojcius， 2004; Fan et al. ， 1998; Fischer et al. ， 2004; Greene et al., 2004; Miyairi and Byrne， 2006):已經(jīng)證明衣原體通過降解BH3-only凋亡 蛋白來抑制受感染宿主細胞的凋亡，最近研究表明CPAF也在此過程中發(fā)揮重要作 用，研究發(fā)現(xiàn)CPAF能降解廣譜的朋3-only前凋亡蛋白，例如P咖a等(Pirbhai et al.， 2006)。
除了降解rfx5、 USF-1、 BH3-only蛋白，CPAF還能降解細胞骨架中間纖維蛋白keratin 8，對衣原體蛋白CPAF此行為的解釋是通過降解細胞骨架中間纖維蛋白 keratin 8使得宿主細胞具有更好的流動性，有利于含有不斷增殖衣原體的液泡的 擴張；同時有利于受感染細胞的裂解從而衣原體得以繼續(xù)感染新的細胞，吸收養(yǎng)分 (Dong et al. ， 2004)。
CPAF是一類功能高度保守的基因，在不同種的衣原體中都有表達(Dong et al.， 2005; Shaw et al., 2002)，而且都顯示出相似的蛋白酶活性(Dong et al. ， 2005)， 但和其他基因并沒有很高的同源性。在未感染宿主細胞的衣原體內(nèi)并沒檢測到CPAF 的存在，只有當衣原體感染宿主細胞后復制時才表達、分泌(Jyotika Sharma et al.， 2005)，剛翻譯出來的CPAF是沒有活性的70kDa酶原。有趣的是，盡管CPAF 由衣原體中一個閱讀框編碼，但純化出的CPAF主要是以29-kDa的N-末端(CPAFn) 和35-kDa的C-末端片段(CPAFc)出現(xiàn)，實驗顯示對其中的一個片段特異識別的抗 體總是免疫共沉淀出CPAF這兩段，而且沉淀是有活性的(Zhong et al. ， 2001), 說明CPAFN-末端(CPAFn)和C-末端(CPAFc)是結(jié)合在一起的，而且這兩段形成 的分子內(nèi)二聚體是它的催化活性所必需的，實驗證明無論是單獨的CPAFn還是 CPAFc，或不形成分子內(nèi)二聚體的CPAFn和CPAFc的混合物都沒有對rfx5的降解活 性(Dong et al.， 2004)，這也就意味著在CPAF內(nèi)部進行蛋白酶剪切形成的分子 內(nèi)二聚體對它的激活很重要。事實上，將全長CPAF剪切為CPAFc/n是它由酶原形 式轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚誀顟B(tài)的充分必要條件(Dong et al. ， 2004; Fan et al. ， 2002)。 盡管在衣原體種間有些CPAF僅有48%的序列一致性，但CPAF的激活機制在衣原體 種間是非常保守的(Dong et al.， 2005)，尤為重要的是，CPAF的激活機制可能是
一個生物學相關(guān)的過程，因為從臨床沙眼衣原體(GW3/Z^07a traC力OTffi3"'W分離
的CPAF同樣被剪切為CPAFc和CPAFn，這正好與它產(chǎn)生降解RFX5的活性過程一致 (Dong et al. ， 2004)。
基于CPAF在衣原體致病過程中的重要作用，高效率提純具有生物活性的CPAF， 對于生產(chǎn)疫苗、臨床診斷都具有重大意義。但是現(xiàn)有CPAF的分離、純化方法只能 得到非常少量的蛋白質(zhì)(只有通過非常敏感的檢測方法，如Western,才能檢測到)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供衣原體蛋白酶體樣活性因子的活性片段。 本發(fā)明所提供的衣原體蛋白酶體樣活性因子的活性片段，是下述多肽之一 1)是將由序列表中序列1的氨基酸殘基序列組成的多肽自氨基末端的第1位氨基酸殘基開始，向羧基末端連續(xù)缺失10至40個氨基酸殘基得到的31個多肽之
一；或是將所述31個多肽的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有降解主要組織相容性復合物的轉(zhuǎn)錄因子RFX5的活性的多肽 之一；
2)是將由序列表中序列1的氨基酸殘基序列組成的多肽自氨基末端的第1位 氨基酸殘基開始，向羧基末端連續(xù)缺失10至40個氨基酸殘基，并且自氨基末端的 第609位氨基酸殘基開始，向氨基末端連續(xù)缺失10個氨基酸殘基得到的31個多肽 之一。
所述衣原體蛋白酶體樣活性因子的活性片段，具體可以是下述多肽之一
1) 其氨基酸序列為序列表中序列1自氨基末端起第11-609位氨基酸殘基所示 的氨基酸序列；
2) 其氨基酸序列為序列表中序列1自氨基末端起第21-609位氨基酸殘基所示 的氨基酸序列；
3) 其氨基酸序列為序列表中序列1自氨基末端起第25-609位氨基酸殘基所示 的氨基酸序列；
4) 其氨基酸序列為序列表中序列1自氨基末端起第31-609位氨基酸殘基所示 的氨基酸序列；
5) 其氨基酸序列為序列表中序列1自氨基末端起第41-609位氨基酸殘基所示 的氨基酸序列；
6) 其氨基酸序列為序列表中序列1自氨基末端起第11-599位氨基酸殘基所示 的氨基酸序列；
7) 其氨基酸序列為序列表中序列1自氨基末端起第21-599位氨基酸殘基所示 的氨基酸序列；
8) 其氨基酸序列為序列表中序列1自氨基末端起第31-599位氨基酸殘基所示 的氨基酸序列。
上述任一種活性片段的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。 含有上述任一所述編碼基因的表達盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也屬
于本發(fā)明的保護范圍。
所述重組載體具體可以是在pET系列載體的多克隆位點插入所述編碼基因得
到的重組表達載體。本發(fā)明的另一個目的是提供一種表達上述任一所述活性片段的方法。 本發(fā)明所提供的表達上述任一所述活性片段的方法，包括如下步驟將上述 pET系列重組載體導入大腸桿菌BL21細胞，然后將其在37。C條件下培養(yǎng)至所述大 腸桿菌BL21細胞的溶液的0De。。值達到0.6-1.0，進行IPTG誘導，表達得到所述活 性片段。
其中，所述IPTG誘導的條件具體可以為在25'C條件進行誘導、所述IPTG 的終濃度可以為O. 1raM。
所述誘導的時間可以為10-12小時。
所述大腸桿菌BL21可以為大腸桿菌BL21 (DE3)、大腸桿菌BL21 (DE3plus) 和大腸桿菌BL21 (Rosseta)中的至少一種。
本發(fā)明通過利用DNA重組技術(shù)，在大腸桿菌中高效表達8種CPAF活性片段的 酶原，這些酶原多肽在體外能夠自我活化。本發(fā)明所提供的8種CPAF活性片段表 達量高、降解主要組織相容性復合物的轉(zhuǎn)錄因子RFX5的能力強，即活性高。本發(fā) 明的表達8種CPAF活性片段的方法具有酶原表達量高、活化后的多肽活性高的特 點。因此，本發(fā)明的8種CPAF活性片段及其表達方法對生產(chǎn)疫苗具有重要的意義。


圖l為基因克隆流程圖。
圖2為活性片段(1-609)和(1-599)的表達量與可溶性。 圖3為活性片段(11-599) 、 (21-599)和(31-599)的表達量與可溶性。 圖4為活性片段(11-609)和(41-609)的表達量與可溶性。 圖5為活性片段(21-609) 、 (25-609)和(31-609)的表達量與可溶性。 圖6為活性片段各多肽酶原在離子交換柱上的洗脫峰(A)和收集洗脫峰附近
的樣品的電泳圖(B)。
圖7為活性片段各多肽在體外活化過程中不同時間點取樣電泳圖。 圖8為活化后的活性片段在凝膠過濾層析柱上的洗脫峰(A)和收集洗脫峰附
近的樣品的電泳圖(B)。
圖9為活化后活性片段的體外酶活性分析。
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明均為常規(guī)方法。
實施例l、 IO種衣原體蛋白酶體樣活性因子(CPAF)的活性片段的表達及活性分析
一、 表達條件的優(yōu)化
蛋白表達條件的優(yōu)化目的是獲得高產(chǎn)量的正確折疊的目的蛋白。篩選表達溫度
(15-37°C)并調(diào)節(jié)誘導劑量來優(yōu)化CPAF的表達，并結(jié)合更換表達宿主細胞株類型
和選擇誘導時機來進一步優(yōu)化表達條件。
(1) 表達溫度的優(yōu)化
用于蛋白表達的宿主大腸桿菌細胞一般在攝氏37"C時生長代謝最好，但在此溫 度下處于強啟動子下的外源蛋白基因表達過快，可能造成折疊錯誤。因此，常常進 行低溫表達。但低溫下宿主大腸桿菌細胞新陳代謝降低，影響蛋白的表達量水平。 所以，平衡好降低溫度提高正確折疊的蛋白比率和低溫下影響蛋白表達量水平的問 題是能否獲得盡可能多的正確折疊的目的蛋白的關(guān)鍵。
試驗表明，當表達溫度為37'C時，CPAF活性片段表達量很高但有相當一部分 不溶；而當表達溫度為15"時，雖然CPAF活性片段可溶性提高，但總目的蛋白表 達量水平下降很多。最終經(jīng)親和純化檢測了在1L表達體系下的可溶性目的蛋白產(chǎn) 率，確定在25"C (室溫)時誘導表達最優(yōu)。
(2) 誘導劑濃度的調(diào)節(jié) 許多類型的大腸桿菌表達系統(tǒng)是誘導劑劑量-表達水平相關(guān)型。調(diào)節(jié)誘導劑濃
度可以控制目的蛋白表達的速率，提高蛋白表達量，減少錯誤折疊水平。
經(jīng)試驗最終確定誘導劑(IPTG)終濃度為O. lmM左右時，表達達到最優(yōu)水平。
(3) 誘導表達時機
根據(jù)經(jīng)驗在大腸桿菌濃度在0De。。測定量為0. 6 1時蛋白表達最優(yōu)，部分不溶 性蛋白在低濃度(0D,約0.3)下可提高其溶解性。而CPAF活性片段在不同的大腸 桿菌濃度下誘導后的溶解性基本不變，因此為提高蛋白表達水平，確定在0D,達到 l.O時進行誘導。
(4) 誘導時間
根據(jù)降低溫度提高誘導時間的經(jīng)驗原則，確定在25°C (室溫)表達時過夜表達。
(5) 不同菌株
測試了如下幾種大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3) 、 BL21 (DE3plus)和BL21 (Rosseta)，未發(fā)現(xiàn)對CPAF的表達產(chǎn)生明顯影響。
二、 10種多肽的表達(一)IO種多肽的編碼基因的擴增
本實施例表達了 IO個多肽CPAF全長蛋白CPAF (1-609)及以下9個活性片 段CPAF (11-609) 、 CPAF (21-609) 、 CPAF (25-609) 、 CPAF (31-609) 、 CPAF (41-609) 、 CPAF (1-599) 、 CPAF (11-599) 、 CPAF (21-599)和CPAF (31-599)。 具體的實驗方法和實驗結(jié)果如下
以人工合成的沙眼衣原體基因組中GeneID為884659的核苷酸序列為模板，用 設(shè)計的IO對引物分別進行PCR擴增反應體積為50ul，其中含有O. 5ulCPAF模 板、1.0 ul Pfu酶。94。C變性4分鐘后，開始30個循環(huán)，每次循環(huán)94。C變性30 秒，54"C退火30秒，72t:延伸3分鐘。循環(huán)結(jié)束后，72。C最后延伸10分鐘。
擴增10種多肽的引物序列如下
1. CPAF—l一ndel一5: 5'-gaa att cat atg GGTTTTTGGAGAACA-3'
2. CPAF—11—nde1—5
3. CPAF一21—ndel—5
4. CPAF一25—ndel—5
5. CPAF一31—ndel—5
6. CPAF 41 ndel 5
5，-gaa att cat atg AATAGGATTTGGCTATTA-3' 5'-gaa att cat atg TTTTCTTCTGCCATACAT-3， 5，-gaa att cat atg ATACATTCTCCTGTACAA-3' 5，-gaa att cat atg GGAGAAAGCTTGGTTTGC-3' 5' -gaa att cat atg CAAGATTTGAGTTTTTTA-3，
7. CPAF一609—xhol—3: 5，-gaa att etc gag AAAACTACCATCTTCCGC-3，
8. CPAF—599—xhol—3: 5，-gaa att etc gag ACCGTCGTTATTGATCAG-3'
其中，多肽(1-609)的編碼基因是由上述引物1和引物7擴增得到的，該編 碼基因所編碼的氨基酸序列如序列表中序列1所示，共609個氨基酸，自其N-端起 第1-18個氨基酸可能為信號肽序列；多肽(1-599)的編碼基因是由上述引物l和 引物8擴增得到的，多肽(11-609)的編碼基因是由上述引物2和引物7擴增得到 的，多肽(21-609)的編碼基因是由上述引物3和引物7擴增得到的，多肽(25-609) 的編碼基因是由上述引物4和引物7擴增得到的，多肽(3卜609)的編碼基因是由 上述引物5和引物7擴增得到的，多肽(41-609)的編碼基因是由上述引物6和引 物7擴增得到的，多肽(11-599)的編碼基因是由上述引物2和引物8擴增得到的， 多肽(21-599)的編碼基因是由上述引物3和引物8擴增得到的，多肽(31-599) 的編碼基因是由上述引物5和引物8擴增得到的。
所有PCR產(chǎn)物均用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析，GoldView染色。用DNA純化 試劑盒回收PCR產(chǎn)物?；厥盏腜CR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI雙酶切后，分別連接到用同樣雙酶切的pET-30a表達載體(Novagen)上。構(gòu)建好的重組表達質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌菌株BL21 (DE3)中，37"C在含有卡那霉素(終濃度為50 微克/毫升)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-15個小時。其中LB培養(yǎng)基的組成為每升培 養(yǎng)基中含有10克蛋白胨，5克酵母提取物，10克NaCl， 15克瓊脂粉，其余為水。
陽性的克隆鑒定雙篩選法鑒定陽性克隆
步驟如下
挑選單克隆至lmL含有卡那霉素(終濃度為50微克/毫升)的LB培養(yǎng)基中， 37'C、200RPM振蕩培養(yǎng)1至3小時至菌液明顯渾濁。吸取各個單克隆對應的菌液 作為PCR鑒定的模板進行菌液PCR鑒定。
同時于各管菌液中加入lW濃度為0.6mol/L的IPTG后，在37。C、 200rpm振 蕩環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)并進行目的蛋白的誘導表達；表達1-2小時后，以13， OOOrpm 離心1分鐘收取上述菌液的菌體，加入40W IX SDS上樣緩沖液重懸菌體并經(jīng)過 10(TC變性5分鐘，高速離心l分鐘，收集上清液即為總蛋白樣品；對此蛋白樣品 進行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定對應單克隆的蛋白表達情況。
對照PCR鑒定和表達鑒定的結(jié)果選取并保存雙陽性結(jié)果的單克隆。
實驗過程如圖l所示。 (二) 10種多肽的表達及表達量分析
1、 采用1.0L表達體系將步驟(一)挑選的CPAF陽性克隆接種于含有卡那 霉素的1L LB培養(yǎng)基中，在37。C條件下振蕩培養(yǎng)。當菌體濃度的0De。。值大約0. 6 時，溫度降至25。C，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)l小時；然后加入終濃度為0. lmM的IPTG (異 丙基-e-D-硫代半乳糖苷)，在25'C條件下，震蕩誘導10個小時。
2、 IO種多肽的表達量、可溶性分析
蛋白的各種體外表達體系在表達外源基因時，表達的蛋白常常由于不正確折疊 而形成不溶的包涵體(inclusion body);或因此缺失其功能、造成蛋白性質(zhì)的不 均一。前者是全蛋白不正確折疊造成，后者是局部不正確折疊造成。形成這種不正 確折疊的原因有表達過程過快，表達量過大造成蛋白未能完全折疊；蛋白在過量 表達狀態(tài)下對表達宿主產(chǎn)生毒性促使宿主干預其正確表達；缺乏幫助其正確折疊的 分子伴侶等等。因此，需對目的蛋白進行表達量與可溶性分析并作為表達條件優(yōu)化 的依據(jù)。
一般可溶性的分析的步驟是(1) 將步驟1得到的1L菌液在4。C下、以4, 000 RPM的速度離心15分鐘，收 集菌體；加入30ml重懸緩沖液(25mM Tris, lOOmM NaCl， pH8. 0)，震蕩使菌體 均勻混懸，加入蛋白酶抑制劑PMSF (苯甲基磺酰氟)后超聲裂解細胞，留存裂解的 細胞懸液樣品作為總蛋白樣品，標記為CX。用同樣的方法獲得轉(zhuǎn)入空載體pET-30a 的細菌的總蛋白樣品，以作為陰性對照。
(2) 將已破碎的菌體混懸液高速離心(15000g) 1小時，沉淀菌體碎片及其它 不溶性物質(zhì)，保留上清液以待進一步的純化，并留存此上清液樣品作為可溶性總蛋 白樣品，標記為SU。用同樣的方法獲得轉(zhuǎn)入空載體pET-30a的細菌的可溶性總蛋白 樣品，以作為陰性對照。
(3) 親和純化
a、 將步驟(1)中得到的總蛋白樣品，緩慢通過親和層析介質(zhì)Ni-NTA，留取通 過后的樣品，此樣品為未結(jié)合親和層析介質(zhì)的可溶性蛋白，標記為FT。
b、 用IO個柱體積洗滌緩沖液(25mM Tris，pH8. 0; 100mM NaCl; 15 mM咪唑) 沖洗親和層析介質(zhì)，洗去非特異性附著于介質(zhì)上的蛋白；用洗脫緩沖液(5 10ml， 25mM Tris，pH8.0; lOOmM NaCl; 250 raM咪唑)將目標蛋白洗脫。此樣品代表結(jié)合 于親和層析介質(zhì)的可溶性蛋白，標記為EL。
分別將10種多肽的總蛋白樣品(CX)、可溶性總蛋白樣品(SU)、未結(jié)合親 和層析介質(zhì)的可溶性蛋白(FL)、結(jié)合于親和層析介質(zhì)的可溶性蛋白(EL)并排進 行SDS-PAGE凝膠電泳，上樣量均是4ul。
10種多肽的電泳結(jié)果分別如圖2-5所示。
結(jié)果表明
① 活性片段(1-609)和(1-599)的表達量和可溶性低，即含有前導序列的多 肽在大腸桿菌中的表達量和可溶性降低(圖2);
② 活性片段(11-599)(圖3)和(11-609)(圖4)的表達量和可溶性高。
③ 活性片段(21-609)(圖5)和(21-599)(圖3)的表達量和可溶性高。
④ 活性片段(25-609)的表達量和可溶性最高(圖5)。
⑤ 活性片段(31-609)(圖5)和(31-599)(圖3)的表達量和可溶性高。
⑥ 活性片段(41-609)的表達量和可溶性高(圖4)。
圖2中，CX:細胞粗提物總蛋白；SU:破碎細胞經(jīng)離心后上清液蛋白；FL:上 清液蛋白通過Ni-NTA介質(zhì)后的蛋白；EL:洗脫樣品；麗為標準蛋白分子量。圖3中，CX:細胞粗提物總蛋白；Slh破碎細胞經(jīng)離心后上清液蛋白；EL: 洗脫樣品；MW為標準蛋白分子量。
圖4中，CX:細胞粗提物總蛋白；SU:破碎細胞經(jīng)離心后上清液蛋白；EL1
表示用溶液(5 10ml: 25mM Tris，pH8.0; IOO慮NaCl; 30 raM咪唑)洗脫下來的 蛋白；EL2表示用溶液(5 10ral: 25mM Tris， pH8. 0; lOOmM NaCl; 250 mM咪唑) 洗脫下來的蛋白；MW為標準蛋白分子量。
圖5中，CX:細胞粗提物總蛋白；SU:破碎細胞經(jīng)離心后上清液蛋白；EL: 洗脫樣品；MW為標準蛋白分子量。
綜上結(jié)果表明，刪除多肽的N端的10-40個氨基酸的多肽的表達量及溶解性高； 多肽C端的10個氨基酸不影響其表達量和溶解度。 (4)離子交換柱純化酶原形式的IO種多肽
將步驟(3)得到的從親和層析介質(zhì)Ni-NTA洗脫下來的蛋白質(zhì)(EL)，用溶液 A (25mM Tris ， p朋.0; 5raM DTT)稀釋3倍，上樣到已經(jīng)用溶液A平衡過的離子 交換層析柱上，以溶液A為起始液、以溶液B (25mM Tris pH8. 0; 1. OM NaCl; 5raM DTT)為終止液進行梯度洗脫，流速為4毫升/分鐘，氯化鈉的濃度的變化速度為 20慮/L/min，溫度為4。C。收集各洗脫峰并進行SDS-PAGE電泳檢測蛋白質(zhì)。
實驗設(shè)3次重復。
3次重復下IO種多肽的峰面積的平均值分別為:(1-609):0raAU*ml; (1-599): OmAU*ml; (11-599) : 596. 5mAU*ml; (11-609) : 596. 5mAU*ml; (21-609): 2982. 5mAU*ml; (21-599) : 2982. 5mAU*ml; (25-609) : 4772mAU*ml; (31-609): 2982. 5mAU*ml; (31-599) : 2982. 5mAU*ml; (41-609) : 2386mAU*ml。收集的洗 脫峰的電泳圖表明均為單一的目的條帶(圖6，其中，A為多肽在離子交換柱上的 洗脫峰；B為洗脫峰附近的樣品的電泳圖)。 (三)IO種多肽的活化及純化 (1) IO種多肽的活化
將步驟(二)從離子交換柱洗脫下來的、有洗脫峰的收集管中的蛋白質(zhì)進行合 并，使其終濃度為5毫克/毫升，將其放置室溫(25°C) 3-12小時；其間在不同時 間點取樣進行SDS-PAGE電泳分析。
活化結(jié)果表明，在活化過程中，CPAF酶原蛋白經(jīng)過中間體逐漸活化成為有活性 的兩個亞基，其中多肽(25—609)共需3個小時即可完全活化為有活性的兩個亞基(圖7，其中，CPAF為活化前的酶原蛋白；CPAFn和CPAFc為活化后CPAF的兩 個亞基，而CPAFcl和CPAFc2為CPAFc的兩個中間體。) (2)活化后多肽的純化
將經(jīng)過活化的IO種多肽分別濃縮至10毫克/毫升，上樣到已經(jīng)經(jīng)過溶液C(10raM Tris pH8. 0; lOOmM NaCl; 5mM DTT)平衡過的凝膠過濾層析柱Superdex-200上， 流速0. 5毫升/分鐘，0. 5毫升/管。收集各峰并進行SDS-PAGE電泳檢測。
實驗設(shè)3次重復。
活化后的10種多肽的3次重復的峰面積的平均值分別為(1-609) : OmAU*ml; (1-599):0mAU*ml; (11-599):477. 2mAU*ml; (11-609):477. 2mAU沐ml; (21-609): 2386mAU*ml; (21-599) : 2386mAU*ml; (25-609) : 3817. 6mAU*ml; (31-609): 2386mAU*ml; (31-599) : 2386mAU*ml; (41-609) : 1908. 8mAU*ml。收集的洗脫 峰的電泳圖表明均為29KD和35KD的兩個亞基(CPAFn和CPAFc)(圖8，其中，A 為經(jīng)過活化后的多肽在凝膠過濾層析柱上的洗脫峰；B為收集洗脫峰附近的電泳 圖)。
實驗設(shè)3次重復。經(jīng)活化純化后，IO種多肽的量的平均值分別為(1-609): Omg/L菌液;(1-599) : Omg/ L菌液;(11-599) : 2mg/ L菌液;(11-609): 2mg/L菌液;(21-609) : 10mg/L菌液;(21-599) : 10mg/L菌液;(25-609): 16mg/L菌液；(31-609) : 10mg/L菌液；(31-599) : 10mg/L菌液；(41-609): 8mg/ L菌液。
(四)IO種活化及純化后多肽的活性分析
衣原體蛋白酶體樣活性因子(CPAF)的活性片段可以降解宿主細胞內(nèi)的多種蛋 白。本實驗中以純化的RFX5 (氨基酸181-616)作為底物，來檢測經(jīng)過凝膠過濾層 析純化活化的IO種多肽的活性。
多肽的活性定義為1微克多肽每分鐘降解的RFX5的量。
具體方法如下分別將l微克步驟(三)得到的IO種活化純化后的多肽，與 100微克RFX5混合，并用溶液D (25mM Tris， pH8. 0; 150mM NaCl; 5mM DTT)稀 釋至100微升；將其置于4T:條件下一段時間，其間，在不同時間點取樣進行 SDS-PAGE電泳分析反應后的產(chǎn)物。
結(jié)果表明，在以上條件下，10種多肽在2分鐘內(nèi)即可將RFX5完全降解(圖9， 圖中CPAFn和CPAFc分別為活化CPAF的兩個亞基)。8種多肽的活性分別為(11-599) : 12ug RFX5/lug多肽'min;
(21-609) : 54ug RFX5/lug多肽'min;
(25-609) : 90ug RFX5/lug多肽，min;
(31-599) : 54ug RFX5/lug多肽'min;
(11-609) : 12ug RFX5/lug多肽* min;
(21-599) : 54ug RFX5/lug多肽* rain;
(31-609) : 54ug RFX5/lug多肽* min;
(41—609) : 44ug RFX5/lug多肽* min。序列表
〈160〉1
<210>
〈211〉
〈212〉 <213>
609 Pro
衣原體屬沙眼衣原體(CMa/^A'3 7h3C力0歷3"5)
<400>
Met Gly Phe Trp Arg Thr Ser lie Met Lys Met Asn Arg lie Trp Leu 15 10 15
Leu Leu Leu Thr Phe Ser Ser Ala lie His Ser Pro Val Gin Gly Glu 20 25 30
Ser Leu Val Cys Lys Asn Ala Leu Gin Asp Leu Ser Phe Leu Glu His 35 40 45
Leu Leu Gin Val Lys Tyr Ala Pro Lys Thr Trp Lys Glu Gin Tyr Leu 50 55 60
Gly Trp Asp Leu Val Gin Ser Ser Val Ser Ala Gin Gin Lys Leu Arg 65 70 75 80
Thr Gin Glu Asn Pro Ser Thr Ser Phe Cys Gin Gin Val Leu Ala Asp 85 90 95
Phe lie Gly Gly Leu Asn Asp Phe His Ala Gly Val Thr Phe Phe Ala100 105 110
lie Glu Ser Ala Tyr Leu Pro Tyr Thr Val Gin Lys Ser Ser Asp Gly 115 120 125
Arg Phe Tyr Phe Val Asp lie Met Thr Phe Ser Ser Glu lie Arg Val 130 135 140
Gly Asp Glu Leu Leu Glu Val Asp Gly Ala Pro Val Gin Asp Val Leu 145 150 155 160
Ala Thr Leu Tyr Gly Ser Asn His Lys Gly Thr Ala Ala Glu Glu Ser 165 170 175
Ala Ala Leu Arg Thr Leu Phe Ser Arg Met Ala Ser Leu Gly His Lys 180 185 190
Val Pro Ser Gly Arg Thr Thr Leu Lys lie Arg Arg Pro Phe Gly Thr 195 200 205
Thr Arg Glu Val Arg Val Lys Trp Arg Tyr Val Pro Glu Gly Val Gly 210 215 220
Asp Leu Ala Thr lie Ala Pro Ser lie Arg Ala Pro Gin Leu Gin Lys 225 230 235 240
Ser Met Arg Ser Phe Phe Pro Lys Lys Asp Asp Ala Phe His Arg Ser 245 250 255
Ser Ser Leu Phe Tyr Ser Pro Met Val Pro His Phe Trp Ala Glu Leu260 265 270
Arg Asn His Tyr Ala Thr Ser Gly Leu Lys Ser Gly Tyr Asn lie Gly 275 280 285
Ser Thr Asp Gly Phe Leu Pro Val lie Gly Pro Val lie Trp Glu Ser 290 295 300
Glu Gly Leu Phe Arg Ala Tyr lie Ser Ser Val Thr Asp Gly Asp Gly 305 310 315 320
Lys Ser His Lys Val Gly Phe Leu Arg lie Pro Thr Tyr Ser Trp Gin 325 330 335
Asp Met Glu Asp Phe Asp Pro Ser Gly Pro Pro Pro Trp Glu Glu Phe 340 345 350
Ala Lys lie lie Gin Val Phe Ser Ser Asn Thr Glu Ala Leu lie lie 355 360 365
Asp Gin Thr Asn Asn Pro Gly Gly Ser Val Leu Tyr Leu Tyr Ala Leu 370 375 380
Leu Ser Met Leu Thr Asp Arg Pro Leu Glu Leu Pro Lys His Arg Met 385 390 395 400
lie Leu Thr Gin Asp Glu Val Val Asp Ala Leu Asp Trp Leu Thr Leu 405 410 415
Leu Glu Asn Val Asp Thr Asn Val Glu Ser Arg Leu Ala Leu Gly Asp420 425 430
Asn Met Glu Gly Tyr Thr Val Asp Leu Gin Val Ala Glu Tyr Leu Lys 435 440 445
Ser Phe Gly Arg Gin Val Leu Asn Cys Trp Ser Lys Gly Asp lie Glu 450 455 460
Leu Ser Thr Pro lie Pro Leu Phe Gly Phe Glu Lys lie His Pro His 465 470 475 480
Pro Arg Val Gin Tyr Ser Lys Pro lie Cys Val Leu lie Asn Glu Gin 485 490 495
Asp Phe Ser Cys Ala Asp Phe Phe Pro Val Val Leu Lys Asp Asn Asp 500 505 510
Arg Ala Leu lie Val Gly Thr Arg Thr Ala Gly Ala Gly Gly Phe Val 515 520 525
Phe Asn Val Gin Phe Pro Asn Arg Thr Gly lie Lys Thr Cys Ser Leu 530 535 540
Thr Gly Ser Leu Ala Val Arg Glu His Gly Ala Phe lie Glu Asn lie 545 550 555 560
Gly Val Glu Pro His lie Asp Leu Pro Phe Thr Ala Asn Asp lie Arg 565 570 575
Tyr Lys Gly Tyr Ser Glu Tyr Leu Asp Lys Val Lys Lys Leu Val Cys580
585
590
Gin Leu lie Asn Asn Asp Gly Thr lie lie Leu Ala Glu Asp Gly Ser 595 600 605
Phe
權(quán)利要求
1、衣原體蛋白酶體樣活性因子的活性片段，是下述多肽之一1)是將由序列表中序列1的氨基酸殘基序列組成的多肽自氨基末端的第1位氨基酸殘基開始，向羧基末端連續(xù)缺失10至40個氨基酸殘基得到的31個多肽之一；或是將所述31個多肽的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有降解主要組織相容性復合物的轉(zhuǎn)錄因子RFX5的活性的多肽之一；2)是將由序列表中序列1的氨基酸殘基序列組成的多肽自氨基末端的第1位氨基酸殘基開始，向羧基末端連續(xù)缺失10至40個氨基酸殘基，并且自氨基末端的第609位氨基酸殘基開始，向氨基末端連續(xù)缺失10個氨基酸殘基得到的31個多肽之一。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的活性片段，其特征在于所述衣原體蛋白酶體樣活性因子的活性片段，是下述多肽之一1) 其氨基酸序列為序列表中序列1自氨基末端起第11-609位氨基酸殘基所示 的氨基酸序列；2) 其氨基酸序列為序列表中序列1自氨基末端起第21-609位氨基酸殘基所示 的氨基酸序列；3) 其氨基酸序列為序列表中序列1自氨基末端起第25-609位氨基酸殘基所示 的氨基酸序列；4) 其氨基酸序列為序列表中序列1自氨基末端起第31-609位氨基酸殘基所示 的氨基酸序列；5) 其氨基酸序列為序列表中序列1自氨基末端起第41-609位氨基酸殘基所示 的氨基酸序列；6) 其氨基酸序列為序列表中序列1自氨基末端起第11-599位氨基酸殘基所示 的氨基酸序列；7) 其氨基酸序列為序列表中序列1自氨基末端起第21-599位氨基酸殘基所示 的氨基酸序列；8) 其氨基酸序列為序列表中序列1自氨基末端起第31-599位氨基酸殘基所示 的氨基酸序列。
3、 權(quán)利要求1或2任一所述活性片段的編碼基因。
4、 含有權(quán)利要求3所述編碼基因的表達盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體是在pET系列載體的多克隆位點插入所述編碼基因得到的重組表達載體。
6、 表達權(quán)利要求1或2所述活性片段的方法，包括如下步驟將權(quán)利要求5 所述重組載體導入大腸桿菌BL21細胞，然后將其在37T:條件下培養(yǎng)至所述大腸桿 菌BL21細胞的溶液的0D6。。值達到0.6-1.0，進行IPTG誘導，表達得到所述活性片 段。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述IPTG誘導的條件為在25 'C條件進行誘導、所述IPTG的終濃度為0. lmM。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述誘導的時間為10-12 小時。
9、 根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于所述大腸桿菌BL21為 大腸桿菌BL21 (DE3)、大腸桿菌BL21 (DE3plus)和大腸桿菌BL21 (Rosseta) 中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了衣原體蛋白酶體樣活性因子的活性片段。本發(fā)明所公開的衣原體蛋白酶體樣活性因子的活性片段，是下述多肽之一1)是將由序列表中序列1的氨基酸殘基序列組成的多肽自氨基末端的第1位氨基酸殘基開始，向羧基末端連續(xù)缺失10至40個氨基酸殘基得到的31個多肽之一；2)是將由序列表中序列1的氨基酸殘基序列組成的多肽自氨基末端的第1位氨基酸殘基開始，向羧基末端連續(xù)缺失10至40個氨基酸殘基，并且自氨基末端的第609位氨基酸殘基開始，向氨基末端連續(xù)缺失10個氨基酸殘基得到的31個多肽之一。本發(fā)明所提供的8種CPAF活性片段具有酶原表達量高、活化后的多肽活性高的特點。因此，本發(fā)明的8種CPAF活性片段及其表達方法對生產(chǎn)疫苗具有重要的意義。
文檔編號C12N15/57GK101298611SQ20081011482
公開日2008年11月5日 申請日期2008年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月12日
發(fā)明者柴繼杰, 黃志偉 申請人:北京生命科學研究所