專利名稱：：牡丹ACC合成酶基因Ps-ACS1特異性探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及牡丹ACC合成酶基因iVJGS/的特異性探針。
背景技術(shù)：
：牡丹(尸aeo"/aw,i^cosa)是中國(guó)傳統(tǒng)名花中的精品，素有"國(guó)色天香"、"花中之王"的美譽(yù)，它花大色艷，不僅深受我國(guó)人民的喜愛，而且也符合西方人的審美觀，因此逐漸成為目前世界上最流行的花木之一。近年來(lái)，隨著巿場(chǎng)對(duì)鮮切花需求的日益增長(zhǎng)，除了園林用苗及盆花以外，牡丹切花的潛在國(guó)際巿場(chǎng)也日趨擴(kuò)大。然而，由于牡丹自然花期集中、單朵花花期短、釆后貯運(yùn)保鮮技術(shù)不過(guò)關(guān)，致使鮮切花質(zhì)量難以保證、無(wú)法實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期和遠(yuǎn)距離供貨，這不僅成為制約我國(guó)牡丹切花產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的重要因素之一，而且為此還失去了很多創(chuàng)匯良機(jī)。被稱為衰老激素的乙烯與切花衰老的關(guān)系密切，多年來(lái)一直是切花衰老研究的熱點(diǎn)。目前，已發(fā)現(xiàn)乙烯的大量產(chǎn)生是促使牡丹切花衰老的重要生理原因之一(史國(guó)安等，1997,1999);在此基礎(chǔ)上，我們對(duì)13個(gè)牡丹品種內(nèi)源乙烯代謝特征進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，以牡丹'洛陽(yáng)紅，為代表的幾種切花乙烯釋放量與花朵開放衰老進(jìn)程密切相關(guān)(Jiaetal.，2006)，但其對(duì)外源乙烯的反應(yīng)卻非常復(fù)雜(Zhouetal.，2006)。因此，為了探明乙烯在牡丹切花開放衰老進(jìn)程中的作用機(jī)理，從而為其采后保鮮技術(shù)的開發(fā)提供理論依據(jù)，還需要更深入的研究。自乙烯生物合成途徑揭示以來(lái)(YangandHoffman,1984)，切花乙烯致衰機(jī)理的研究逐漸進(jìn)入到分子水平。在乙烯生物合成途徑中，有ACC合成酶(ACS)和ACC氧化酶(ACO)兩個(gè)關(guān)鍵酶。其中，ACS被認(rèn)為是乙烯生物合成中的限速酶，它由一個(gè)多基因家族編碼(JohnsonandEcker，1998;Geetal.,2000),且不同成員受不同因子(包括發(fā)育信號(hào)、植物激素和環(huán)境刺激等)的誘導(dǎo)而產(chǎn)生乙烯(Za腿binskiandTheologis,1997;BuiandO'Neill,1998)。目前，香石竹(Parketal.,1992;VanAltvorstandBovy,1995)、月季(Wangetal.,2004)及蘭花(O'Neiletal.，1993)等許多觀賞植物中的爿CS基因在花朵開放衰老進(jìn)程中的分子調(diào)控機(jī)理研究相繼開展。但在牡丹，甚至整個(gè)芍藥科中，」GS基因的克隆及其調(diào)控機(jī)理的研究還未有報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供牡丹ACC合成酶基因戶^4C^的特異性探針，為AJCW基因的后續(xù)功能研究和應(yīng)用提供基礎(chǔ)。本發(fā)明所述的特異性探針具有序列表SEQIDNO.l所示的核苷酸序列或者其有效長(zhǎng)度片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)能理解，這里所述的有效長(zhǎng)度片段是按照SEQIDNO.l產(chǎn)生的指能夠與尸5""CS7特異雜交的序列。這些序列長(zhǎng)度優(yōu)選60bp以上。探針的標(biāo)記物可以是放射性標(biāo)記或者是非放射性標(biāo)記，例如釆用熒光標(biāo)記?？梢詫⑸鲜鎏结樑c適當(dāng)?shù)脑噭┙M成試劑盒，以方便使用。通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明探針具有良好的特異性，能夠用于P^4CW基因的特異性檢測(cè)。本發(fā)明首次從牡丹'洛陽(yáng)紅'花瓣中分離A"CS/基因，并合成了該基因的特異性探針，避免了在基因表達(dá)分析研究中因?yàn)橥葱暂^高而帶來(lái)的其它基因家族成員的表達(dá)干擾，有利于在此基礎(chǔ)上研究^CS不同成員在牡丹乙烯反應(yīng)中的調(diào)控機(jī)理及作用模式。為全面了解乙烯與牡丹切花開花衰老的關(guān)系、揭示乙烯在其采后開花和衰老進(jìn)程中的作用模式和調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)。圖la、圖lb(續(xù)圖la)A-基因cDNA全長(zhǎng)核苷酸及推定的氨基酸序列，其中小寫字母表示非翻譯區(qū)，星號(hào)表示終止子，陰影區(qū)表示ACC合成酶的7個(gè)保守區(qū)，方框內(nèi)為所有轉(zhuǎn)氨酶中保守存在的氨基酸殘基，劃線部分為ACC合成酶的活性中心，加粗的氨基酸殘基表示結(jié)合磷酸吡哆醛和蛋氨酸的賴氨酸殘基活性位點(diǎn)；圖2牡丹P^4CS7基因Southern雜交分析。將'洛陽(yáng)紅，幼嫩葉片中提取的30jugDNA,以五coRI(a)、五coRV(b)、///"dll(c)進(jìn)行酶切，0.8%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，分別以地高辛標(biāo)記的中間片段探針(A)和特異性探針(B)進(jìn)行雜交；圖3乙烯和1-MCP處理對(duì)'洛陽(yáng)紅，花瓣內(nèi)i^-v4CW基因表達(dá)的影響。切花在測(cè)定乙烯生成量后立即用來(lái)花瓣取樣提取總RNA,每個(gè)泳道為20jag總RNA,以rRNA為內(nèi)參來(lái)衡量總RNA上樣量。數(shù)字代表牡丹切花的開花指數(shù)。每次雜交均重復(fù)至少兩次。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例liV^CW基因的克隆1.牡丹花瓣總RNA的提取(1)RNA提取所用的塑料、玻璃器皿和試劑配制均按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)進(jìn)行去除Rnase處理。(2)取牡丹'洛陽(yáng)紅，盛開期花朵的花瓣樣品l.Og，液氮中研磨至粉末后，迅速轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，加入65。C預(yù)熱的CTAB提取液600|aL(2%CTAB,2%PVP，100mMTrisCl(pH8.0),10mMNaCl,25mMEDTA(pH8.0),2%(3-巰基乙醇(使用前加入))，蓋緊蓋子，立即劇烈渦旋振蕩30s，使粉末完全分散在溶液中，65'C溫浴2-5min,期間劇烈渦旋振蕩3-5次，冷卻至室溫后，向上述混合液中加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)抽提兩次，每次渦旋振蕩5min后，室溫或18。C下10,000rpm離心15min，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中，加入1/4體積lOMLiCl,混勻，4。C過(guò)夜沉淀后，4°C，10,000rpm離心20min收集沉淀，用500juLSSTE(l.OMNaCl，0.5%SDS，10mMTrisCl，1mMEDTA)緩沖液溶解沉淀，加入等體積的氯仿/異戊醇再抽提l-2次。轉(zhuǎn)移上清后加入2倍體積無(wú)水乙醇，-2(TC放置2h或—70。C放置30min,4。C，10，000rpm離心20min,沉淀RNA，先后用500)aL70y。乙醇、500mL無(wú)水乙醇漂洗沉淀，超靜臺(tái)上吹干后，用30jaLRNase-freeddH20溶解。瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測(cè)其質(zhì)量并計(jì)算總RNA含量(RNA含量=0260x0.04x稀釋倍數(shù))，保存于-8(TC超低溫冰箱中備用。2.牡丹ft-^:s2基因同源片段的克隆(1)反轉(zhuǎn)錄取2iag上述總RNA,加DEPCddH20至9.5|aL，70°C變性5min，立即冰洛2min后稍微離心。按表1依次加入各組分。42。C水洛60min，-2(TC保存?zhèn)溆?。?反轉(zhuǎn)錄體系<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(2)PCR擴(kuò)增按表2依次加入各組分后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所用引物為:ACS-F:5'-CGGGATCCGTATCAAGATTATCATGG-3'ACS-R:5'-AACTGCAGGAGAGGCTGTAGAGAATATG-3'表2PCR反應(yīng)體系組分體積(w1)PCR程序ddH2013PCR10Xbuffer(Mg2+，2.0mM)2.595°C4mindNTPmix(2.5mM)230-35cycles:引物1(ACS-F)2"95°Clmin引物2(ACS-R)2<53°C40s反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、72'ClminTaqDNA聚合酶0.572°C7min(3)PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠回收將PCR產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分析，紫外燈下切取與預(yù)期片段大小一致的條帶回收，操作方法詳見北京天根生化有限公司產(chǎn)品瓊脂糖凝膠回收試劑盒說(shuō)明書。(4)連接取PCR產(chǎn)物7pL,分別加入lpLT4DNA連接酶10xBuffer,lpLT4DNA連接酶和lpLpGEM-T載體至總體系lOiaL后，混勻，置16'C條件下連接過(guò)夜，然后置-2(TC保存。(5)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞及陽(yáng)性克隆篩選A.大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備釆用氯化鈣制備法，方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)。B.制備LB固體培養(yǎng)基(加100mg/LAmp)，其中含有50jag/mL的氨節(jié)，黑暗中將4)aLIPTG(200mg/mL)及40|aLX-gal(20mg/mL)均勻涂布于平板上，正向吸收l(shuí)-3h。C.用無(wú)菌吸頭吸取200nL感受態(tài)細(xì)胞(冰上操作)置1.5mL7預(yù)冷的無(wú)菌Eppendorf管中，加入10jaL連接產(chǎn)物，輕輕混勻(用手指輕彈管壁3-4下)，立即置于冰上30min。D.將管置42。C恒溫水洛中熱激90s,期間盡量防止搖動(dòng)，并立即放回冰上2min。E.加入800uL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，顛倒混勻，于37。C振蕩培養(yǎng)1-2h(150r/min)。F.5000rpm離心3min后，吸去600juL上清液，將沉淀重新懸浮，于無(wú)菌條件下用細(xì)菌涂布器將上述培養(yǎng)物均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上。G.平板于37。C正向放置至液體完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)過(guò)夜至長(zhǎng)出單菌落(12-16h)。H.用無(wú)菌牙簽挑取白色單菌落于LB(Am+)液體培養(yǎng)基中，37'C條件下振蕩過(guò)夜，提取質(zhì)粒DNA并進(jìn)行菌液PCR鑒定。(6)陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒酶切鑒定取經(jīng)PCR鑒定的單菌落菌液，接種于LB(Am+)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，堿法小量提取質(zhì)粒DNA。取質(zhì)粒7pL，加入2pL酶切緩沖液和lpL五coRI酶，ddH20補(bǔ)足20pL,放至37。C下酶切1-2h后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將連接正確的單克隆委托北京奧科生物公司完成測(cè)序工作。3.牡丹基因cDNA全長(zhǎng)序列的獲得(圖1)按照Race試劑盒SMARTRACEcDNAAmplificationKit說(shuō)明書合成5'和3'RACEcDNA第一鏈，以此為模版分別進(jìn)行RACE擴(kuò)增。其中3'RACE特異性引物為5'-AGCCTCGTTTCATTAGCATTGCAG-3'，5'RACE特異性引物為5'-CTCATGACAATGCGGTCTGGATCGA-3'，在94°C30s，57°C30s，72°C2.5min條件下完成28個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物凝膠回收、連接、轉(zhuǎn)化及鑒定等步驟同上。對(duì)陽(yáng)性克隆測(cè)序后，將兩末端序列與RT-PCR所得到的中間序列相拼接獲得A-JCS7基因cDNA全長(zhǎng)序列。4.戶s-JCWcDNA全長(zhǎng)序列釆用RT-PCR和RACE-PCR相結(jié)合的方法，獲得長(zhǎng)度為1766bp的牡丹Z^-v4GS7cDNA全長(zhǎng)序列(圖1)。利用NCBI提供的ORFFinder進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，該cDNA全長(zhǎng)包含有一個(gè)1479bp的開放讀碼框，編碼492個(gè)氨基酸，5'非翻譯區(qū)長(zhǎng)146bp，3'非翻譯區(qū)長(zhǎng)141bp。ProtParam(http:〃au.expasy.org/tools/protparam.html)預(yù)觀B亥蛋白的分子量是54.91kD,理論等電點(diǎn)為7.15。利用prosite軟件(http:〃npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa—automat.plpage=npsa_prosite.html)預(yù)測(cè)編碼蛋白的特定功能位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，A-v4GS7全長(zhǎng)cDNA編碼蛋白含有1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(N-glycosylationsite)(位于179-182氨基酸殘基NFTV)、2個(gè)環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥苦依賴的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)(cAMP-andcGMP-dependentproteinkinasephosphorylationsite)(位于302-305位的氨基酸殘基RKMS和445-448位的氨基酸殘基KKQS)、4個(gè)蛋白激酶C礫酸化位點(diǎn)(ProteinkinaseCphosphorylationsite)(221-223位的氨基酸殘基TLK，457-459位的氨基酸殘基SFK，460-462位的氨基酸殘基SGK,469-471位的氨基酸殘基SPR)、3個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)(CaseinkinaseIIphosphorylationsite)(185-188位的氨基酸殘基SALE,254-257位的氨基酸殘基SIAE,292-295位的氨基酸殘基SYND)、10個(gè)N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)(N-myristoylationsiteX位于19-24位的氨基酸殘基GNGHGE，53-58位的氨基酸殘基GLAENL，113-118位的氨基酸殘基GGRVTF，308-313位的氨基酸殘基GLVSTQ等)以及1個(gè)轉(zhuǎn)氨酶I類磷酸吡哚醛輔基結(jié)合位點(diǎn)(Aminotransferasesclass-Ipyridoxal-phosphateattachmentsite)(位于275-288位的氨基酸殘基SLSKDMGFPGFRVG)。對(duì)/V^4CWcDNA全長(zhǎng)推測(cè)的氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)(圖1),所編碼的開放閱讀框中存在所有的保守區(qū)(ZarembinskiandTheologis，1997;BleekerandKende，2000)，其中一個(gè)保守區(qū)中還包含了具有結(jié)合磷酸吡哆醛和蛋氨酸能力的賴氨酸殘基活性位點(diǎn)(SLSKDMGFPGFRVG)(Yipetal.,1990)。另外，i亥氨基酸序列中還含有11個(gè)在所有轉(zhuǎn)氨酶中都存在的氨基酸殘基。實(shí)施例2探針的制備及雜交檢測(cè)1.探針制備按照PCRDIGprobesynthesisKit(Roche，Cat.No.1636090)說(shuō)明書，將RT-PCR獲得的iVJCW中間片段進(jìn)行地高辛標(biāo)記，制備探針A。另外，根據(jù)A"C57靠近3'端的序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，Ps-ACS1F:5'-CAGGTCTCTTCTTATGGATGG-3'，Ps-ACSIR:5'-GTAATTAAGCTCGAAGAAGGG-3',以/V^CS73'RACE的產(chǎn)物為模板，進(jìn)行擴(kuò)增片段的地高辛標(biāo)記，制備特異性探針B。反應(yīng)結(jié)東后，取3MlPCR產(chǎn)物檢測(cè)標(biāo)記情況，剩余的探針放于-2(TC冰箱中保存?zhèn)溆谩?.Southern雜交(1)主要試劑及其配制A.變性液0.5MNaOH,1.5MNaCl。B.中和液0.5MTris堿，1.5MNaCl，調(diào)pH值至7.5。C.20xSSC:NaCl175.3g、檸檬酸三鈉88.2g,加ddH20至800ml，用2NNaOH調(diào)pH至7.0，再用ddHiO定容至1000ml,高壓滅菌(3MNaCl，3M檸檬酸鈉)。D.預(yù)雜交液7%SDS，50%去離子甲酰胺，5xSSC，2%Blockingreagent,50mMPh7.0NaH2P04。E.洗膜液I:2xSSC，0.1%SDS。F.洗膜液II:O.lxSSC,0.1%SDS。G.馬來(lái)酸溶液0.1M馬來(lái)酸，0.15MNaCl，用NaOH固體調(diào)節(jié)pH至7.5(20°C)。H.Washingbuffer:馬來(lái)酸溶液中加入0.3%(v/v)Tween20。I.10xblocking:將阻斷劑粉末溶于馬來(lái)酸溶液中至終濃度為10%(W/V),振蕩并加熱助溶，高壓滅菌后，保存在-20'C。J.封閉液按10:1的比例用馬來(lái)酸溶液稀釋10Xblocking，現(xiàn)用現(xiàn)配。K.檢測(cè)液O.lMTris-HCl，0.1MNaClpH9.5(20°C)。L.抗體溶液取出抗體AP(Anti陽(yáng)Digoxingenin)，10,000rpm離心5min,從表面吸取液體。用封閉液按10000-20000:1稀釋，終濃度為75-37.5mU/ml，現(xiàn)用現(xiàn)配。M.顯色液按1:100稀釋CDP-Star于檢測(cè)液中。(2)基因組DNA酶切基因組DNA提取按文獻(xiàn)(MurrayandThompson,1980)的方法進(jìn)行。取基因組DNA30jJg分別經(jīng)五coRI、￡coRV、///"dn等根據(jù)酶說(shuō)明書進(jìn)行酶切過(guò)夜。取5jil酶切產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠上80V電泳lh，紫外檢測(cè)酶切是否徹底。如徹底，則將剩余的酶切產(chǎn)物上樣電泳，用于轉(zhuǎn)膜雜交。(3)電泳向酶切產(chǎn)物中加入1/10V的上樣緩沖液，充分混勻，離心收集，65。C變性10min,冰激5min后，進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳(電壓1~2V/cm)8h，至溴酚蘭遷移至膠的2/3處。(4)轉(zhuǎn)膜按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)進(jìn)行。(5)雜交A.取適量預(yù)雜交液(20ml/100cm2)于雜交管中42。C預(yù)熱后，將膜置于管內(nèi)，不含DNA—面緊貼管壁，排盡氣泡，密封，42匸預(yù)雜交至少lh。B.按照2-4plPCR探針標(biāo)記產(chǎn)物/100cm2，取適量探針到1.5ml離心管中，密封后，置沸水中5-10min變性，然后立即放于冰上5min，用預(yù)熱的適量預(yù)雜交液(3.5ml/100cm2)稀釋，混勻。C.倒掉預(yù)雜交液，沿管壁加入混勻的雜交液，注意不要直接加到膜上并避免產(chǎn)生氣泡，42'C雜交過(guò)夜。D.雜交完成后，將雜交液回收于一可耐低溫又可沸水洛的試管中，貯存在-20'C以備重復(fù)使用。重復(fù)使用時(shí)，解凍并在68'C下變性10min。(6)洗膜A.雜交膜取出后置于塑料盒中，用洗膜液I，室溫下洗膜2次，每次5-10min，除去非結(jié)合探針以減少背景。B.洗膜液II,60-65°C洗膜2次，每次15min。(7)雜交信號(hào)的檢測(cè)按照CDP-Star(購(gòu)自德國(guó)Roche公司)說(shuō)明書進(jìn)行。3.Northern雜交(1)主要試劑及其配制A.0.5MEDTA:EDTA16.61g加ddH20至80ml，調(diào)pH至8.0，定容至100ml,力口DEPClOOjal,振蕩，37。C過(guò)夜，高壓滅菌。B.1MNaAc:NaAcl3.6g加ddfLO至100ml,力卩DEPC100ju1，振蕩，37'C過(guò)夜，高壓滅菌。C.10xMOPS緩沖液準(zhǔn)確稱取41.86gMOPS溶于700mlDEPC-H20中，用2mol/LNaOH調(diào)pH值至7.0，加入DEPC處理的20ml1MNaAc和20ml0.5MEDTA(pH8.0)，DEPC-H20定容至1L,過(guò)濾滅菌后避光保存(200mMMOPS，pH7.0,50mMNaAc,10mMEDTA)。D.甲醛凝膠加樣緩沖液50%甘油，ImMEDTA(pH8.0),0.25%(m/v)溴酚藍(lán)，0.2mg/ml溴化乙錠。E.RNA樣品緩沖液10%10xMOPS緩沖液，17%甲醛，45%去離子甲酰胺。F.10x甲醛凝膠電泳加樣緩沖液50%甘油(稀釋于DEPC處理水中)，10mMEDTA(Ph8.0),0.25%(m/v)溴酚藍(lán)。G.20xSSC:NaCl175.3g、檸檬酸三鈉88.2g,加ddH20至800ml，用2NNaOH調(diào)pH至7.0，再用ddJLO定容至lOOOml。DEPC處理、高壓滅菌(3MNaCl，3M杼檬酸鈉)。其余試劑的配制參考Southern雜交部分。(2)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳A.取不同開花級(jí)別的牡丹'洛陽(yáng)紅，花瓣提取RNA。B.制膠將制膠用具用70%乙醇沖洗一遍，晾干備用。配制1.2%甲醛變性膠稱取1.2g瓊脂糖，置于干凈的燒瓶中，加入80mlDEPC處理水，微波爐內(nèi)低火加熱熔化均勻。待膠涼至60-7(TC時(shí)，依次向其中加入10ml甲醛和10ml10xMOPS緩沖液，混句后立即倒入制膠槽內(nèi)(注意避免產(chǎn)生氣泡)，蓋上保鮮膜，室溫放置至少lh。C.將RNA樣品冰上溶解，用DEPC處理水稀釋至2jag/jal。取10jil稀釋好的RNA樣品于DEPC處理過(guò)的500jul小離心管中，加入30inlRNA樣品緩沖液和1julEB，混勻，將離心管置于65。C水浴中保溫10min,再置于冰上2min;每管中加入4jal甲醛凝膠加樣緩沖液，混勻。D.上樣將制備好的凝膠放入電泳槽中，加入電泳緩沖液(lxMOPS緩沖液)，液面高出膠面l-2mm，小心拔出梳子使樣品孔保持完好。用微量移液器將制備好的樣品加入加樣孔。E.電泳蓋上電泳槽，接通電源，樣品端接負(fù)極，于7.5V/ml的電壓下電泳lh左右，顛倒正負(fù)極與凝膠方向，以保證緩沖液的pH值穩(wěn)定，繼續(xù)電泳lh左右，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)膠長(zhǎng)的3/4時(shí)停止電泳。電泳結(jié)東后，即可在紫外燈下檢測(cè)結(jié)果。G.觀察完畢，將膠切除一角，DEPC處理水淋洗3次，每次至少5min,以徹底去除甲醛，再用10V的20xSSC浸泡20min，以備轉(zhuǎn)膜。(3)轉(zhuǎn)膜、雜交、洗膜、檢測(cè)等步驟同Southern雜交。4.A"C^7特異性探針序列及特異性檢測(cè)結(jié)果擴(kuò)增得到的AdC57特異性探針序列橫跨編碼區(qū)的3'末端和部分3'非翻譯區(qū)，長(zhǎng)為399bp，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示。Southern雜交。將'洛陽(yáng)紅，幼嫩葉片中提取的30|ugDNA,以五coRI(a)、EcoRV(b)、歷"^in(c)進(jìn)行酶切，0.8%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，分別以地高辛標(biāo)記的中間片段探針A和特異性探針B進(jìn)行雜交，其中，探針A在全長(zhǎng)中的起始位點(diǎn)為410-986bp,探針B在全長(zhǎng)中的起始位點(diǎn)為123l-1630bp。通過(guò)Southern雜交，以A"C57中間序列合成的探針作為對(duì)照，檢測(cè)該探針的特異性(圖2)。結(jié)果表明利用中間片段為探針進(jìn)行雜交后，EcoRI酶切的泳道出現(xiàn)4條帶、EcoRV酶切的泳道出現(xiàn)兩條帶、i^w/in酶切后出現(xiàn)1條主帶和3-4條弱帶，說(shuō)明基因組中存在^CS基因家族的不同成員，該探針可以和不同的成員進(jìn)行雜交，在基因表達(dá)分析研究中會(huì)造成不同成員之間的表達(dá)干擾。而釆用A"CW特異性探針進(jìn)行雜交發(fā)現(xiàn)在各泳道上均只出現(xiàn)l個(gè)條帶(圖2,B)，從而排除了該基因在基因組中為多拷貝的可能，并證明該探針可作為A4CS7的特異性探針用于Northern雜交。Northern雜交。將開花指數(shù)為l級(jí)的牡丹花技瓶插于盛有200mL蒸餾水的容器中，分成三組，每組50枝，分別放置在100L的玻璃箱內(nèi)。用注射器向其中一個(gè)已密封好的玻璃箱內(nèi)注入乙烯，使箱內(nèi)乙烯終濃度達(dá)到10nL.L-1;另一個(gè)箱內(nèi)放置適量l-MCP粉末，使加水溶解后釋放的l-MCP氣體濃度達(dá)到l.OiaLU1，迅速密封；密封對(duì)照花材的玻璃箱內(nèi)不注入任何氣體，2(TC放置6h。處理期間為防止C02積累，箱內(nèi)放置100mL1N濃度的NaOH溶液。處理結(jié)東后將花枝取出，每天定時(shí)按開放級(jí)別各取4支(每支作為一個(gè)重復(fù))，分別測(cè)定切花的內(nèi)源乙烯生成量，然后按照每3g花瓣為一包進(jìn)行取樣，錫箔紙包好，液氮速凍后保存于-80'C超低溫冰箱中，用于取樣提取總RNA。每個(gè)泳道為20/ag總RNA，以rRNA為內(nèi)參來(lái)衡量總RNA上樣量。數(shù)字代表牡丹切花的開花指數(shù)。每次雜交均重復(fù)至少兩次。利用該特異性探針進(jìn)行Northern雜交。結(jié)果如圖4所示，AJGS7在對(duì)照切花開放前期(1-3級(jí))一直沒有檢測(cè)到，當(dāng)切花達(dá)到4級(jí)時(shí)才開始表達(dá)，并在開放后期強(qiáng)烈增強(qiáng)。乙烯顯著促進(jìn)了iV^CS7的表達(dá)，處理結(jié)東后，切花仍處于1級(jí)時(shí)便可以檢測(cè)到其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的積累，隨著花朵的開放，尸^4C57的表達(dá)量在2、3級(jí)逐漸下降，然后在開放至4級(jí)時(shí)又恢復(fù)到1級(jí)的水平。與對(duì)照相似的是，乙烯處理的切花A"GS7在5級(jí)時(shí)也強(qiáng)烈增強(qiáng)，且其表達(dá)量明顯受到外源乙烯的誘導(dǎo)。在切花整個(gè)開放進(jìn)程中，/VJGS7受到l-MCP處理的顯著抑制，只在花朵盛開至5級(jí)時(shí)才檢測(cè)到少量表達(dá)。說(shuō)明該探針可以被用來(lái)進(jìn)行基因表達(dá)分析研究。5.釆用SEQIDNO.l上的第40位至260位的片段作為探針，按照上述方法分別進(jìn)行Sorthern和Northern雜交并檢測(cè)。結(jié)果表明，在Southern雜交中，不同酶切處理的各泳道上均出現(xiàn)單一條帶，且Northern雜交能夠檢測(cè)出不同處理后牡丹花瓣中AJCS7的表達(dá)，說(shuō)明該探針能夠特異性地檢測(cè)基因。6.釆用SEQIDNO.l上的第IOO位至320位的片段作為探針，按照Southern雜交中，不同酶切處理的各泳道上均出現(xiàn)單一條帶，且Northem雜交能夠檢測(cè)出不同處理后牡丹花瓣中/V^GW的表達(dá)，說(shuō)明該探針能夠特異性地檢測(cè)基因。參考文獻(xiàn)薩姆布魯克J，弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T,著.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.第3版.北京:科學(xué)出版社，2002.史國(guó)安，郭香鳳，韓建國(guó)，等.牡丹開花和衰老期間乙烯及脂質(zhì)過(guò)氧化的硏究[J].西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)1999,27(5):50-53.史國(guó)安，楊正申，王長(zhǎng)忠，等.溫度和化學(xué)藥劑對(duì)牡丹切花乙烯釋放及貯藏品質(zhì)影響[J].北方園藝，1997，6:62—63.BleeckerAB,KendeH.Ethylene:agaseoussignalmoleculeinplants[J],AnnuRevCellDevBiol2000，16:1-18.BuiAQ.,O'NeillSD.Three1-aminocyclopropane-l-carboxylatesynthasegenesregulatedbyprimaryandsecondlypollinationsignalsinorchidflowers[J].PlantPhysiol,1998,116:419-429.GeL，LiuJZ，^^ongWSetal.Identificationofanovelmultipleenvironmentalfactorresponsive1-aminocyclopropane-l-carboxylatesynthasegene，NT-ACS2,fromtobacco[J].PlantCellEnviron.2000,23，1169-1182.JiaPY，ZhouL，GuoWW，etal.Postharvestbehaviorandendogenousethylenepatternoftree-peonycutflowers[C].InternationalSocietyforHorticulturalScience.27thInternationalHorticulturalCongress&ExhibitionAbstracts.SeoulKorea,2006:267.JohnsonPR,EckerJR,Theethylenegassignaltransductionpathway:amolecularperspective[J].AnnuRevGenet，1998,32:227-254.MurrayMG，ThompsonWF，，RapidisolationofhighmolecularweightplantDNA[J].NucleicAcidRes，1980，8:4321-4325.ParkKY，DroryA,WoodsonWR.Molecularcloningofan1-aminocyclopropane-l-carboxylatesynthasefromsenescencecarnationflowerpetals[J].PlantMolBiol，1992，18:377-386.VanAltvorstAC，BovyAG.Theroleofethyleneinthesenescenceofcarnationflowers[J].PlantGrowthRegul，1995，16:43-53.WangY，KumarPP.HeterologousexpressionofArabidopsisERSlcausesdelayedsenescenceincoriander[J].PlantCellRep，2004，22:678-684.YangSF，HoffmanNE.Ethylenebiosynthesisanditsregulationinhigherplants[J].Annu.Rev.PlantPhysiol，1984，35:155-189.YipWK，DongJG，KennyJW，ThompsonGA，YangSF.Characterizationandsequencingoftheactivesiteof1-aminocyclopropane-l-carboxylatesynthase[J].ProcNatlAcadSciUSA，1990，87:7930-7934.ZarembinskiTI，TheologisA.ExpressioncharacteristicsofOS-ACS1andOS-ACS2,twomembersofthe1-aminocyclopropane-l-carboxylatefamilyinrice(OryzasativaL.cv.HabiganjAmanII)duringpartialsubmergence[J].PlantMolecularBiology,1997，33:71-77.ZhouL，JiaPY，GuoWW，etal.Influenceofethyleneonpostharvestbehaviorof'LuoYangHong'treepeonycutflower[C].InternationalSocietyforHorticulturalScience.27thInternationalHorticulturalCongress&ExhibitionAbstracts.SeoulKorea,2006:289.序列表<110>北京林業(yè)大學(xué)〈120〉牡丹ACC合成酶基因Ps-ACS1特異性探針〈130〉<160>5<170>Patentlnversion3.3<210〉1<211〉399<212〉DNA<213>牡丹〈400>1caggtctcttcttatggatggatttaagctcgctgctcaaggaga卿cg60agataacactttggcgagtgataatcaMgaagtt肌actcaatgtttcacctggttcat120cttttcattgctcggagcctggatggtttcgggtttgctttgctaacatagatgatgcca180ccatggacattgctcttcgaaggattctaacatttgcactcaaggccaaggaagc卿tg240tgccaaggaatggc犯犯caacaaccttagactcagcttca犯tctggga300aatatgatgatgtcaagttgtctcctcgtatgatgtccccttgcatgaggtcccctcact360cccctatacccttgttcgagcttaattac399<210>2<211>1766<212>DNA<213>牡丹<220〉<221>5'UTR<222>(1)..(146)<220><221>CDS<222>(147).,(1625)<220〉<221〉3'體<222〉(1426),.(1766)〈400〉2acgcggggacaaaaacataacagcatacgcaatcaagcaagaccaeiacttcctataaatt60ctgcttctgctattcgatcatcattattacattcttctctacaaacctcccctgtttttt120tcttcaaatttctctagtcacataaaatgggattcatgtecacagatcaacaaMetGlyPheMetSerThrAspGinGinLys10tctSerC3a_GincctProcttaatLeuAsnctgcttLeuLeugccAlaa_ttlie90aaaLystecSer75tttPhetttPhecgcattArgliettctgcPheCystatTyrcttLeu170gccAlacca_Pro155cccProetaLeuttgLeutacTyr肌cAsntecSer60attlieC3gGinatgMetgtcValttgLeu140ggeiGlyctgLeutttPheaatAsn45tnPhetgcCysAspgg3GlyatgMet125getAlata_tTyrteaSergatAsp30cctPro卿Lys15ggtGlyaatAsngatgtgAspValThrProtatTyraaaLys110agtSercatHis95gtgValggtGlygaccccAspProgatcgcAspArggttc犯ValGing犯ttgGluLeutgcCysgcgAla190gacAsp175tacTyr3tgMettggTrpgggGlya_ttliegaaGlu80gggGlyggaGlygggGlyggtGlygatAsp160sgcSerg￡igGlu1Ala肌gLysgttValc肌Gin65ggaGlytttPhegg3GlygcaAlagatAsp145ttgLeutctSer卿Lys3CCThrgcaAlaatelie50g肌Glua_ttlieccaProggaGlyactThr130gcaAla聊ArgAsngetAlaggcGlytatTyr35caaGintggTrpaatAsngagGlu卿115ggaGly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àn)橥葱暂^高而帶來(lái)的其它基因家族成員的表達(dá)干擾，有利于在此基礎(chǔ)上研究ACS不同成員在牡丹乙烯反應(yīng)中的調(diào)控機(jī)理及作用模式。為全面了解乙烯與牡丹切花開花衰老的關(guān)系、揭示乙烯在其采后開花和衰老進(jìn)程中的作用模式和調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)。文檔編號(hào)C12N15/11GK101603079SQ200810114829公開日2009年12月16日申請(qǐng)日期2008年6月12日優(yōu)先權(quán)日2008年6月12日發(fā)明者琳周,王瑋然,麗董,賈培義申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)