專利名稱：從牛胎盤中分離提取腺苷脫氨酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提取腺苷脫氨酶的方法，更具體地，本發(fā)明涉及利用牛胎盤為 原料提取腺苷脫氨酶的方法。本發(fā)明提取的腺苷脫氨酶能應(yīng)用在同型半胱氨酸 診斷檢測試劑盒中，以及能夠作為腺苷脫氨酶檢測試劑盒中的標準品和其它化 工合成應(yīng)用等。
背景技術(shù)：
腺苷脫氨酶(EC: 3.5.4.4 adenosine deaminase ADA)是嘌呤代謝中重要 的酶類，屬于巰基酶，每分子至少含有2個活性巰基。腺苷脫氨酶能使S腺苷 同型半胱氨酸脫去腺苷生成同型半胱氨酸，此作用在酶法檢測同型半胱氨酸中 是不可缺的部分。而同型半胱氨酸的檢測對于心腦血管疾病、Alzheimer老年癡 呆病以及葉酸缺陷等疾病的診斷具有十分重要的作用。但是現(xiàn)目前，腺苷脫氨 酶的提取是阻礙同型半胱氨酸酶法檢測的最大阻礙，由于幾乎沒有國內(nèi)的廠家 能夠生產(chǎn)出純度高、穩(wěn)定性好的腺苷脫氨酶，大大限制了同型半胱氨酸檢測試 劑盒的研發(fā)和生產(chǎn)。
此外，腺苷脫氨酶能催化腺嘌呤核苷轉(zhuǎn)變?yōu)榇吸S嘌呤核苷，在經(jīng)核苷磷酸化 酶作用生成次黃嘌呤，其代謝最終產(chǎn)物為尿酸。醫(yī)學(xué)研究表明，測定血液或體 液中的腺苷脫氨酶對某些疾病的診斷、鑒別、治療及免疫功能的研究非常重要。 首先，腺苷脫氨酶活性是反映肝損傷的敏感指標，可作為肝功能常規(guī)檢査項目 之一。另外，腺苷脫氨酶檢測有助于重癥聯(lián)合免疫缺陷病、血液病、腫瘤、腦 膜炎、漿膜腔積液等的診斷。臨床診斷檢測腺苷脫氨酶，必須有準確的標準品 作為參照物，才能提供可靠的測值以供臨床判斷。腺苷脫氨酶的標準品主要是 用組織中提取純的腺苷脫氨酶制備。
臨床診斷檢測腺苷脫氨酶，必須有準確的標準品作為參照物，才能提供可靠 的測值以供臨床判斷。腺苷脫氨酶的標準品主要是用組織中提取純的腺苷脫氨 酶制備。據(jù)申請人了解，用于提取制備腺苷脫氨酶的生物組織來源有人精子、 人肝臟、人胃、人腎、人胸腺，作為工業(yè)生產(chǎn)大規(guī)模提取原料，這些生物組織 的獲得均有很大困難而且成本昂貴。同時由于腺苷脫氨酶的提取工藝不夠成熟，腺苷脫氨酶的提取受到限制，幾乎沒有生產(chǎn)廠商能夠提供純度較高、穩(wěn)定性良 好的腺苷脫氨酶，限制腺苷脫氨酶在工業(yè)上的應(yīng)用。
檢索發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)提取腺苷脫氨酶使用硫酸氨分級沉淀，但是由于物料粘度大， 硫酸氨沉淀過程中腺苷脫氨酶聚合至少需要2小時，且沉淀和溶液密度差異小，
還需要10000 rpm冷凍高速離心1小時沉淀才能完全分離，此法耗時耗力耗能， 且不宜放大生產(chǎn)。
使用免疫親禾口層析(rabbit IgG anti — calf ADA — sepharose chromatograohy)首先要制備高特異性兔抗ADA血清，免疫新西蘭家兔就需要 7周，對抗血清分離純化得IgG，再將純化的IgG與CNBr—Sepharose 4B交
聯(lián)，結(jié)合率大約85%，制得的免疫親和層析柱層析重復(fù)性差，這種方法不適合 工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)腺苷脫氨酶。
實驗室內(nèi)從牛胎盤中提取腺苷脫氨酶的方法已有報道，Sim MK，Maguire MH,Eur J Biochem,23(1):17-21,1971，Purification and some properties of bovine placental ademosine deaminase。然而，這禾中方 去由于條件的限審ij只能 小規(guī)模的提取腺苷脫氨酶，無法按比例增加至商業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要是從肉牛加工廢棄物一牛胎盤組織中天然分離提取腺苷脫氨酶。
本發(fā)明要解決的關(guān)鍵技術(shù)問題是開發(fā)出一整套工藝，從牛胎盤組織中提取腺 苷脫氨酶，采用的提取工藝能溫和的分離提取腺苷脫氨酶，使酶保持天然構(gòu)象。 從而獲得較高比活力和更優(yōu)穩(wěn)定性的酶產(chǎn)品，因而制備的腺苷脫氨酶能夠作為 腺苷脫氨酶檢測試劑盒的標準品，得到廣泛的應(yīng)用。
本發(fā)明提取腺苷脫氨酶的方法步驟如下
1) 、將收集到的牛胎盤組織進行破碎將收集到的牛胎盤除盡脂肪及結(jié)締組 織，切成小塊絞碎，然后進行勻漿處理，將勻漿后的組織進行過濾，上清準備 擴張床吸附層析使用。
2) 、用0.01 M—0.1 M， pH 5.0—8.0的緩沖液平衡吸附層析柱后，將過濾
所得上清上擴張床吸附柱。這里的緩沖液是可以使腺苷脫氨酶保持穩(wěn)定的任何
緩沖液試劑，包括N— (2 —乙酰胺)一2—氨基乙磺酸(ACES)， N,N — 二 (2
5一羥乙基)一2—氨基乙磺酸(BES)， N—三(羥甲基)甲基一2—氨基丙磺酸 (TES)， 3 —馬啉代丙磺酸(MOPS)， N-三(羥甲基)甲基_氨基—3—氨基
丙磺酸(TAPSO)，三羥甲基氨基甲垸(Tris)，哌嗪一1， 4_二 (2—乙磺酸) (PIPES),哌嗪—1， 4一二 (2 —羥基—3—丙磺酸)(POPSO)， N-環(huán)乙基一3
一氨基丙磺酸(CAPS)和N —環(huán)乙基一2—氨基乙磺酸(CHES)。最優(yōu)選的緩
沖液有例如，三羥基甲基氨基甲烷(Tris)和N—三(羥甲基)甲基一2—氨基
丙磺酸(TES)。
擴張床吸附后，用一定梯度濃度的緩沖液進行洗脫。其中，低濃度的緩沖液 為0.01 M
PB(磷酸鹽緩沖液)，pH6.0，高濃度液為含1.0MNacl的0.1MPB+， pH6.0，
收集洗脫液以備親和層析使用。
相較于傳統(tǒng)分離純化工藝，本發(fā)明具有以下優(yōu)點和有益效果傳統(tǒng)的硫酸 氨沉淀分級沉淀耗時較長，分離時間較長，回收率低而且操作過程繁瑣復(fù)雜。 而本發(fā)明采用擴張床層析，大大提高了酶的回收率和純度，節(jié)約了時間和人力。
3)、擴張床洗脫液進行親和層析。在溫度為2 — 10r的條件下，用緩沖液平 衡層析柱，再加入樣品液；然后用緩沖液進行沖洗，去除雜質(zhì)；最后用洗脫液 洗脫，收集洗脫液。
本發(fā)明主要采用腺苷層析柱進行親和吸附。為了進一步實現(xiàn)本發(fā)明，首先進 行腺苷交聯(lián)，選用的Sepharose柱為NHS—activated Sepharose(Amershame) 禾口 CNBr—activated Sepharose 4 fast Flow (Amershame)。
其中腺苷交聯(lián)NHS_activated Sepharose的步驟如下
(1) 、溶解腺苷在合適的交聯(lián)緩沖液中。為了獲得較好的交聯(lián)效果需要盡量 避免使用低濃度溶液，通常交聯(lián)液和填料比值為0.5: 1。緩沖液的pH值范圍 為6.0_9.0。緩沖液可以選擇任何滿足條件的緩沖液，推薦含0.5 M NaCI的 0.2MNaHC03溶液，優(yōu)選的pH值為8.3。
(2) 、使用交聯(lián)柱之前，用1 mM 10—15倍填料體積的冷的HCI溶液沖洗 NHS—activated Sepharos。
(3) 、混勻被沖洗后的腺苷和交聯(lián)溶液，然后平衡pH值。為了實現(xiàn)較好的 重復(fù)性，需要在每次實驗過程中，仔細判斷填料使用量。
6(4) 、交聯(lián)過程在室溫下進行時，速度通常是比較快的。因此為了確保交聯(lián)
物腺苷的活性，需要確定交聯(lián)的最佳時間。推薦的交聯(lián)時間為室溫下2—4小時， 而4'C為交聯(lián)過夜。
(5) 交聯(lián)過程完成后，填料上的任何反應(yīng)都應(yīng)該被阻止，為了實現(xiàn)這一目 的，需將填料置于0.5M乙醇胺，0.5MNaCI， pH 8.3或0.1 M Tris—HCI， pH
8.3的緩沖液中一段時間。
(6) 、交聯(lián)后，沖洗填料時，采用兩種不同緩沖液(分別為高低pH值)交 替沖洗。緩沖液優(yōu)選0.1 M Tris-HCI pH 8—9禾B 0.1 M醋酸緩沖液pH 4_5。 推薦的方法為在用3倍填料體積的醋酸鹽緩沖液沖洗后，在用3倍填料體積的 Tris緩沖液進行沖洗，重復(fù)3—6次。
(7) 、成功進行腺苷交聯(lián)后，將交聯(lián)柱置于20%的乙醇溶液中，以避免微 生物污染。
腺苷交聯(lián)CNBr—activated Sepharose 4 fast Flow的步驟如下
(1) 、溶解腺苷在合適的交聯(lián)緩沖液中。為了獲得較好的交聯(lián)效果需要盡量 避免使用低濃度溶液，通常交聯(lián)液和填料比值為0.5: 1。推薦含0.5MNaCI的 0.2 M NaHCO30溶液，緩沖液的pH值范圍為7.0—9.0。緩沖液可以選擇任何 滿足條件的緩沖液，優(yōu)選的pH值為8.3。
(2) 、 CNBr—activated Sepharose 4 fast Flow用10—15倍填料體積的1 mM冷的HCI沖洗。先用一小部分沖洗液進行沖洗，使填料在隨后的沖洗過程 中能平衡一段時間。沖洗后，使用之前確定填料的準確體積。
(3) 、混勻被沖洗后的腺苷和交聯(lián)溶液，然后平衡pH值。為了實現(xiàn)較好的 重復(fù)性，需要調(diào)整反應(yīng)的總體積以滿足定值的交聯(lián)緩沖液。
(4) 、交聯(lián)時間通常是比較快的。室溫下的交聯(lián)時間通常是2—4小時。如 果交聯(lián)在4'C進行，則需要反應(yīng)過夜。也可以通過紫外吸收的測定判斷交聯(lián)時間。
(5) 、用不少于5倍填料體積的緩沖液進行沖洗。
(6) 、交聯(lián)過程完成后，填料上的任何反應(yīng)都應(yīng)該被阻止，為了實現(xiàn)這一目 的，需將填料置于0.1 M Tris—HCI (pH8.0)或1 M乙醇胺(pH 8.0)的緩沖液中 2小時。
(7)、采用兩種不同緩沖液(分別為高低pH值)交替沖洗交聯(lián)填料。緩沖
7液優(yōu)選0.1 M Tris-HCI和Nacl緩沖液，pH 8.0 — 9.0和包含0,5 M NaCI的緩沖
液。推薦的方法為用3倍填料體積的Tris緩沖液沖洗后，在用3倍填料體積的 醋酸鹽緩沖液進行沖洗，重復(fù)3—6次。
(8)、成功進行腺苷交聯(lián)后，將交聯(lián)柱置于20 %的乙醇溶液中，以避免微 生物污染。
在溫度為2—10 'C的條件下，用緩沖液平衡層析柱。這里的緩沖液是可以使 腺苷脫氨酶保持穩(wěn)定的任何緩沖液試劑，包括N— (2 —乙酰胺)一2—氨基乙 磺酸(ACES)， N，N — 二 (2 —羥乙基)—2 —氨基乙磺酸(BES)， N —三(羥 甲基)甲基一2—氨基丙磺酸(TES)， 3 —馬啉代丙磺酸(MOPS)， N-三(羥 甲基)甲基一氨基一3—氨基丙磺酸(TAPSO)，三羥甲基氨基甲烷(Tris)，哌 嗪一1， 4 —二 (2 —乙磺酸)(PIPES),哌嗉一1， 4_二 (2 —羥基一3—丙磺酸)
(P0PS0)， N-環(huán)乙基一3 —氨基丙磺酸(CAPS)禾n N —環(huán)乙基一2—氨基乙 磺酸(CHES)。最優(yōu)選的緩沖液有例如，三羥基甲基氨基甲烷(Tris)和N—三
(羥甲基)甲基一2 —氨基丙磺酸(TES)。
在進行平衡后的層析柱中加入樣品液進行親和吸附。本發(fā)明的原理是腺苷交 聯(lián)的層析柱在加入樣品液后，樣品液中的腺苷脫氨酶和層析柱上的腺苷配體有 一定親和能力。使腺苷脫氨酶特異結(jié)合在腺苷上，形成腺苷一腺苷脫氨酶復(fù)合 物。
緩沖液沖洗親和層析柱，去除雜質(zhì)。最后用洗脫液洗脫，收集洗脫液。這里 的緩沖液可以用任何適合的緩沖液，緩沖液的濃度為10 mM到1 M的量，優(yōu)選 50 mM—500 mM.
4)、親和洗脫液進行分子篩層析。
具有分子篩作用的物質(zhì)很多，如瓊脂、瓊脂糖、聚乙烯醇、葡聚糖凝膠等，
優(yōu)選的分子篩為葡聚糖凝膠。分子篩層析的步驟如下
(1) 上樣
為了獲得較好的分離效果，上樣量要小，最多不能超過床體積的25 %。 40 %。。待樣品完全進入凝膠后，加少量在緩沖液潤洗凝膠表面，待液體完全流進 床內(nèi)后，并閉螺旋夾，開始洗脫收集。
(2) 沖洗
在貯液瓶中加入一定濃度和pH值的緩沖液(pH6.5)，控制滴加速度，保證凝膠上方液面高度為10cm。并收集蛋白峰。
5)、 pEG20， OOO超濾濃縮目的組分，透析去除離子緩沖鹽，同時加保護劑 進行保護后，在用硫酸銨溶液溶解成一定濃度的腺苷脫氨酶硫酸銨懸濁液。保 護劑可以是甘露醇、乙二醇、丙三醇、巰基乙醇、蔗糖、海藻糖、葡聚糖或鹽 中的一種。腺苷脫氨酶的濃度為O. 5KU/L—5KU/mL。


圖1是人胃腺苷脫氨酶的純化工藝對牛胎盤ADA進行分離純化的工藝流程圖。
圖2是擴張床吸附和腺苷交聯(lián)的親和層析吸附后提取腺苷脫氨酶的工藝流程圖。
圖3是硫酸銨沉淀和親和層析分析提取腺苷脫氨酶的結(jié)果圖。
圖4是擴張床吸附和腺苷交聯(lián)的親和層析吸附后提取腺苷脫氨酶的結(jié)果圖。 圖5是各步驟層析收集液的電泳(SDS-PAGE)圖。
具體實例一
傳統(tǒng)方法提取組織中的腺苷脫氨酶。
圖1是人胃腺苷脫氨酶的純化工藝對牛胎盤ADA進行分離純化工藝圖流程
圖，具體的步驟是
1、提取取ikg新鮮或一8(TC冷凍的牛胎盤，將脂肪組織及結(jié)締組織等
雜物剔除，切塊，然后進行勻漿，靜置后，過濾，所得濾液為腺苷脫氨酶的粗
體液，取樣測得腺苷脫氨酶的濃度為0.061 U/mg。
2、 硫酸銨分級沉淀，使用硫酸銨溶液對酶粗提掖進行分級沉淀，沉淀后的 腺苷脫氨酶活力為0.22 U/mg。
3、 層析純化，選用吸附柱(10cmX50cm)，裝S印hadex—DEAE1000ml， 用用0.05MPB， pH6.0平衡液平衡柱子后，將腺苷脫氨酶粗體液上樣吸附。 吸附結(jié)束后，用甘油溶液有效地將未吸附的雜蛋白析出，而且對床層的穩(wěn)定性 無影響。然后照固定床模式進行梯度洗脫，低濃度液為0.01 M PB， pH7.0，高 濃度為0.01 MPB—1.0NaCI， pH7.0，洗脫體積為20L，收集洗脫液4L進行 超濾濃縮，以備親和層析使用；
4、 免疫親和層析
95、超濾濃縮與硫酸銨溶液溶解
采用截留分子量為10 kD的超濾膜濃縮后，用硫酸銨溶液溶解腺苷脫氨酶至 酶濃度為1 KU/mL。
從圖l可以看出，在經(jīng)過硫酸氨分級沉淀、DEAE-Sephadex層析、兔IgG 抗ADA層析、S印hadex G-100層析后，蛋白純化倍數(shù)分別變?yōu)?.61倍、87.87 倍、4197倍和31114倍。經(jīng)過硫酸氨沉淀、DEAE-S印hadex層析、兔IgG抗 ADA層析、S印hadex G-100層析后，腺苷脫氨酶的各步層析收率分別為57.53 %、 43.12%、 25.20%、 19.09%。
具體實例二
圖2是擴張床吸附和腺苷交聯(lián)的親和層析吸附后提取腺苷脫氨酶的工藝流程
圖，具體步驟
1、 提取取新鮮或冷凍的牛胎盤，將脂肪組織及結(jié)締組織等雜物剔除，切塊， 然后進行勻漿，靜置后，過濾，所得濾液為腺苷脫氨酶的粗體液，取樣測得腺
苷脫氨酶的濃度為0.061 U/mg。
2、 擴張床吸附純化選用吸附柱(10 cmx50 cm)，裝Streamline Pheyl 1000 ml，用0.05MPB， pH6.0平衡液平衡柱子后，將腺苷脫氨酶粗體液上樣吸附。 吸附結(jié)束后，用甘油溶液有效地將未吸附的雜蛋白析出，而且對床層的穩(wěn)定性 無影響。然后照固定床模式進行梯度洗脫，低濃度液為0.01MPB， pH7.0，高 濃度為0.01 MPB—1.0MNaCI， pH7.0，洗脫體積為20 L，收集洗脫液4L進 行超濾濃縮，以備親和層析使用；
3、 親和層析純化將腺苷偶聯(lián)到固相化載體S印harose、纖維素等，本發(fā) 明采用的是NHS—activated S印harose，用0.1 M， pH6.8的緩沖液平衡層析 柱，將超濾濃縮的擴張床洗脫液洗脫上樣。吸附后，用0.1MPB， pH6.8，高 濃度0.1 MPB—1.0MNaCI， pH6.8進行梯度洗脫，洗脫總體積為2.5 L，收 集洗脫液。
4、 超濾濃縮與硫酸銨溶液溶解
采用截留分子量為10 kD的超濾膜濃縮后，用硫酸銨溶液溶解腺苷脫氨酶 至酶濃度為1 KU/mL。
從圖4擴張床吸附和腺苷親和層析吸附提取腺苷脫氨酶的結(jié)果可以看出，經(jīng) 過STREAMlilNETM Phenyl擴張床吸附、腺苷親和層析、S印hacryl S-20,層析后，蛋白純化倍數(shù)分別變?yōu)?.43倍、5410倍、38032倍。經(jīng)過 TREAMLINE Phenyl擴張床吸附、腺苷親和層析、S印hacryl S-200HR層析
后，腺苷脫氨酶的各步層析收率分別為68.72%、 41.96%、 36.83%。相比于傳 統(tǒng)的腺苷脫氨酶的提取方法，新工藝腺苷脫氨酶的蛋白純化倍數(shù)高出6918，腺 苷脫氨酶的曾吸收率高出17.74%。
SDS-PAGE電泳圖譜5表明，經(jīng)硫酸氨分級沉淀收集組分(泳道1)相比， STREAMLINE Phenyl層析收集組分(泳道8)相對粗提掖腺苷脫氨酶的純化 倍數(shù)有明顯提高；與rabbit IgG anti-calf ADA-Sepharose層析收集組分(泳道4) 相比，Adenosine-Sepharose收集組分(泳道9)腺苷脫氨酶的相對純化倍數(shù)提高 最明顯；與Sephadex G-100層析收集組份(泳道5)相比，Sepharose S-200HR 層析收集組份(泳道10)腺苷脫氨酶的相對純化倍數(shù)也有增加。通過 Adenosine-S鄰harose層析收集組份的電泳圖譜(泳道9)和STREAMLINE Phenyl層析收集組份的電泳圖譜(泳道8)對比發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明腺苷親和層析特異 性吸附腺苷脫氨酶的效果顯著。
權(quán)利要求
1、一種利用腺苷親和層析技術(shù)從牛胎盤組織中提取腺苷脫氨酶的方法，其特征在于首先利用擴張床吸附技術(shù)直接純化腺苷脫氨酶提取液，再用腺苷親和層析柱，進一步純化制得高純度的腺苷脫氨酶。
2、 如權(quán)利要求1所述的方法，腺苷交聯(lián)的親和層析柱制備高純度腺苷脫氨酶的方法包括腺苷交聯(lián)親和層析柱，包括腺苷交聯(lián)NHS—activatedSepharose (Amershame)、 CNBr—activated Sepharose 4 fast Flow(Amershame)、 epoxy-activated Sepharose 6B (Pharmacia)。
3、 如權(quán)利要求1所述的方法，腺苷脫氨酶的提取液首先利用擴張床吸附技術(shù)進行純化。
4、 如權(quán)利要求1所述的方法，腺苷交聯(lián)的親和層析洗脫液經(jīng)過進一步純化處理制備高純度的腺苷脫氨酶溶液。
5、 如權(quán)利要求1所述的方法，制備的腺苷脫氨酶經(jīng)過超濾濃縮除去鹽離子等雜質(zhì)后，加保護劑。用硫酸氨溶液制成一定濃度的腺苷脫氨酶硫酸氨懸濁液。
6、 如權(quán)利要求2所述的方法，是利用腺苷作為配體腺苷交聯(lián)親和層析柱，使提取液中的腺苷脫氨酶特異結(jié)合在腺苷交聯(lián)的親和層析柱上。
7、 如權(quán)利要求4所述的方法，腺苷脫氨酶在腺苷親和層析柱進行親和吸附的溫度為2—1(KC。
8、 如權(quán)利要求4所述的方法，腺苷交聯(lián)親和層析柱在使用之前，需用緩沖液進行平衡。
9、 如權(quán)利要求4所述的方法，親和層析完成后，用緩沖液進行沖洗，收集腺苷脫氨酶溶液。
10、 如權(quán)利要求3所述的方法，進行擴張床吸附的擴張床在使用之前，需用緩沖液進行平衡。如權(quán)利要求3所述，在溫度為2 — 1(TC的條件下，用緩沖液平衡層析柱，在加入樣品液；然后用緩沖液進行沖洗，去除雜質(zhì)；最后用洗脫液洗脫，收集洗脫液。
11、 如權(quán)利要求8所述的方法，緩沖液是N— (2—乙酰胺)一2 —氨基乙磺酸(ACES)， N，N —二 (2—羥乙基)—2—氨基乙磺酸(BES)， N—三(羥甲基)甲基一2—氨基丙磺酸(TES)， 3—馬啉代丙磺酸(MOPS)， N-三(羥甲基)甲基一氨基一3 —氨基丙磺酸(TAPSO)，三羥甲基氨基甲烷(Tris)， 哌嗪一1， 4一二 (2—乙磺酸)(PIPES),哌嗪_1， 4一二 (2 —羥基一3_ 丙磺酸)(POPSO)， N-環(huán)乙基一3 —氨基丙磺酸(CAPS)和N —環(huán)乙基一2 一氨基乙磺酸(CHES)中的一種緩沖液。
12、 如權(quán)利要求9所述的方法，緩沖液是三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖 液、磷酸鹽緩沖液、三乙醇胺緩沖液、2—氨基一2—甲級一1一丙醇緩沖液、 咪唑緩沖液中的一種。
13、 如權(quán)利要求5所述的方法，保護劑是甘露醇、乙二醇、丙三醇、巰基乙 醇、蔗糖、海藻糖、葡聚糖或鹽中的一種。
14、 如權(quán)利要求5所述的方法， 一定濃度的腺苷脫氨酶硫酸氨懸濁液的濃度 是從0.05 KU/L_2 KU/L中的任何一個濃度。
15、 如權(quán)利要求8所述的方法，緩沖液的濃度為1 mM — 100 mM。
全文摘要
一種利用腺苷親和層析技術(shù)提取牛胎盤組織中腺苷脫氨酶的方法，其特征在于首先利用擴張床吸附技術(shù)直接純化腺苷脫氨酶提取液，再用腺苷交聯(lián)的親和層析柱，進一步純化制得高純度的腺苷脫氨酶。本發(fā)明使用的Streamline Phenyl擴張床分離技術(shù)應(yīng)用于腺苷脫氨酶的粗分離，不需對提取液進行澄清化，省時省力。而且用腺苷層析柱分離提取腺苷脫氨酶，使酶保持天然構(gòu)象，說明書附圖可以看出，本發(fā)明的方法提取的腺苷脫氨酶有較高比活力和較高純度的酶產(chǎn)品，因而制備的腺苷脫氨酶能應(yīng)用在同型半胱氨酸診斷檢測試劑盒中，以及能夠作為腺苷脫氨酶檢測試劑盒的標準品和其它化工合成應(yīng)用等。
文檔編號C12N9/78GK101514337SQ20081011505
公開日2009年8月26日 申請日期2008年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月17日
發(fā)明者勇 彭 申請人:北京世紀山水科技有限公司