專利名稱：一種基因重組技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是生物技術(shù)領(lǐng)域的一種新型定向基因重組方法。目的基因首先以非定向方式與相 應(yīng)重組載體連接，之后對錯(cuò)誤連接形成的特定選擇位點(diǎn)進(jìn)行連接后處理，使錯(cuò)誤連接的目的 基因難以進(jìn)入宿主細(xì)胞或者進(jìn)入宿主細(xì)胞后難以復(fù)制。本方法可用于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模的普通科 學(xué)研究，更適合于批量蛋白質(zhì)的生產(chǎn)或篩選，尤其在生物信息學(xué)研究中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
背景技術(shù)：
自上世紀(jì)70年代PCR技術(shù)和限制性內(nèi)切酶發(fā)現(xiàn)以來，基因重組技術(shù)已經(jīng)形成了一套完善 的體系，其中主要包括目的基因的分離，目的基因和重組載體的限制性切割，目的基因與重 組載體的定向連接，宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，陽性克隆的篩選等。目的基因和載體的連接有正向和 反向兩種方式，只有正向連接的基因才能夠得到正確的表達(dá)，因此建立在雙酶切基礎(chǔ)上的定 向連接是傳統(tǒng)重組技術(shù)的核心。目的基因和載體的切割和連接是基因重組過程中操作最為繁瑣，工作周期最長，并且失 敗幾率最高的步驟。目前國內(nèi)外很多生物技術(shù)公司陸續(xù)都開發(fā)出了用于簡化操作的試劑盒產(chǎn) 品，比如凝膠回收試劑盒，PCR片段回收試劑盒，酶切片段回收試劑盒，快速連接試劑盒等， 但仍然難以避免操作過程中基因片段的丟失。因此尋找更為簡單的方法是必然的選擇。目前人們對定向重組技術(shù)的改造主要是通過以下兩種方式實(shí)現(xiàn)的1、 模擬自然條件下生物基因重組的原理。比如Clontech公司以同源重組為基礎(chǔ)的 In-fusion系統(tǒng)，Invitrogen公司以位點(diǎn)特異性重組為基礎(chǔ)的Gateway系統(tǒng)，F(xiàn). A.斯圖爾特等 的專利技術(shù)一一應(yīng)用同源重組克隆和亞克隆的方法和組合物(專利申請?zhí)?0812739. 5)等。 自然重組技術(shù)不需要用戶對目的基因進(jìn)行切割和連接，只要將載體、目的基因和重組體系混 合在一起處理適當(dāng)?shù)臅r(shí)間即可轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。但是，自然重組技術(shù)需要載體末端和目的基因 末端之間存在20 40bp同源序列，需要特殊的重組酶系，極大的提高了基因重組的操作成本。 而且同源重組是一個(gè)動(dòng)態(tài)的雙向過程，重組成功率一般不會太高，并不適合在普通實(shí)驗(yàn)室常 規(guī)使用。2、 以體內(nèi)連接方式實(shí)現(xiàn)定向重組。比如NEB公司在尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)基礎(chǔ)上建立的的USER Friendly系統(tǒng)等，以及馬立新等申請的兩項(xiàng)專利技術(shù)---種零背景高通量定向表達(dá)克隆的方法(專利申請?zhí)?1133158. 1)和一種高通量直接定向克隆構(gòu)建重組腺病毒的方法(專利申請?zhí)?00410060972.6)等。體內(nèi)連接一般需要目的基因和載體之間具有4 12bp的互補(bǔ)序列，上述方法就是通過不同的方式在載體和目的基因之間建立這樣一個(gè)互補(bǔ)序 列。前者需要合成特殊的引物，而且需要特定的工具酶，工作成本較高；后者利用了一種常 規(guī)的工具酶，對引物序列的要求相對較低，是一種值得推廣的方法。但是上述體內(nèi)重組技術(shù) 要求載體必須具備一段游離單鏈序列，在反復(fù)凍溶過程中這些游離序列很容易出現(xiàn)堿基脫落， 影響連接效率，不適合長期應(yīng)用，難以商品化生產(chǎn)。上述技術(shù)分別從不同的角度發(fā)展了重組技術(shù)，但是受到技術(shù)本身的缺陷所導(dǎo)致的成本過 高或者連接效率過低等因素的影響，并不能替代既往傳統(tǒng)的重組技術(shù)進(jìn)行常規(guī)應(yīng)用。以往在 常規(guī)基因重組過程中，人們曾經(jīng)嘗試在兩個(gè)基因片段之間通過基因擴(kuò)增過程，實(shí)現(xiàn)基因片段 之間的連接，即所謂的重組PCR技術(shù)。但是到目前為止，我們尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)通過該基因擴(kuò)增 過程完成兩個(gè)基因片段之間環(huán)化連接，以及載體和目的基因之間通過基因擴(kuò)增進(jìn)行直接重組 的報(bào)道，因此我們在這方面進(jìn)行了研究。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所涉及的基因重組技術(shù)，重組體系由重組載體，目的基因，重組引物和基因擴(kuò)增 體系構(gòu)成，其實(shí)施方法是線性化重組載體的兩個(gè)末端和目的基因的兩個(gè)末端之間存在同源 序列，通過基因擴(kuò)增過程在重組載體末端引入目的基因，并在基因修復(fù)后完成重組過程。本發(fā)明所涉及的基因重組技術(shù)本發(fā)明涉及生物體系領(lǐng)域一種基因重組技術(shù)重組過程包括 目的基因擴(kuò)增、基因引入、和基因修復(fù)三個(gè)過程；其中基因擴(kuò)增、基因引入兩個(gè)過程可以在 同一個(gè)體系內(nèi)同時(shí)完成，也可以在兩個(gè)體系內(nèi)先后完成；其中基因修復(fù)過程包括殘余堿基清 除和基因連接兩個(gè)過程，修復(fù)過程可以在細(xì)胞外通過工具酶完成，也可以借助細(xì)胞內(nèi)修復(fù)體 系自動(dòng)完成，或者通過工具酶和細(xì)胞內(nèi)修復(fù)體系聯(lián)合完成，優(yōu)選但不限于借助細(xì)胞內(nèi)修復(fù)體 系自動(dòng)完成。發(fā)明所涉及的基因重組技術(shù)重組載體可來源于質(zhì)粒、粘粒、人工染色體、噬菌體或者病 毒；在重組過程進(jìn)行前，引入基因的位點(diǎn)需要切開形成兩個(gè)引入位點(diǎn)，即權(quán)力要求1中所描 述的所謂的線性化，新形成的兩個(gè)位點(diǎn)附近的序列分別稱之為載體重組序列。本發(fā)明所涉及的基因重組技術(shù)H的基因可以是基因擴(kuò)增產(chǎn)物或者是原始基因；目的基因 兩端的序列成為目的基閑重組序列。本發(fā)明所涉及的基因重組技術(shù)重組引物序列分為兩部分，其中上游和重組載體中相應(yīng)重 組位點(diǎn)的載體基因序列同源，下游和待引入目的基因相應(yīng)的重組序列同源。本發(fā)明所涉及的基因重組技術(shù)基因擴(kuò)增體系由DNA聚合酶、三磷酸核苷、反應(yīng)緩沖液構(gòu) 成；其中DNA聚合酶優(yōu)選但不限于耐熱DNA聚合酶，其中再次優(yōu)選高保真耐熱DNA聚合酶。實(shí)施方案1、 制備線性重組載體1) 提取質(zhì)粒、粘粒、人工染色體、噬菌體或者病毒載體。2) 通過限制性內(nèi)切酶載體中切開需要引入目的基因的位點(diǎn)(重組位點(diǎn))，該過程稱之為載 體線性化。其中重組位點(diǎn)上游附近序列稱為上游重組序列，下游附近序列稱之為下游重組序 列。2、 制備目的基因1) 合成重組引物其中上游引物的上游部分和載體上游重組序列同源，下游部分和目的 基因上游末端序列同源；下游引物的上游部分和載體下游重組序列同源，下游部分和目的基 因下游末端序列同源。2) 目的基因的擴(kuò)增按照常規(guī)方法擴(kuò)增目的基因，回收備用。3、 基因重組1) 異步重組將目的基因和重組載體按照適當(dāng)?shù)臄?shù)量比混合，數(shù)量比為1: 10到10: 1，優(yōu)選但不限 于l: l到3: 1的比例混合；混合物加入到基因擴(kuò)增體系中，常規(guī)方法擴(kuò)增，其中擴(kuò)增循環(huán) 數(shù)量為3到30次；擴(kuò)增產(chǎn)物熱變性后復(fù)性，回收備用。2) 同步重組在目的基因擴(kuò)增體系中適量載體，常規(guī)方法完成基因擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物熱變性后復(fù)性，回收備用。3、基因修復(fù)1) 自動(dòng)修復(fù)重組產(chǎn)物常規(guī)轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞內(nèi)，常規(guī)方法復(fù)蘇和篩選，基因在細(xì)胞內(nèi)自動(dòng)完成修復(fù)。2) 人工修復(fù)擴(kuò)增產(chǎn)物中加入單鏈特異性核酸酶，常規(guī)方法處理完成后，加入DNA連接酶對目的基因和載體進(jìn)行鏈連接。核酸酶處理過程和連接過程可在同一個(gè)體系內(nèi)進(jìn)行。
具體實(shí)施方式
下面以某種原始基因作為目的基因，利用定向克隆進(jìn)入某種載體為例對技術(shù)進(jìn)行具體說 明,采用的方法為同步重組自動(dòng)修復(fù)。說明內(nèi)容為本專利某種特定的操作方法，其內(nèi)容并不構(gòu) 成對本專利所要求權(quán)利的限制。1、 某種載體的多克隆位點(diǎn)如下5' — CTCTAGAGTCGACGATATCCTGCAGGCATGC — 3,其中加粗劃線部.分—EcoR V 某種原始基因的末端序列如下5' —ATGCGCAAATTTGGCG......CGCCGGCGTTCAATAA — 3'2、 引物設(shè)計(jì)方案上游弓I物CTCTAGAGTCGACGATATGCGCAAATTTGGCG 下游引物GCATGCCTGCAGGAT TTATTGAACGCCGGCG3、 操作方法在50微升反應(yīng)體系中按照常規(guī)操作方法加入Pfu DNA聚合酶，dNTP，引物，模板和反 應(yīng)緩沖液，同時(shí)在反應(yīng)體系中加入載體溶液l微升(l微克/微升)，常規(guī)方式擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)。 94攝氏度變性15分鐘，室溫復(fù)性10分鐘，常規(guī)方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，復(fù)蘇后篩選。
權(quán)利要求
1本發(fā)明涉及生物體系領(lǐng)域一種基因重組技術(shù)，重組體系由重組載體，目的基因，重組引物和基因擴(kuò)增體系構(gòu)成，其實(shí)施方法是線性化重組載體的兩個(gè)末端和目的基因的兩個(gè)末端之間存在同源序列，通過基因擴(kuò)增過程在重組載體末端引入目的基因，并在基因修復(fù)后完成重組過程。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因重組技術(shù)，其特征是重組過程包括目的基因擴(kuò)增、基因引入、 和基因修復(fù)三個(gè)過程；其中基因擴(kuò)增、基因引入兩個(gè)過程可以在同一個(gè)體系內(nèi)同時(shí)完成，也 可以在兩個(gè)體系內(nèi)先后完成；其中基因修復(fù)過程包括殘余堿基清除和基因連接兩個(gè)過程，修 復(fù)過程可以在細(xì)胞外通過工具酶完成，也可以借助細(xì)胞內(nèi)修復(fù)體系自動(dòng)完成，或者通過工具 酶和細(xì)胞內(nèi)修復(fù)體系聯(lián)合完成，優(yōu)選但不限于借助細(xì)胞內(nèi)修復(fù)體系自動(dòng)完成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因重組技術(shù)，其特征是重組載體可來源于質(zhì)粒、粘粒、人工染 色體、噬菌體或者病毒；在重組過程進(jìn)行前，引入基因的位點(diǎn)需要切開形成兩個(gè)引入位點(diǎn)， 即權(quán)力要求1中所描述的所謂的線性化，新形成的兩個(gè)位點(diǎn)附近的序列分別稱之為載體重組 序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因重組技術(shù)，其特征是目的基因可以是基因擴(kuò)增產(chǎn)物或者是原 始基因；目的基因兩端的序列成為目的基因重組序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因重組技術(shù)，其特征是重組引物序列分為兩部分，其中上游和 重組載體中相應(yīng)重組位點(diǎn)的載體基因序列同源，下游和待引入目的基因相應(yīng)的重組序列同源。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因重組技術(shù)，其特征是基因擴(kuò)增體系由DNA聚合酶、三磷酸核 苷、反應(yīng)緩沖液構(gòu)成；其中DNA聚合酶優(yōu)選但不限于耐熱DNA聚合酶，其中再次優(yōu)選高保真 耐熱DNA聚合酶。
全文摘要
本發(fā)明所涉及的基因重組技術(shù)，重組體系由重組載體，目的基因，重組引物和基因擴(kuò)增體系構(gòu)成，其實(shí)施方法是線性化重組載體的兩個(gè)末端和目的基因的兩個(gè)末端之間存在同源序列，通過基因擴(kuò)增過程在重組載體末端引入目的基因，并在基因修復(fù)后完成重組過程。本發(fā)明技術(shù)操作周期短，無需重組用工具酶，成功率高，適用于常規(guī)試驗(yàn)和工程領(lǐng)域各種可擴(kuò)增目的基因的重組操作。
文檔編號C12N15/09GK101633921SQ20081011702
公開日2010年1月27日 申請日期2008年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月23日
發(fā)明者張永鋼 申請人:張永鋼