專利名稱：：小立碗蘚抗低溫脅迫基因PpDBF2及其蛋白和載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種小立碗蘚抗低溫脅迫基因/^Z^/^及其編碼的蛋白質(zhì)、含有該基因的載體。
背景技術(shù)：
：低溫、干旱、高鹽是限制植物生長(zhǎng)發(fā)育、地理分布、形態(tài)建成等的重要環(huán)境脅迫因素。這些脅迫因素作用的結(jié)果均導(dǎo)致植物細(xì)胞失水，影響植物細(xì)胞的滲透壓，進(jìn)而影響植物正常的生理代謝，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致植物的死亡。通過對(duì)一些模式植物的研究發(fā)現(xiàn)這三種脅迫因素誘導(dǎo)表達(dá)的功能蛋白及轉(zhuǎn)錄因子相互交差，因此，尋求同時(shí)具有忍耐低溫、干旱、高鹽脅迫的綠色植物來(lái)研究植物的非生物脅迫極有必要。對(duì)苔蘚植物的基礎(chǔ)研究標(biāo)明苔蘚植物是極地低溫度環(huán)境的先鋒植物之一，同時(shí)它也分布在極端干旱的沙漠。在漫長(zhǎng)的生物進(jìn)化歷程中，苔蘚植物形成了一套獨(dú)特的適應(yīng)低溫干燥等惡劣環(huán)境的機(jī)制。對(duì)小立碗蘚非生物脅迫研究發(fā)現(xiàn)(Frank等，2005)，與其他高等植物相比，小立碗蘚(州j^coyzitre7^paz^s)可以忍耐極端的生態(tài)環(huán)境。如，擬南芥在100mM的NaCl處理下即受到傷害(Sunkar等，2003)，而小立碗蘚可以忍耐350mM的NaCl溶液，在緩慢的逐漸提高的鹽處理?xiàng)l件下，小立碗蘚可以忍耐600mM的NaCl脅迫。500mM的山梨醇處理三天后，小立碗蘚仍可以幸存。當(dāng)小立碗蘚失水92%時(shí)仍可恢復(fù)正常生長(zhǎng)發(fā)育。在脫水、鹽漬和滲透脅迫條件下，F(xiàn)rank等(2003)分析鑒定了一系列上調(diào)基因，其編碼的蛋白主要有膽堿脫氫酶(cholinedehydrogenase)、甜菜堿(glycinebetaine)、三氫吡咯羧酸鹽(delta11-pyrroline-5-carboxylate)、超氧化物歧化酶(superoxide3disrautase，SOD)、鈣依賴蛋白激酶(calcium-dependentproteinkinase)、促分裂素原活化蛋白激酶(MAPkinase)等。在0。C低溫脅迫七天后小立碗蘚仍可恢復(fù)生長(zhǎng)(Minami等，2005)，且在冷馴化過程中激活了LEA(late-embryogenesis-abundant)蛋白的轉(zhuǎn)錄，提高了其冰凍耐受能力。因此從苔蘚植物中克隆抗逆相關(guān)基因并進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)應(yīng)用于提高農(nóng)作物的抗逆性是目前研究的熱點(diǎn)之一。
發(fā)明內(nèi)容為了解決上述問題提出并完成了本發(fā)明。本發(fā)明的目的是提供高效的抗低溫脅迫相關(guān)基因。本發(fā)明的另一目的是提供上述基因編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的再一目的是提供含有上述基因的載體。具體地，本發(fā)明的發(fā)明人將培養(yǎng)至15葉左右的小立碗蘚莖葉體在O'C下經(jīng)過不同時(shí)間的處理與非處理小立碗蘚莖葉體組成差異材料，通過cDNA-AFLP技術(shù)得到差異表達(dá)的EST，隨后在分子水平進(jìn)行表達(dá)分析或蛋白質(zhì)水平的分析，挑選出了一種具有顯著抗逆特性的基因——小立碗蘚抗逆基因Pp/^尸么基因/^"5/^的堿基序列如SEQIDNo.1所示，其cDNA序列如SEQIDNo.2所示，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示；在本發(fā)明的完成過程中，還提供了包含上述基因的載體、以及表達(dá)該基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。本發(fā)明獲得的基因具有高效的抗逆性。通過常用的基因工程技術(shù)，可以利用該基因培育出優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，從而提高農(nóng)作物的抗逆性。圖1為/^朋/^基因的cDNA-AFLP圖譜，其中，Maker:分子量標(biāo)記；1、未馴化的24小時(shí)的材料；2、未馴化的12小時(shí)的材料；3、冷馴化的24小時(shí)的材料；4、冷馴化的12小時(shí)的材料。圖2為尸pZfiPi"基因的Real-timeRT-PCR相對(duì)表達(dá)量變化圖。具體實(shí)施例方式1、小立碗蘚的培養(yǎng)及冷脅迫處理將小立碗蘚培養(yǎng)至15葉左右，移入0。C處理0、3、6、12、24、48、72小時(shí)，分別取材用于cDNA-AFLP分析。附小立碗蘚培養(yǎng)基配方及制備大量元素Ca(N03)2■FeS047H20MgS047H200.8g/L0.0125g/L0.25g/LCuS045H20ZnS047H20H3B03MnCl24H20CoCl26H20KINa2Mo042H20Glucose酒石酸銨磷酸鹽緩沖液0.055mg/L0.055mg/L0.614mg/L0.389mg/L0.055mg/L0.028mg/L0.025mg/L5g/L0.5g/Llml/L微量元素配制成1000X母液，4'C存放。固體基本培養(yǎng)基，加入濃度為0.8%瓊脂粉。磷酸緩沖液的配制取25gKH2P04溶解于100ml蒸餾水，用4MKOH調(diào)整pH7.0，4'C存放。2、cDNA-AFLP分析cDNA-AFLP方法參照Christian,1998。1)小立碗蘚RNA提取(TE3D法)和DNaseI處理52)mRNA的分離mRNA從總RNA中分離，按照Promega公司試劑盒PolyATractmRNAIsolationsystem介紹的方、法進(jìn)《亍。3)cDNA的合成cDNA按照TaKaRa公司試劑盒cDNASynthesisKit(M-MLVVersion)介紹的方法進(jìn)行。4)雙酶切采用EcoRI和Msel兩種限制性內(nèi)切酶對(duì)cDNA進(jìn)行雙酶切。模板cDNA(200ng/n1)125u1緩沖液(10X)2ulEcoRI5U/u11y1Msel5U/ulltilddH2014.75li1總體積20ul混勻離心，37°C酶切至少3個(gè)小時(shí)，最好過夜直至cDNA被完全酶切；酶切完全后，反應(yīng)混合物置65""C加熱15min,使限制性內(nèi)切酶失火，之后將反應(yīng)管置冰上冷卻；1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果,呈現(xiàn)均勻彌散為較好酶切效果。5)接頭連接采用EcoRIadaptor和Mseladaptor兩種接頭連接，所用接頭見表2.1。酶切反應(yīng)液20ul緩沖液(10X)2HiT4-連接酶(10U/u1)0.lulATP(lOmM)0.2til6EcoRI接頭50pmol/ulMsel接頭50pmol/iUddH20總體積-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>混合離心，37。C至少連接3小時(shí)，-20。C可長(zhǎng)期保存。6)預(yù)擴(kuò)增以EO和MO為引物做預(yù)擴(kuò)增，所用引物見表2.1。加入以下試劑于反應(yīng)管中:模板DNA(連接反應(yīng)液)緩沖液(10X)MgCl2(25mM)EcoRI引物(E0，50ng/ix1)Msel引物(MO，50ng/u1)Taq酶(5U/u1)dNTP(10mM)H20總體積PCR反應(yīng)程序94°C、3min;94°C環(huán)；68°C、10min;4'C保存。取5ul預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物加入95ulTE稀釋，其余擴(kuò)增產(chǎn)物-2(TC保存。表2.1:cDNA-AFLP實(shí)驗(yàn)的接頭序列和預(yù)擴(kuò)增、選擇性擴(kuò)增引物序列2.0u12.On11.2u10.6u10.6u10.2u10.2u113.2u120u130s，56°C、30s，72°C、lrain，15個(gè)循<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>7)選擇性擴(kuò)增以El、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8和Ml、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8為引物做選擇性擴(kuò)增，所用引物見表2.1。加入以下試劑于反應(yīng)管中模板DNA(預(yù)擴(kuò)稀釋物)5.0ul緩沖液(10X)2.0"1MgCl2(25mM)L2uld證(10mM)0.2iilEcoRI引物(Ex，50pmol/ul)0,6ulMsel引物(Mx，50pmol/p1)0.6ulTaq酶(5U/ul)0.2u1H2010.2u1總體積20ulPCR反應(yīng)采用"touchdown"策略。程序如下94°Clmin94°C30s65°C30s7個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán)降低0.7'C)72°Clmin94°C30s20個(gè)循環(huán)56°C30s72°Clmin68°ClOmin4°C保存8)電泳檢測(cè)——銀染技術(shù)記錄試驗(yàn)結(jié)果拍照或掃描，統(tǒng)計(jì)檢測(cè)位點(diǎn)數(shù)及其多態(tài)性位點(diǎn)。以冷馴化3h，6h，12h，24h，48h，72h和未馴化Oh的小立碗蘚為材料，進(jìn)行cDNA-AFLP分析。統(tǒng)計(jì)200bp-1000bp之間的可讀帶，結(jié)果表明小立碗蘚冷馴化和未冷馴化的基因表達(dá)存在著明顯差異。有些cDNA片段在冷馴化后表達(dá)量逐漸增加，有些cDNA片段表現(xiàn)出先增加后降低，有些cDNA片段表達(dá)量先降低后增加，還有少數(shù)表達(dá)量明顯降低。3、尸p"5/^全長(zhǎng)基因的獲得1)RT-PCR分析將由cDNA-AFLP分析得到的差異片段與P.patensEST數(shù)據(jù)庫(kù)(http:〃moss.nibb.ac.jp/blast/blast.html)進(jìn)行BLAST比對(duì)后，進(jìn)行聚類分析和功能分類，顯示小立碗蘚在冷馴化過程中細(xì)胞內(nèi)的代謝活性和生長(zhǎng)狀態(tài)發(fā)生了極大的變化?；虻谋磉_(dá)分析顯示尸/^9/^在冷馴化中上調(diào)表達(dá)，且該基因的表達(dá)受ABA的誘導(dǎo)，表明該基因參與了植物的抵抗非生物脅迫途徑。通過同源序列設(shè)計(jì)引物，通過RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到尸p傲尸么尸p尸pZ^/^基因的上游引物序列為AGGAATCTGGTGGAGAACAGATTGCAATGGTGAATTCACCGATTAAACCTTGAATACGTTGTAAA。PCR反應(yīng)體系如下cDNA10XLAPCR緩沖液d酵(2.5mM)primerF(50pmol/ul)primerF(50pmo1/u1)U\PolymeraseddH20總體積PCR反應(yīng)程序下游物序列為95°C95°C65°C68。C72。C4°Clmin45s45s2minlOmin保存32個(gè)循環(huán)3u12u11.6u10.15u10.15u10.In113u120u12)純化后的差異片段與pGEM-Teasy(Promega)載體連接3)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化5)陽(yáng)性克隆的測(cè)序以載體兩端的T7或SP6引物進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序儀為ABI3100(AppliedBiosystems)。/57"5/^基因組序列如下，SEQIDNo.1:tcaacccatggaatatatgtttatatccatctctataggtaacgccagctgctacatcat60tcaaactacaaagctcgaacccccacccgaggcagcctcttcccgtgctgccagtgtgaa120cacggaacgcccccctgcttgcttccccccagctcacatagccgccactggaccacgacc180ggccgacgtggcagctacgtgccgatttttcgtaggaccaagtgtgagagctcgcaagat240gatgtcgatgtggcacgtctatccgtcgccgctattttcctacgtggcggacacgctggc300aatttcatagcagacgtccggcagttccaccgggtctgtccgtcacgtccggtaatatcg360gtttccgtcttcgttgccctgggggttctcaaggtggaattgaagcgctagattttgtg已420gttggtggatcagataatttctgaaaggcgctgatctggaggcttttgacgcgctcccat480gaacggtcgccgtccccaaacgatcgtgatctcgaagaaaacagcacaaaaagggggcaa540gtgtgatgagatttaactgaggcaggactttttattatatatattccgtaaagtagacgc600gattctgcagttctagatattaagttggcacaacgtgtcgacatattatgggcactagca660cacttgcagttggcctgggcccattggagcactcgcataatatatttgttggccctcttc720ctggcctcattcactttgtgtcatctttcgtaccgtttctgttttttaacttctagactt780cacgggaaccgtccagcgctttgtaaatagcctgagagccatcatccttgttgaacgaat840tcacaactcatcacacccaccacctgctgggcatgattgttgcagttgtatcaaaaatat900agttgttgtagtggtagaagtagtaactgaactgcggccgctccgtttctctgagatcgt兆Octttcttgtggcattcactactgtcaggtagagtagggttccagttgacgcttgaacttg1020gatacgaaagaggctttgtggaattgagaatttgtagtgtaggtgttgcgaaggattttg1080gtcccggttctgtgaagggcaggaggaatctggtggagaacagattgcaatggtggataa1140gaacagaacccagagagctgcgatggaggttagggcaggggcacggcattgcctagctcc1200agtgaaggaggaggagactccttctgcaagccccaagtatagaggagttcgcatgcggca1260atgggggaaatgggtttcgg卿ttcgggaaccgaacaagaggtcgaggatttggttggg1320atccttccctacggcggaaatggcagctagagcgtatgatgctgctgtggtatgcttgag1380aggtcctcatgctgctttaaatttccctgactcacctccccaatcacttcctgaatgcca1440ctcgccgaaggatatccaagtggccgctgctgcggctgccgcagtcgctgagccttgtac1500tcctgtgacgctccccttcaatggggaagcgcaatcacttgatgcgcaacttaggagcat1560taagaatgagacgaatttgacgcctagatcgcaccaaaggcctgcggaatcggaaaactc1620tggtacttcggcggagcgatcttggaaaagcgcttcgaaatctgaggttgtcgtggatga1680ggagcttgattgcacaggggagtcgacaccccacgccggagtggagtttgttagcttgga1740agatgtgggattggcctgggacggaatgaagtctgatgacatcaaattcttggaaggctt腦Oggaggacattg犯tttcctggttctaacctctacggccacgctgatgatgcgccaagaaa1860acttatgaaatcattctctggacgtcgcgttgtgccacaatactgtcgtcaattttcggg1920caggtttgagcccttaggcaacgtgccggacgtttacaacgtattcaaggtttaatcggt1980gaattcatcgtgcccacgttcaacattagaatctgaattagaggcgatattgtggcgttg2040gtcttcgacagaaaccatttcttcagaggtgcagcctgcggcggcaatcacacaagataa2100cctctcatttgagtgtagcatagacaggagcttctgctagaaagctcggccatctttctt2160cagtattgtgcagaaatcgatggatctctacaaacaaacgtaaaattctttggatggtaa2220cttctagctgatttttgacagatcatagcgccatgatatgttcggagtgctcttcgttcc2280gatagtaatatacaacactgcactgaaagaaaaagaaaagcacattgcgaatcgaa^cct2340gtaaataaatctcggatagcatcctatgggtgctgcagttcccatccacttttttgtgca2400tgtttgtcaccccagcctacacctgaatacgaccatgtattaatcttcattttactagcg2460atgaaagttatcctgattgtgcttaatgcttctatgaactgcaaggcctttgcatcaaaa2520aaatctatctttcttcttgtgaagtatcattgtttctttatgacgatcacaggtgtttta2580ttcgtcaacaatcaaaaaaacagatttgatgtgtggaatgctctacttgcaacca犯tga264012tggacgatggtgctgcactgtcaatcatgtcagacagacgtcagccgtatatcaagcttc2700tgcatcaggtcctcttcccgcttcgtttttcggggctgacgattact2747尸/7/^/^基因的cDNA序列如下，SEQIDNo.2:ATGGTGGATAAGAACAGAACCCAGAGAGCTGCGATGGAGGTTAGGGCAGGGGCACGGCATTGCCTAGCTCCAGTGAAGGAGGAGGAGACTCCTTCTGCAAGCCCCAAGTATAGAGGAGTTCGCATGCGGCAATGGGGGAAATGGGTTTCGGAGATTCGGGAACCGAACAAGAGGTCGAGGATTTGGTTGGGATCCTTCCCTACGGCGGAAATGGCAGCTAGAGCGTATGATGCTGCTGTGGTATGCTTGAGAGGTCCTCATGCTGCTTTAAATTTCCCTGACTCACCTCCCCAATCACTTCCTGAATGCCACTCGCCGAAGGATATCCAAGTGGCCGCTGCTGCGGCTGCCGCAGTCGCTGAGCCTTGTACTCCTGTGACGCTCCCCTTCAATGGGGAAGCGCAATCACTTGATGCGCAACTTAGGAGCATTAAGAATGAGACGAATTTGACGCCTAGATCGCACCAAAGGCCTGCGGAATCGGAAAACTCTGGTACTTCGGCGGAGCGATCTTGGAAAAGCGCTTCGAAATCTGAGGTTGTCGTGGATGAGGAGCTTGATTGCACAGGGGAGTCGACACCCCACGCCGGAGTGGAGTTTGTTAGCTTGGAAGATGTGGGATTGGCCTGGGACGGAATGAAGTCTGATGACATCAAATTCTTGGAAGGCTTGGAGGACATTGAATTTCCTGGTTCTAACCTCTACGGCCACGCTGATGATGCGCCAAGAAAACTTATGAAATCATTCTCTGGACGTCGCGTTGTGCCACAATACTGTCGTCAATTTTCGGGCAGGTTTGAGCCCTTAGGCAACGTGCCGGACGTTTACAACGTATTCAAGGTTTAA其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列為SEQIDNo.3:MVDKNRTQRAAMEVRAGARHCLAPVKEEETPSASPKYRGVRMRQWGKWVSEIREPNKRSR60IWLGSFPTAEMAARAYDAAVVCLRGPHAALNFPDSPPQSLPECHSPKDIQVAAAAAAAVA120EPCTPVTLPFNGEAQSLDAQLRSIKNETNLTPRSHQRPAESENSGTSAERSWKSASKSEV80VVDEELDCTGESTPHAGVEFVSLEDVGLAWDGMKSDDIKFLEGLEDIEFPGSNLYGHADD240APRKLMKSFSGRRVVPQYCRQFSGRFEPLGNVPDVYNVFKV28113尸pZ^/^基因的Real-timeRT-PCR分析利用real-timeRT-PCR方法研究了尸pZ^/^基因在冷馴化過程中的表達(dá)變化。1)RNA提取和反轉(zhuǎn)錄利用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄。試劑盒使用TaKaRa公司的RNAPCRkit，參照試劑盒的說明書，以試劑盒提供的反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。2)預(yù)實(shí)驗(yàn)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍用以做模板，用目的基因的引物，使用HSExTaqDNApolymerase,進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件如下94°C2min94°C30s61°C30s72°C20s30個(gè)循環(huán)20°C5minPCR反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。選擇反應(yīng)產(chǎn)物專一，沒有二聚體等雜帶的樣品進(jìn)行下一步定量PCR反應(yīng)。3)定量PCR反應(yīng)利用TaKaRa公司的SYBRPremixExTaq(PerfectRealTime)kit進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，引物序列見表2.2。PCR儀使用CorbetResearch公司的RotorGene3000Real-TimeThermalCycler。實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用軟件Rotor-Gene6.0(Donaldetal.，2005)以及Excel7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。采用Pp-actin3基因作對(duì)照，尸p/^/^基因的上游引物序列為GAGAGCTGCGATGGAGGTTAGGGCA;下游引物序列為ATTGCCGCATGCGAACTCCTCTATACTT4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的生成將預(yù)試驗(yàn)的PCR產(chǎn)物按照10倍濃度梯度進(jìn)行稀釋，選擇1/1,000，1/10，000，1/100，000，1/1,000,000濃度的稀釋產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品模版，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。通過這四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品生成的反應(yīng)數(shù)據(jù)，軟件Rotor-Gene5.0根據(jù)反應(yīng)的熒光實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)?shù)據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)品的濃度關(guān)系，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(尸p"^^參見圖2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明尸p/^Z^在冷脅迫誘導(dǎo)下基因表達(dá)量明顯上調(diào)，序列分析該基因與擬南芥的DBF轉(zhuǎn)錄因子具有高度同源性，且該基因的表達(dá)受ABA的誘導(dǎo)，因此該基因是參與小立碗蘚低溫脅迫應(yīng)答的一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，與其低溫抗性密切相關(guān)。〈110〉首都師范大學(xué)〈120>小立碗蘚抗低溫脅迫基因PpDBF2及其蛋白和載體〈160〉3<210〉1<211>2747<212>DNA〈213〉小立碗蘚(PhyscomytrellaPateuts)〈400〉1tcaacccatggaatatatgtttatatccatctctataggtaacgccagctgctacatcat60tcaaactacaaagctcgaacccccacccgaggcagcctcttcccgtgctgccagtgtgaa120cacggaacgcccccctgcttgcttccccccagctcacatagccgccactggaccacgacc180ggccgacgtggcagctacgtgccgatttttcgtaggaccaagtgtgagagctcgcaagat240gatgtcgatgtggcacgtctatccgtcgccgctattttcctacgtggcggacacgctggc300aatttcatagcagacgtccggcagttccaccgggtctgtccgtcacgtccggtaatatcg360gtttccgtcttcgttgccctgggggttctcaaggtggaattgaagcgctagattttgtga420gttggtggatcagataatttctgaaaggcgctgatctggaggcttttgacgcgctcccat480gaacggtcgccgtccccaaacgatcgtgatctcgaagaaaacagcacaaaaagggggcaa540gtgtgatgagatttaactgaggcaggactttttattatatatattccgtaaagtagacgc600gattctgcagttctagatattaagttggcacaacgtgtcgacatattatgggcactagca660cacttgcagttggcctgggcccattggagcactcgcataatatatttgttggccctcttc720ctggcctcattcactttgtgtcatctttcgtaccgtttctgttttttaacttctagactt780cacgggaaccgtccagcgctttgtaaatagcctgagagccatcatccttgttgaacgaat840tcacaactcatcacacccaccacctgctgggcatgattgttgcagttgtatcaaaaatat900agttgttgtagtggtagaagtagtaactgaactgcggccgctccgtttctctgagatcgt960ctttcttgtggcattcactactgtcaggtagagtagggttccagttgacgcttgaacttg1020gatacgaaagaggctttgtggaattgagaatttgtagtgtaggtgttgcgaaggattttg1080gtcccggttctgtgaagggcaggaggaatctggtggagaacagattgcaatggtggataa1140gaacagaacccagagagctgcgatggaggttagggcaggggcacggcattgcctagctcc1200agtgaaggaggaggagactccttctgcaagccccaagtatagaggagttcgcatgcggca1260atgggggaaatgggtttcgg卿ttcgggaaccgaacaagaggtcgaggatttggttggg1320atccttccctacggcggaaatggcagctagagcgtatgatgctgctgtggtatgcttgag1380aggtcctcatgctgctttaaatttccctgactcacctccccaatcacttcctgaatgcca1440ctcgccgaaggatatccaagtggccgctgctgcggctgccgcagtcgctgagccttgtac1500tcctgtgacgctccccttcaatggggaagcgcaatcacttgatgcgcaacttaggagcat1560taagaatgagacgaatttgacgcctagatcgcaccaaaggcctgcggaatcggaaaactc1620tggtacttcggcggagcgatcttggaaaagcgcttcgaaatctgaggttgtcgtggatga1680ggagcttgattgcacaggggagtcgacaccccacgccggagtggagtttgttagcttgga1740agatgtgggattggcctgggacggaatgaagtctgatgacatcaaattcttggaaggctt1800ggaggacattgaatttcctggttctaacctctacggccacgctgatgatgcgccaagaaa1860acttatgaaatcattctctggacgtcgcgttgtgccacaatactgtcgtcaattttcggg1920caggtttgagcccttaggcaacgtgccggacgtttacaacgtattcaaggtttaatcggt1980gaattcatcgtgcccacgttcaacattagaatctgaattagaggcgatattgtggcgttg2040gtcttcgacagaaaccatttcttcagaggtgcagcctgcggcggcaatcacacaagataa2100cctctcatttgagtgtagcatagacaggagcttctgctagaaagctcggccatctttctt2160cagtattgtgcagaaatcgatggatctctacaaacaaacgtaaaattctttggatggtaa2220cttctagctgatttttgacagatcatagcgccatgatatgttcggagtgctcttcgttcc2280gatagtaatatacaacactgcactgaaaga犯aagaaaagcacattgcgaatcgaaacct2340gtaaataaatctcggatagcatcctatgggtgctgcagttcccatccacttttttgtgca2400tgtttgtcaccccagcctacacctgaatacgaccatgtattaatcttcattttactagcg2躬0atgaaagttatcctgattgtgcttaatgcttctatgaactgcaaggcctttgcatcaaaa2520aaatctatctttcttcttgtgaagtatcattgtttctttatgacgatcacaggtgtttta2580ttcgtcaacaatcaaaaaaacagatttgatgtgtggaatgctctacttgcaaccaaatga2640tggacgatggtgctgcactgtcaatcatgtcagacagacgtcagccgtatatcaagcttc2了00tgcatcaggtcctcttcccgcttcgtttttcggggctgacgattact2747<210>1<211〉846<212〉DNA〈213〉小立碗蘚(PhyscomytrellaPateuts)〈400〉2atggtggataagaacagaacccagagagctgcgatggaggttagggcaggggcacggcat60tgcctagctccagtgaaggaggaggagactccttctgcaagccccaagtatagaggagtt120cgcatgcggcaatgggggaaatgggtttcgg卿ttcgggaaccgaacaagaggtcgagg180atttggttgggatccttccctacggcggaaatggcagctagagcgtatgatgctgctgtg240gtatgcttgagaggtcctcatgctgctttaaatttccctgactcacctccccaatcactt300cctgaatgccactcgccgaaggatatccaagtggccgctgctgcggctgccgcagtcgct360gagccttgtactcctgtgacgctccccttcaatggggaagcgcaatcacttgatgcgcaa420cttaggagcattaagaatgagacgaatttgacgcctagatcgcaccaaaggcctgcggaa480tcggaaaactctggtacttcggcggagcgatcttggaaaagcgcttcgaaatctgaggtt540gtcgtggatgaggagcttgattgcacaggggagtcgacaccccacgccggagtggagttt600gttagcttggaagatgtgggattggcctgggacggaatgaagtctgatgacatcaaattc660ttggaaggcttggaggacattgaatttcctggttctaacctctacggccacgctgatgat720gcgccaagaaaacttatgaaatcattctctggacgtcgcgttgtgccacaatactgtcgt780caattttcgggcaggtttgagcccttaggcaacgtgccggacgtttacaacgtattcaag840gtttaa846<210>1<211〉281<212〉PRT<213>小立碗蘚(PhyscomytrellaPateuts)<400〉3MVDK服TQRAAMEVRAGARHCLAPVKEEETPSASPKYRGVRMRQWGKWVSEIREPNKRSR60IWLGSFPTAEMAARAYDAAVVCLRGPHAALNFPDSPPQSLPECHSPKDIQVAAAAAAAVA120EPCTPVTLPFNGEAQSLDAQLRSIKNETNLTPRSHQRPAESENSGTSAERSWKSASKSEV180VVDEELDCTGESTPHAGVEFVSLEDVGLAWDGMKSDDIKFLEGLEDIEFPGSNLYGHADD240APRK服SFSGRRVVPQYCRQFSGRFEPLG,DVY鮮KV28權(quán)利要求1、一種小立碗蘚抗低溫脅迫基因PpDBF2，其特征在于，其堿基序列如SEQIDNo.1所示。2、一種小立碗蘚抗低溫脅迫基因尸/^份。，其特征在于，其堿基序列如SEQIDNo.2所示。3、權(quán)利要求1或2所述基因編碼的蛋白質(zhì)。4、如權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。5、含有權(quán)利要求1或2所述基因的載體。全文摘要本發(fā)明涉及生物基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種小立碗蘚抗低溫脅迫基因PpDBF2及其蛋白和載體。所述基因的核苷酸序列分別如SEQIDNo.1所示，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。本發(fā)明獲得的基因具有高效的抗逆性。通過常用的基因工程技術(shù)，可以利用該基因培育出優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，從而提高農(nóng)作物的抗逆性。文檔編號(hào)C12N15/29GK101633927SQ20081011719公開日2010年1月27日申請(qǐng)日期2008年7月25日優(yōu)先權(quán)日2008年7月25日發(fā)明者何奕昆,孫銘明,崔素霞,慧王,勇胡申請(qǐng)人:首都師范大學(xué)