專利名稱：提高了熱穩(wěn)定性及蛋白酶抗性的環(huán)化植酸酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高了熱穩(wěn)定性及蛋白酶抗性的環(huán)化酶，本發(fā)明還涉及對蛋白酶進 行環(huán)化以提高其性能的方法。
背景技術(shù)：
天然蛋白質(zhì)，尤其是酶蛋白在穩(wěn)定性方面的存在許多不足，比如耐熱性差，易被蛋 白酶水解等，限制了它們在醫(yī)藥和工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。
例如，植酸酶(E.C.3. 1.3.8)是一種可以將植酸水解為肌醇和磷酸的酶類。飼料中 添加植酸酶后可將植酸和植酸鹽水解成肌醇和磷酸鹽，供動物吸收利用，從而提高磷的 利用率和骨骼礦化程度，可節(jié)約磷資源、降低飼料成本。但植酸酶對熱不穩(wěn)定，而植酸 酶生產(chǎn)過程的制粒環(huán)節(jié)，溫度為75-9(TC，并要持續(xù)數(shù)分鐘，在此過程中酶的活性會大幅 度的喪失，影響其在生產(chǎn)中的應(yīng)用。因此提高植酸酶的穩(wěn)定性成為急需解決的問題。
蛋白環(huán)化是一種新技術(shù)，環(huán)化的蛋白較之線型的蛋白有很多的好處，例如可增加蛋 白的穩(wěn)定性，減少蛋白對水解酶剪切的抗性，增強蛋白的活性和減少蛋白構(gòu)象的柔性等。
應(yīng)用工程內(nèi)含肽來環(huán)化蛋白質(zhì)，即應(yīng)用細菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)環(huán)化蛋白，這種方法開辟 了改進蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的途徑。這種環(huán)化方法通過蛋白剪接反應(yīng)實現(xiàn)的，從蛋白前體上釋 放一個內(nèi)部的蛋白序列，稱為內(nèi)含肽。在內(nèi)部蛋白序列的剪接過程中，內(nèi)含肽被包埋蛋 白前體中，催化自身的剪切，進而把兩側(cè)的蛋白序列連接起來。將目的的蛋白融合表達 在內(nèi)含肽的兩部分中，形成一個三明治結(jié)構(gòu)。當內(nèi)含肽被釋放時，目的蛋白的C、 N端處 形成一個肽鍵，使目的蛋白環(huán)化起來，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性將會提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的總的目的是開發(fā)一種新的酶蛋白環(huán)化技術(shù)，提供具有熱穩(wěn)定性及蛋白酶抗性的環(huán)化酶。
本發(fā)明的另一目的是提供在細菌表達系統(tǒng)中高效表達生產(chǎn)環(huán)化酶的方法。 技術(shù)解決方案
本發(fā)明提供了一種環(huán)化的酶，其特征在于，其多肽序列的前5個氨基酸具有SEQID N0:1序列，最后5個氨基酸具有SEQ ID N0:2序列；且酶蛋白的N、 C兩端相鏈接。
所述環(huán)化的酶蛋白的N、 C兩端相鏈接，是通過內(nèi)含肽介導的環(huán)化方法，用天然的 肽鍵將酶蛋白的N、 C兩端鏈接起來。
在本發(fā)明的一個實例中，對枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的中性植酸酶基因 PhyC進行環(huán)化，編碼該環(huán)化植酸酶的基因具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。經(jīng)實 驗證實，環(huán)化后的植酸酶的熱穩(wěn)定性和蛋白酶的抗性均有所提高。
本發(fā)明還提供了一種環(huán)化酶蛋白的方法，包括整套表達載體的構(gòu)建、重組字的篩選 及環(huán)化分子的鑒定方法，將前5個氨基酸具有SEQ ID N0:1序列，最后5個氨基酸具有 SEQ ID N0:2序列的編碼基因在大腸桿菌中的環(huán)化表達。
所述環(huán)化酶蛋白的方法是利用天然集胞藍細菌(Synechocystis species PCC6803) Ssp DnaE內(nèi)含肽的轉(zhuǎn)剪接特性，分別于體內(nèi)體外對蛋白質(zhì)環(huán)化。
在本發(fā)明的一個實例中，所述酶蛋白是植酸酶蛋白，環(huán)化方法是將SEQ IDN0:3所 示核苷酸序列的基因在大腸桿菌中的環(huán)化表達，通過內(nèi)含肽的轉(zhuǎn)剪接作用環(huán)化中性植酸 酶PhyC，所述Ssp DnaE內(nèi)含肽的基因具有如SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列。具體方 法如下
1. 環(huán)化載體構(gòu)建按常規(guī)方法克隆(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。從集胞藍細菌(Synechocystis species PCC6803)的dnaE基因中PCR， 分別得到Ssp DnaE內(nèi)含肽的N端和C端2部分，后連入pMXB10載體，形成表達載體pEBl。
2. 基因克隆 從枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的基因組中PCR得到一個中 性植酸酶基因phyC，克隆到上述表達載體pEBl中。轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，獲得重組子。
3. 蛋白的表達和純化 加入IPTG誘導表達PhyC植酸酶，通過鎳柱親和純化體內(nèi)生成的環(huán)形植酸酶；通過幾丁質(zhì)親和柱得到體外的環(huán)形植酸酶。驗證蛋白的環(huán)化情況。
用本發(fā)明的方法改良的植酸酶具有更好的熱穩(wěn)定性。本方法為體內(nèi)環(huán)型植酸酶的生 產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。


圖l為大腸桿菌重組載體pPEB的物理圖譜；
圖2為大腸桿菌重組載體pEBl的物理圖譜;
圖3表示40 75。C下，環(huán)化植酸酶cPhyC和野生植酸酶PhyC在各溫度保溫1小 時后，得出的環(huán)化植酸酶與野生植酸酶的熱穩(wěn)定性；
圖4環(huán)化植酸酶的最適反應(yīng)溫度；
圖5環(huán)化植酸酶對外肽酶的抗性。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例進一歩闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，該實施例僅用于舉例說明本發(fā)明 的方法，而不限制所用酶蛋白的范圍。
實驗條件
菌株與載體 大腸桿菌菌株E. coli BL21 (DE3)購自Novagen公司，載體由本研究 構(gòu)建并保存。
酶與試劑盒限制性內(nèi)切酶，連接酶，T叫酶為NEB公司產(chǎn)品?；蚪M提取試劑盒 為天根生化公司產(chǎn)品。凝血酶為Merk公司產(chǎn)品。
生化試劑DNA合成試劑為Milipore公司產(chǎn)品。引物合成為ABI公司Cyclone DNA 合成儀。 IPTG、 X-Gal、 SDS及植酸酶鈉為Sigma公司產(chǎn)品。TEMED、過硫酸銨、丙烯 酰胺及甲叉雙丙烯酰胺為Promega公司產(chǎn)品。NTA樹脂為Qiagen公司產(chǎn)品。幾丁質(zhì)樹脂 為NEB公司產(chǎn)品。
培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)基為LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、l%NaCl， pH7.0)。實施例中其它未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法進行，如Sambrook等人 的方法，分子克隆按(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)實驗室 手冊中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1環(huán)化植酸酶
1) 環(huán)化表達載體的構(gòu)建
用于環(huán)化的大腸桿菌表達載體pEBl。首先提取集胞藍細菌(Synechocystis species) 的基因組。以所提取的基因組為模板，PCR擴增dnaE的C端序列。所使用的引物根據(jù) dnaE的C段基因的5，和3，端序列合成，2個引物序列分別為5， ATGGTTAAAGTTATCGGTC 3， 和5' GTTAGCTGCGATAGCGCC 3'，擴增后進行凝膠電泳，回收大小108bp的片段。另外， 以所提取的基因組為模板，PCR擴增dnaE的N端序列。所使用的引物根據(jù)dnaE的N段 基因的5'和3'端序列合成，2個引物序列分別為5， TGCCTGTCTTTTGGTACC 3'和5' TTTAATTGTC CCAGCGTC 3'，擴增后進行凝膠電泳，回收大小369bp的片段。之后將dnaE 的C段基因經(jīng)HindIII和AflII酶酶切，dnaE的N段基因經(jīng)AflII和EcoRI酶切后連入 pMXB10載體，形成pEBl載體(見圖2) ， dnaE的C段基因前為T7啟動子。
2) 植酸酶基因分子的克隆
提取枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)基因組。以所提取的基因組為模板，進 行PCR擴增，電泳回收植酸酶phyc基因約1124bp片段。所使用的引物根據(jù)phyc基因的 5'和3'端序列合成，2個引物序列分別為
5' CTTAAGCACCATCATCATCATCATAAGCATAAGCTGTCCGATC 3，和
5， ATCGATGCTACCACGCGGAACCAGTTTTCC GCTTCTGTC 3，，
擴增后進行凝膠電泳，回收大小H24bp的片段，SEQ ID N0:3為植酸酶phyC的堿 基序列，SEQIDN0:5為其氨基酸序列。獲得的DNA分子經(jīng)AfIII酶切，與經(jīng)酶切的實驗 一中得到的pEBl載體于4。C連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)， LB培養(yǎng)基涂板后篩選 陽性重組子，提取質(zhì)粒進行鑒定，得到重組子。重組質(zhì)粒pPEB圖譜見圖1。
3) 環(huán)化植酸酶表達純化的程序
將實驗二得到的重組子接種到20mL的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)過夜，按10%接種
6量接種于1LB培養(yǎng)基中，與37。C培養(yǎng)至OD為0.6，加入IPTG至終濃度0. 5mM,繼續(xù)培養(yǎng) 3小時，誘導表達植酸酶。離心收集菌體，菌體重懸于100mL含500mM NaCl的 Tris-HC1 (pH7. 0)緩沖液中，超聲波破碎菌體，15000rpm離心30分鐘去除細胞碎片。上 清液通過NTA鎳株進行純化。將NTA樹脂裝入合適的層析柱，層析用10倍NTA體積的NTA-O Buffer (20mM Tris-HCl pH7. 9, 0. 5M NaCl, 10%甘油)洗。將樣品離心后上清加到NTA 層析柱中，流速控制在15ml/小時左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的結(jié) 合情況。層析用5倍NTA體積的NTA-0 Buffer洗，流速控制在30ml/小時左右。分別用 5倍NTA體積的NTA-20(20mMTris-HClpH7. 9， 0. 5MNaCl， 10%甘油，20mM咪唑)，NTA-40 (20mMTris-HC1 pH7. 9, 0. 5MNaCl， 10%甘油，40mM咪唑)，NTA-60(20mM Tris-HCl pH7. 9, 0. 5MNaCl， 10%甘油，60mM咪啤)，NTA-80 (20mM Tris-HC1 pH7. 9, 0. 5M NaCl, 10%甘 油，80mM咪唑)，NTA-IOO (20mM Tris-HC1 pH7. 9, 0. 5M NaCl， 10%甘油，100mM咪唑) 緩沖液洗脫，流速控制在15ml/小時左右，收集洗脫液，每管收集一個NTA體積。SDS/PAGE 確定目標蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況。
4)植酸酶體外環(huán)化及純化
將實驗二得到的重組子接種到20mL的LB培養(yǎng)基中，37"C振蕩培養(yǎng)過夜，按10%接種 量接種于1LB培養(yǎng)基中，與37'C培養(yǎng)至OD為0. 6，加入IPTG至終濃度0. 5mM，繼續(xù)培養(yǎng) 3小時，誘導表達植酸酶。離心收集菌體，菌體重懸于100mL含500niM NaCl的 Tris-HCl (pH7. 0)緩沖液中，超聲波破碎菌體，15000rpm離心30分鐘去除細胞碎片。將 上清液慢加入幾丁質(zhì)柱，之后用20倍柱床體積的緩沖液1 (20mM Tris-HCl pH7. 9, 0. 5M NaCl )徹底洗柱。停止柱流23。C放置15小時。后用緩沖液1將目的蛋白洗脫收集。大 約收集8-IO管，每管5 ml。通過280 nm UV吸光值或Bradford蛋白檢測法進行檢測。
實施例2環(huán)化植酸酶性質(zhì)測定
1)植酸酶酶學性質(zhì)的測定方法
有目的植酸酶的收集管用與測定植酸酶酶活，酶活測定方法如下:將上清用緩沖液 (50mM Tris - HC1 , 2mM CaC12 ，10 %甘油，pH710)做適當稀釋后，取015ml酶液，加入 2ml 2mM的植酸鈉(100mM Tris — HC1 ，pH710 ， 012慮CaC12 ) ，37 。C保溫30min ，加入 215m] 20 %TCA(w/ v)終止酶活反應(yīng)，5000r/ min離心5min ，然后加入5ml硫酸亞鐵一 鉬酸銨顯色液[(115 %鉬酸銨515 %硫酸)(217 %硫酸亞鐵)二 4 : 1 , v/ v ] , 5000r/min離心5min，700mM測定無機磷酸含量。對照為先在015ml的酶稀釋液中加入215ml 20 %TCA使酶失活，再加入同體積的底物保溫。酶活性單位(U)定義為在一定條件下， 每分鐘釋放Inmol無機磷所需的酶量為一個酶活性單位。
2) 環(huán)化植酸酶和野生型植酸酶的熱穩(wěn)定性測定比較
植酸酶的最適溫度的測定在Tris-HCl (pH 7. 0)緩沖液體系及不同溫度下進行酶促 反應(yīng)。熱穩(wěn)定性測定為植酸酶在不同溫度下處理1小時，在37'C下進行酶活測定。酶反 應(yīng)最適溫度測定結(jié)果(圖4)表明，其最適溫度為58'C。酶的熱穩(wěn)定性實驗表明(圖3)， 60'C處理1小時后，剩余酶活為65%， 70'C處理1小時，酶活基本喪失。而野生型植酸酶， 6(TC處理1小時后，剩余酶活為39%， 65'C處理1小時，剩余酶活為20%， 70。C處理1小 時，酶活基本喪失。
3) 環(huán)化植酸酶和野生型植酸酶的外肽酶抗性測定比較
環(huán)化植酸酶和野生型植酸酶的外肽酶抗性測定在Tris-HC1 (pH 7.0)緩沖液體系， 加入羧肽酶Y， 25'C處理12小時。測定結(jié)果(圖5)表明，25'C處理12小時后，環(huán)化植 酸酶沒有發(fā)生降解，而野生型植酸酶受外肽酶作用，發(fā)生了部分降解。實驗說明環(huán)化的 植酸酶對外肽酶降解有明顯的抗性。
序列表說明
SEQ ID N0:1是環(huán)化酶多肽序列的的前5個氨基酸 SEQ ID N0:2是環(huán)化酶多肽序列的最后5個氨基酸
SEQ ID NO: 3是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的中性植酸酶基因phyc的基因序列。
SEQ ID N0:4是dnaE的基因序列
SEQ ID N0:5是從SEQ ID NO:3推導出的phyc編碼的氨基酸序列。序列表
<110>中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所
〈120〉提高了熱穩(wěn)定性及蛋白酶抗性的環(huán)化植酸酶
〈160〉 5
<170> Patentln version 3. 1
<210> 1
<211〉 5
〈212> PRT
〈213〉人工序列
〈400〉 1
Cys Phe Asn lie Ser 1 5
<210> 2 〈211〉 5 〈212〉 PRT <213〉人工序列<400> 2
Lys Phe Ala Glu Tyr 1 5
<210〉 3
<211> 1194
<212〉 DNA
<213> 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)
〈400〉 3
tgcttt犯catatccaccggtcttaagcttaagcaccatcatcatxatca60
ctgtccgatccttatcattttaccgtgaatgcggcggcggaaacggaaccggttgatacg120
gcaggtgacgcggctgatgatcctgcgatttggctggatcccaagactcctcagaacagc180
cgaccaat犯犯aatcaggtttagtcgtttacagccttgatggta卿tg240
cttcattcct￡LtMt3CCgggaagctgaactccgttatgsttttccgttg300
cgcggcagca,tccaatcgctctgsagga^■ataccatt360
gatal:tt:acgccattgacggga犯aacggcgcattacagatccagaccat420
ccgattgcatcggc朋t.t犯tgaggteitacggttttaccttataccacag480
acgcgatggtgacaggg犯ag郷gtgaatcgaattaaag540
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已cggaagggatggcagc聊cgatgaatacggcaggctttatatcgcaga卿卿tgag660
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gccgacggcaggcatttaactcctgatattcg已tttactacgctgctgac780
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acaaatatgttgcggattttcgcat犯c3gatggtcctgaaacagacggc900
10cagacggaattgacgttctgggtttcggacttgggcctgaatatccgttc960
ggtatttttgtcgcacaggaatagatcacggcca^aaggccaatcaaaat1020
cttaaaatcgtgccgtgggagatc3犯tcggcttccgcccgctggcaaat1080
a皿caggttgacccgagaaaactgaccgacaactggttcggcgtggtagc1140
3tCg8t肌CCtcgggatcgaacgctcgagaaatttgctga1194
〈210〉 4
〈211〉 477
<212〉 DNA
〈213〉集胞藍細菌(Syriechocystisspecies PCC6803)
<400〉 4
atggtta^gttatcggtcgtagatctctgggcgtgcagcgcatctttgatstcggtctg60
ccgcaggaccataactttctgcteigcc38Cggcgctatcgcagctaactgcctgtctttt120
ttttaaccgttgagtacggcccattgcccattggc犯皿ttgtgagtgaa180
gttctgtgtacagtgttgatgagtttacacccaggcgatc240
gcccaatggc;atg獄gggg卿gcagg犯gtattgg^tatgaattgga300
gtaatccgagctacctctgaccaccgctttttaaccaccgattatcaactgttggcgatc360
ttgctaggca已C"tgg3Cttggcaaactgaa420
g肌gctcttgtcttccctttccattacttgaCgCtggg￡lC477
<210〉 5<211> 398<212> PRT
<213〉 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)
<400> 5
Cys Phe 1
His Lys
Ala Glu
Ala lie
50 Thr Asn 65
Leu His
Asp Phe
Arg Ser
Asn Gly 130 Ala lie 145
Gly Lys
Asn lie Ser Thr Gly Leu Lys Leu Lys His His His
His
Thr 35 Trp
Ser
Pro
Glu 115 Thr
Tyr Glu Leu
Arg Ala
Phe 195
Lys
20
Glu
5
Leu
Pro Val
Ser Asp Pro Asp
Leu Asp Pro Lys Lys Ser
Tyr
Leu 100 Gly
Asn
85
Asn
Gly 70 Thr
Gly
Lys
55
Leu
Gly
Lys
Thr 40 Thr
Tyr
25
Ala
10 His
Phe Thr Val
Gly Asp Ala
Pro Gin Asn
Val Val Tyr Lys
Lys Asn Thr
Leu Gin Ser
Asn Glu Val
Tyr Tyr
Lys 180 L'ys
Ala 165 Ala
Tyr 150 MET
lie 135
Gly
Lys
lie 120 Thr
Leu
Val 105 Asp
Asn 90 Asp
Ser
75
Asn
Phe Thr Leu
Val Thr Gly Asp Lys Asn
MET Asn Ser
Gin 200
Gly 185 Thr
Lys 170 Tyr
Ser
60
Leu
Ala
45
Lys
Asp
Asn
30
Asp
His
15
Ala
His
Ala
Asp Pro
Leu lie Thr
Gly Lys
Val Asp lie
lie Ala Ala
lie Tyr Ala Asp Pro Asp
Tyr 155 Glu
His 140 His
lie 125 Pro
Ala 110
Asp
Arg
95
Ser
MET
80
Tyr
Asn
Gly Lys
lie Ala Ser
Ser Gin Lys Gly Glu Phe
lie Ser Gly
Glu Gly MET Ala 205
Lys 190 Ala
Glu 175 Lys
Thr 160
Gin
Val
Asp AspGlu Tyr Gly Arg Leu Tyr lie Ala Glu Glu Asp Glu Ala lie Tr pLys
215
Gly Gly Ser Asn
Tyr210
Ser Ala Glu Pro
Phe225
Ala Asp Gly Arg
Tyr Ala Ala Asp260Ala
His245Gly
Asp230
Leu Thr Pro Asp
Glu220
Thr Val lie Asp
Gly235
Glu Gly Leu Thr
Ser Ser Tyr275Arg
Asp
Lys
Tyr
lie Thr Asp
lie
GlyAsp
lie250
MET Ala Ser Ser
Tyr Leu265
Lys Gly Gin Asn
lie255Gly
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Asn
Phe290
Gly lie Asp Val
Arg280
Pro Glu Thr Asp
Gin270
Tyr Val Ala
Asp305
Gly lie Phe Val
Gly295
Gly Phe Gly Leu
Lys285
Thr Ser Asp Thr
Leu310
Gin Asp Gly Glu
Ala325
Leu Lys lie Val
Ala Asn Gin Asn340
Arg Pro Leu Ala
lie Gly Phe355
Arg Ser Gly I」ys
Pro345Lys
Asn330Trp
Gly315lie
Gly300
Pro Glu Tyr Pro
Thr
Gly
385
Asp370
lie Glu Gly Arg
Gly390
Leu375
Thr
Asn360
Val Arg Arg Gly
Leu Glu Lys Phe395
Asp His GlyGin Val Asp
Glu Arg lie
Gin335Asp
Phe320Lys
Gin
Ser380Ala
Pro365lie
Glu
Ala350
Arg Lys Leu
Asp Asn LeuTyr
權(quán)利要求
1.一種環(huán)化的酶，其特征在于，其多肽序列的前5個氨基酸具有SEQ ID NO1序列，最后5個氨基酸具有SEQ ID NO2序列；且酶蛋白的N、C兩端相鏈接。
2. 權(quán)利要求l所述環(huán)化的酶，所述酶蛋白的N、 C兩端相鏈接，是通過內(nèi)含肽介導的環(huán)化方法，用天然的肽鍵將酶蛋白的N、 C兩端鏈接起來。
3. 權(quán)利要求l所述環(huán)化的酶，是植酸酶，編碼該酶的基因具有如SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列。
4. 一種重組大腸桿菌細胞，含有SEQ ID N0:3所示核苷酸序列的基因。
5. —種環(huán)化酶蛋白的方法，包括表達載體的構(gòu)建、重組字的篩選及環(huán)化分子的鑒定方法，其特征在于將編碼權(quán)利要求1所述多肽的基因在大腸桿菌中的環(huán)化表達。
6. 權(quán)利要求5所述的環(huán)化酶蛋白的方法，是利用天然集胞藍細菌(Synechocystisspecies PCC6803) Ssp DnaE內(nèi)含肽的轉(zhuǎn)剪接特性，分別于體內(nèi)體外對蛋白質(zhì)環(huán)化。
7. 權(quán)利要求5或6所述的環(huán)化酶蛋白的方法，在大腸桿菌中的環(huán)化表達的基因是IDN0:3所示序列的基因。
8. 權(quán)利要求6所述的環(huán)化酶蛋白的方法，所述Ssp DnaE內(nèi)含肽的基因具有如SEQ IDN0:4所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高了熱穩(wěn)定性及蛋白酶抗性的環(huán)化酶，本發(fā)明還涉及對蛋白酶進行環(huán)化以提高其性能的方法。本發(fā)明利用天然內(nèi)含肽轉(zhuǎn)剪接環(huán)化蛋白質(zhì)，環(huán)化后的蛋白質(zhì)具有更好的熱穩(wěn)定性和蛋白酶抗性。本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明的植酸酶基因的重組大腸桿菌細胞。
文檔編號C12N9/16GK101638642SQ20081011759
公開日2010年2月3日 申請日期2008年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月1日
發(fā)明者平淑珍, 維 張, 敏 林, 燕永亮, 趙仲麟, 偉 陸, 明 陳 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所