專利名稱：鏈置換聚合酶鏈反應(yīng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種體外基因擴(kuò)增-聚合酶鏈反應(yīng)
(Polymerase Chain Reaction)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在1983年的一個晚上，Cetus公司科學(xué)家KaryMullis驅(qū)車于北加州的高速 公路上，他的思緒仍不時在合成寡核苷酸測序研究上，孕育出了PCR技術(shù)的靈 感。PCR是在試管中模擬天然的DNA復(fù)制過程，成幾何級數(shù)地擴(kuò)增已知兩端序 列的一段DNA分子。以擬擴(kuò)增的DNA為模板，以一對分別與模板兩端互補的 寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶作用下，按照半保留復(fù)制的機制沿著模板 鏈延伸直至完成新的DNA鏈合成。不斷重復(fù)這一過程，可使目的DNA片段得 以擴(kuò)增。因為新合成的DNA鏈也可以作模板，因而PCR可使DNA的合成量呈 指數(shù)增長。Mullis經(jīng)過兩年的努力證實了這一技術(shù)，申請了PCR發(fā)明專利(US Patent 4,683,202)。
隨著PE等公司開發(fā)出各種熱循環(huán)PCR儀，1988年Saiki分離出Taq耐熱聚 合酶以及pfu、 Tth等其它耐熱聚合酶的發(fā)現(xiàn)應(yīng)用，PCR技術(shù)逐漸成熟、實用， 并因其高靈敏度、操作簡便而快速傳播全世界，因而1989年稱為"PCR爆炸年"。 PCR廣泛應(yīng)用于基因克隆、測序、分子檢測等眾多領(lǐng)域，成為現(xiàn)代分子生物學(xué) 最核心的基礎(chǔ)技術(shù)。在以后的二十年里，多達(dá)數(shù)十種PCR改進(jìn)，許多應(yīng)用技術(shù)、 方法不斷發(fā)明，涌現(xiàn)，詳細(xì)綜述于PCR書籍(黃留玉等"PCR最新技術(shù)原理、 方法及應(yīng)用"化學(xué)工業(yè)出版社2005年)，全世界與PCR相關(guān)的專利已多達(dá)數(shù)千 個以上。但截止目前，所有PCR技術(shù)及各種改進(jìn)方法均是直接擴(kuò)增待測靶分子 的直接PCR途徑，即檢測A基因就擴(kuò)增A基因。
PCR技術(shù)指數(shù)擴(kuò)增的終點"鏈?zhǔn)椒磻?yīng)"缺乏有效調(diào)節(jié)步聚，亦太過于靈敏。 在臨床診斷實際應(yīng)用中易極度放大交叉污染導(dǎo)致假陽性高，不容易定量檢測。 良好的PCR實驗操作，包括實驗室分區(qū)，使用一次性材料，紫外線照射和降解 PCR產(chǎn)物等理化措施能提高PCR質(zhì)量控制，但對擴(kuò)增效率百萬倍以上的高靈敏 度PCR技術(shù)而言，防止交叉污染難以完全有效。上世紀(jì)90年代中期后出現(xiàn)的實 時熒光PCR，不僅閉管監(jiān)測避免了擴(kuò)增產(chǎn)物的再污染，而且使PCR定量測定切 實可行。然而標(biāo)本間以及加樣操作仍易引起交叉污染，且RNA需要純化、逆轉(zhuǎn)錄后才能定量PCR,難以精確定量。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服常規(guī)PCR缺乏調(diào)節(jié)步聚，RNA不易精確定量等的局限。本發(fā)明提 供一種鏈置換聚合酶鏈反應(yīng)(Strand Substitute Polymerase Chain Reaction, ssPCR )，其通過將乾分子DNA和/或RNA鏈置換成與乾分子不同的報告基因鏈， 再擴(kuò)增報告基因鏈，從而能夠間接指示靶分子。
具體地說，本發(fā)明鏈置換聚合酶鏈反應(yīng)包括步驟1)以靶分子DNA鏈和/ 或RNA鏈上的一段或多段預(yù)選序列作為靶序列與一種或多種報告基因鏈的首尾 預(yù)加探針雜交，使報告基因鏈的首尾預(yù)加探針的末端相鄰，用連接酶連接，使 報告基因鏈成環(huán)；2)反方向PCR擴(kuò)增報告基因。
其中步驟1 )待測靶DNA鏈/RNA鏈通過預(yù)選的一小段保守序列或特異序 列作為探針雜交序列與報告基因首尾預(yù)選加上的探針序列雜交，連接酶(優(yōu)選 耐熱連接酶)反應(yīng)連接首尾，通過反向PCR擴(kuò)增將待測靶分子直接擴(kuò)增轉(zhuǎn)換成 包括一套以上的報告基因環(huán)。所述報告基因指與靶分子無關(guān)的或種系不同的核 酸序列，其首尾分別預(yù)加上靶分子的兩相鄰的小段保守序列或特異序列互補的 探針。所述報告基因環(huán)的反向PCR擴(kuò)增的是無關(guān)的報告基因序列和靶分子預(yù)選 的小段保守序列或特異序列互補的探針序列。即根據(jù)靶分子DNA鏈或RNA鏈 上的靶序列設(shè)計合成報告基因鏈探針，且相應(yīng)于靶序列這兩個首尾預(yù)加探針的 堿基序列是連續(xù)的。
所述鏈置換聚合酶鏈反應(yīng)ssPCR—樣適用于常規(guī)PCR應(yīng)用領(lǐng)域范圍。包括 PCR及產(chǎn)物凝膠電泳檢測、實時熒光PCR ( Real-time fluerescence PCR)定量檢 測，PCR產(chǎn)物生物芯片(MicroArray,微陣列)分析，以及分子組化，分子病理 原位PCR。較常規(guī)PCR更適合遺傳變異檢測、高度同源種屬亞型鑒定及單核苷 酸多態(tài)性SNP分析。
所述報告基因鏈為常規(guī)PCR適宜長度80base至1000base的核酸單鏈，包 括DNA單鏈、RNA鏈和修飾的核酸單鏈，或有效單鏈DNA。單鏈既可以為有 意義鏈，也可以為反意義鏈，檢測正鏈RNA分子時， 一般釆用反意義鏈。ssPCR 產(chǎn)物凝膠電泳檢測時，報告基因長度優(yōu)選為200-500 base長度為電泳效果最佳， 其它實時熒光PCR、ssPCR產(chǎn)物Microarray分析等，報告基因長度以100-200base 為最佳大小。所述基因序列無關(guān)是指同源性小或種系不同，特別是種系遠(yuǎn)離的 基因序列。如待測動物系靶分子就選擇植物系保守基因作為報告基因，反之同 樣原則。所述報告基因有效單鏈DNA是指僅一條鏈起有效的鏈置換耐熱連接酶
5反應(yīng)成環(huán)，另一條互補鏈僅伴隨存在不能鏈置換反應(yīng)的'雙鏈DNA分子，所述報
告基因首尾所加探針序列長度為核酸雜交適宜長度雙探針20 base-200 base, 單探針10~100 base，優(yōu)選20-40 base。所述報告基因鏈的制備可以釆用各種理 化方法和生物學(xué)方法制造、生產(chǎn)，首選釆用分子生物學(xué)方法，通過設(shè)計引物進(jìn) 行PCR擴(kuò)增報告基因引入探針。所述鏈置換耐熱連接酶反應(yīng)指帶末端探針的報 告基因首尾與待測靶基因模板變性后雜交，連接酶(優(yōu)選耐熱連接酶)連接報 告基因首尾成環(huán)，95'C變性，15°C-70°C (平均5(TC)復(fù)性雜交，連接反應(yīng)進(jìn)行 循環(huán)，95t:-5(TC熱循環(huán)數(shù)為l-50次，優(yōu)選10-30次循環(huán)。
所述報告基因環(huán)反向PCR為1至多重PCR，同一套報告基因，可釆用兩末 端不同長度或不同編碼序列加上不同的首尾探針，同時與多重靶分子雜交置換 成多重的報告基因，同一套引物反向PCR系統(tǒng)同時擴(kuò)增多重大小不同的PCR產(chǎn) 物或多重不同編碼序列的PCR產(chǎn)物，經(jīng)凝膠電泳分析，或編碼序列Microarray 微陣列分析，或不同編碼序列多重?zé)晒馓结槍崟rPCR，或不同編碼熒光探針原 位PCR，間接指示多重靶分子。
本發(fā)明在現(xiàn)有的PCR系統(tǒng)基礎(chǔ)上，發(fā)展了 一種全新概念的鏈置換間接PCR 途徑，較常規(guī)PCR終點鏈?zhǔn)椒磻?yīng)增加了一步鏈置換的限速調(diào)節(jié)步聚，間接PCR 擴(kuò)增的是預(yù)設(shè)的報告基因，反應(yīng)條件容易優(yōu)化，背景干凈，待測靶分子可以置 換成一系列的l, 2， 3……n套獨立報告基因， 一套污染了就可換一套。
鏈置換聚合酶鏈反應(yīng)ssPCR的原理及操作如下
ssPCR基本原理(圖1 )是常規(guī)PCR將待測標(biāo)本靶基因由兩端序列特異性 結(jié)合，延伸循環(huán)擴(kuò)增的直接檢測途徑轉(zhuǎn)換成待測靶基因雜交報告基因首尾預(yù)設(shè) 的探針序列，耐熱連接酶連接首尾，反向擴(kuò)增報告基因環(huán)，間接指示靶分子的 間接PCR途徑。
與常規(guī)PCR選取大片段序列作為擴(kuò)增模板不同，ssPCR待測標(biāo)本靶基因僅 需選取一小段(40base-60base左右)的保守序列或特異序列作為探針雜交互補 序列，將探針雜交序列分成相鄰的左半部分探針序列(L probe)和右半部分探 針序列(Rprobe)，兩相鄰的探針序列堿基連續(xù)，不少一個堿基，只是它們之間 沒有形成磷酸二酯鍵。右半部分Rprobe序列3，端加在報告基因單鏈的首端；左 半部分L probe序列5'端接在報告基因單鏈的尾端。首尾帶預(yù)設(shè)探針序列的單鏈 報告基因與待測靶基因模板互補雜交，形成"'^'"鏈-環(huán)結(jié)合式的雜交體，其 中單鏈缺口通過耐熱連接酶連接，線性報告基因成環(huán)，再反向PCR擴(kuò)增含探針 序列的報告基因環(huán)。如果沒有待測靶基因模板的幫助，線性單鏈報告基因不能鏈-環(huán)結(jié)合式雜交，也就不能連接成環(huán)，反向PCR不工作。耐熱連接酶對寧雜交 體缺口兩側(cè)雙探針堿基要完全正確匹配(配對)才能連接缺口，因此，鏈置換 反應(yīng)有著極髙的特異性。調(diào)節(jié)待測模板與報告基因比例、耐熱連接酶反應(yīng)連接 溫度，熱循環(huán)數(shù)就可以調(diào)節(jié)鏈置換反應(yīng)效率從而控制整個系統(tǒng)的效率。
帶探針報告基因鏈的制備
選取一段與待測基因無關(guān)的，或種系較遠(yuǎn)的基因序列約80-1000base
(100-500base)左右，也包括利用電腦設(shè)計同源性最小的人造序列)作為報告基 因1，另一段無關(guān)序列為報告基因2，…以此類推…n等。待測靶基因選取小段 的保守序列或特異序列(40-60base左右)作為探針雜交互補的序列，探針雜交 互補序列1對應(yīng)報告基因1,探針雜交序列2對應(yīng)報告基因2，......以此類推，
等等。同一套報告基因兩末端可以截取不同長短產(chǎn)生不同大小的報告基因鏈； 或兩末端設(shè)置不同編碼序列產(chǎn)生不同編碼的報告基因鏈。
采用常規(guī)PCR方法擴(kuò)增無關(guān)的報告基因片段，利用PCR引物僅3，端決定特 異性，5'端可以設(shè)置酶切位點等非特異性序列的特點，將雙探針序列分別加在報 告基因PCR引物5'端，即雜交探針序列右半部分R probe以有意義鏈序列3'端 加在報告基因PCR上游引物5'端合成帶首尾報告基因上游引物；雜交探針序列 左半部分L probe以反意義鏈序列3'端接在報告基因PCR下游引物5'端合成帶 首尾報告基因下游引物。以此對5，磷酸化引物和小分子標(biāo)記如5'生物素標(biāo)記引 物，釆用pfo聚合酶擴(kuò)增產(chǎn)生平末端的帶探針報告基因。或者以帶酶切位點的此 對引物PCR擴(kuò)增帶探針的報告基因，酶切，克隆至質(zhì)粒載體，產(chǎn)生帶探針的報 告基因質(zhì)粒。生產(chǎn)報告基因(檢測有意義鏈模板)時，以該質(zhì)粒為模板，以5，端小 分子標(biāo)記如生物素標(biāo)記的Rprobe有意義鏈序列為上游引物，以5'端磷酸化的L probe反意義鏈序列為下游引物，(反之，Rprobe上游引物5'端磷酸化，Lprobe 下游引物5，端生物素標(biāo)記，檢測反意義鏈模板)，PCR擴(kuò)增帶探針的報告基因， 凝膠電泳純化，產(chǎn)物經(jīng)95'C變性后快速冰洛冷卻，固相分離如鏈親和素交聯(lián)的 Sepharose 4B/磁珠結(jié)合去除生物素標(biāo)記單鏈，殘存的少量雙鏈由于5，端帶生物素 的單鏈不能置換反應(yīng)，被認(rèn)為有效單鏈。 鏈置換耐熱連接酶反應(yīng)
待測標(biāo)本靶基因經(jīng)初步的DNA純化或總RNA提取后加樣1 yl，液態(tài)標(biāo)本 可直接取樣l-2ul，低豐度標(biāo)本亦可釆用靶基因互補Oligo固相結(jié)合富集。標(biāo)本 靶基因含量檢測范圍從微克水平(l"g/ml)、納克水平(lng/ml)、皮克水平
(lpg/ml)到飛克水平(10fg/ml)。加入一定比例的純化單鏈(或有效單鏈)報
7告基因，ljal-2ial的含量0.1ng/ml-0.5mg/ml， 一般0.01 ju g/ml-10 |u g/ml (或0.1 iaM-liLiM)左右的報告基因，首先高溫95。C變性數(shù)分鐘使靶基因分子和報告基 因變性或單鏈，再低溫5(TC左右退火復(fù)性，雜交連接5分鐘。如有陽性靶基因 模板則通過其探針雜交互補序列與報告基因首尾探針雜交，使線性帶首尾探針 的報告基因兩側(cè)5，末端和3'末端因雜交結(jié)合待測模板而相互靠近，首尾鍥合并 置銜接，形成鏈-環(huán)結(jié)合式雜交體，耐熱連接酶連接雜交體單鏈缺口， 使首尾共價連接，線狀報告基因成環(huán)。如果沒有陽性靶基因幫助雜交結(jié)合，線 狀單鏈報告基因首尾不能連接，也就不能成環(huán)，陰性標(biāo)本只存在線性報告基因。 耐熱連接酶連接反應(yīng)在高溫95。C左右和低溫54'C左右循環(huán)，首先95°C4分鐘,然 后2-50個循環(huán)(優(yōu)選10-30個循環(huán))94。C變性30秒至1分鐘,54。C連接5分鐘。調(diào) 節(jié)連接溫度和循環(huán)數(shù)及報告基因比例可能調(diào)整檢測靶基因濃度范圍。增加連接 溫度可以進(jìn)一步降低非特異性反應(yīng)背景。 環(huán)狀報告基因反向PCR:
對于環(huán)狀報告基因，釆用除探針序列外的任何兩小段序列均可作為反向引 物， 一般選用線性報告基因正中間的兩小段序列，右邊一段有意義鏈作為反向 PCR上游引物，左邊一段反意義鏈作為反向PCR下游引物。以鏈置換耐熱連接 酶反應(yīng)物作為模板，Taq聚合酶催化反向PCR擴(kuò)增環(huán)狀報告基因，PCR擴(kuò)增的
是中間帶一小段與待測靶基因互補的探針序列和兩端大部分為報告基因序列的 片段。反向PCR產(chǎn)物為報告基因環(huán)一樣大小的DNA雙鏈。產(chǎn)物可以釆用凝膠 電泳分析，或釆用報告基因中預(yù)設(shè)的編碼序列Microarray微陣列分析。反向PCR 可與實時熒光PCR儀聯(lián)用，或不同編碼熒光探針原位PCR。 操作流程
(一)待測標(biāo)本的純化 (1 ) DNA樣本的純化
等量酚-氯仿抽提，商業(yè)DNA純化柱純化(詳細(xì)步驟按Qiagen說明書進(jìn)行)
1) :力口 100-200jil樣本于1.5mlEP管中加等量的酚/氯仿/異戊醇(25: 24: 1 ) 抽提，漩渦振蕩，臺式離心機離心最高速5分鐘。
2) :上清100-200^1轉(zhuǎn)移至新EP管中，加等量氯仿，振蕩，離心。
3) :上清加4倍的Qiagen結(jié)合緩沖液移至純化柱，洗滌緩沖液洗柱兩次， 加50(il dH20洗脫收集純化的樣本。
(2) RNA樣本的純化
異硫氰酸胍 一 步法提取總RNA ( Chomczynski ， P et, al. 1987Anal. Biochem. Vol 162， 156)。
樣本于EP管中力口 lml的Trizole ( lml 4M異硫氰酸胍，lml酚，0.1ml 2M 醋酸鈉PH4.0)變性液裂解，強烈漩渦振蕩或用針頭反復(fù)抽吸，再加200)il氯仿 振蕩，離心5分鐘，取上清加等量0.5ml異丙醇置-20。C2小時再離心沉淀，70% 乙醇洗滌一次，加50^dDEPC處理的dH2O溶解。 一般沒有必要純化mRNA。
待測靶基因低豐度標(biāo)本亦可釆用靶基因互補的短Oligo固相結(jié)合富集。 (二)加首尾報告基因DNA的PCR制備
a) 合成報告基因PCR引物.-
5'端引物首先待測模板探針雜交序列右半部分有意義鏈15-25base, 再加報告基因5'端最開始的20base有意義鏈序列。
3'端引物首先待測模板探針雜交序列左半部分反意義鏈15-25base， 再加報告基因3'端最開始的20base反意義鏈序列。 一端引物5，生物素標(biāo)記，另一端引物5，磷酸化。
b) PCR擴(kuò)增報告基因并凝膠電泳純化。
種系無關(guān)的報告基因模板
5'端報告基因引物(5uM)
3'端報告基因引物(5uM)
10xpfti buffer
10mMdNTP
pfu
dH,O40ul
變性95。C5分鐘，25個循環(huán)，94°C 30秒，52°C 30秒，72°C30秒。經(jīng)25 個循環(huán)后72。C10分鐘。
首先瓊酯糖凝膠agarose電泳純化試劑盒純化?；厥债a(chǎn)物經(jīng)95'C變性后快速 冰洛冷卻，釆用固相的鏈親和素交聯(lián)Sepharose 4B/磁珠結(jié)合，去除生物素標(biāo)記 單鏈，制備帶探針報告基因單鏈或有效單鏈。 (三)合成反向PCR引物
取報告基因序列正中間相近的兩段約20+20 base長的序列，右半部分20 base 長的有意義鏈序列作為5'端反向PCR引物，左半部分20 base長的反意義鏈作 為3'端反向PCR引物。
9(四)鏈置換耐熱連接酶反應(yīng)
待測液體樣本 2pl 純化的帶探針報告基因單鏈 2pl 10XTth連接酶緩沖液 5^1 dH2Q_
50|il
首先95'C變性4分鐘，加入Tth連接酶lfil，再10-20個循環(huán)，94°C 30秒， 52°C 5分鐘，經(jīng)10-20個循環(huán)后，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)95'C變性2分鐘后快速冰浴冷卻。 (五)環(huán)狀報告基因反向PCR:
雜交連接酶反應(yīng)液 1^1
5'端反向引物Primer l^il 3'端反向引物Primer
10mMdNTP l|il
10xTaq buffer 5|il
Taq 1 pi
dH20_
變性94。C5分鐘，20-30個循環(huán)，94°C 30秒，52°C 30秒，72°C30秒。25 個循環(huán)后72。C10分鐘。 (六)反向PCR產(chǎn)物分析
(1)產(chǎn)物可以釆用1.5%-2% agarose凝膠電泳分析；(2)釆用報告基因中預(yù) 設(shè)的編碼序列Microarray微陣列分析；(3 )反向PCR可與實時災(zāi)光PCR儀聯(lián)用； (4)不同編碼熒光探針原位PCR。
根據(jù)本發(fā)明的方法可以設(shè)計一種DNA或RNA單鏈用于檢測試劑盒，包括 所述報告基因，在所述報告基因首尾兩端具有探針，該探針能夠與靶分子DNA 或RNA鏈雜交，并且使得報告基因首尾兩端探針的末端相鄰。該試劑盒還可包 括Taq連接酶及其緩沖液、dNTPs、 Taq聚合酶及其緩沖液、依據(jù)報告基因產(chǎn)生 設(shè)計合成反向引物和凝膠電泳試劑中的 一種或多種。
本發(fā)明中所述的報告基因是一段核苷酸序列，通過擴(kuò)增該序列從而能夠間接 指示靶分子，這里的核苷酸序列可以是DNA或RNA,也可以是經(jīng)修飾后的DNA 或RNA序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解本發(fā)明中所述的與靶分子無關(guān)或不相同是 指所述報告基因鏈與靶分子同源性低(越低越好)，在熱循環(huán)中不與靶分子雜交，報告基因可以是人工設(shè)計合成的，或者是從種系不同特別是種系遠(yuǎn)離的物'種中 獲得。
本發(fā)明ssPCR主要優(yōu)點表現(xiàn)在
(1) 直接PCR，標(biāo)本基因太雜，非特異性背景高。ssPCR擴(kuò)增的置換報告基 因可以通過預(yù)選不同于靶分子DNA或RNA，從而擴(kuò)增結(jié)果單一，背景干凈， 尤其熒光定量，或分子組化，或微陣列分析時優(yōu)越。
(2) 通過置換步聚將常規(guī)"核爆"式的終點反應(yīng)PCR加了一步可調(diào)節(jié)步聚， 成為可控的"鏈?zhǔn)椒磻?yīng)"，系統(tǒng)反應(yīng)條件容易優(yōu)化、控制。
(3) "雙探針"雜交置換方式特異性極髙，所以待測標(biāo)本無需純化、預(yù)處理， 可直接加樣檢測。
(4) 點突變基因、降解短DNA片段，各種RNA均可直接置換成報告DNA 擴(kuò)增，無需逆轉(zhuǎn)錄步聚，適用范圍廣泛，不易漏檢。
(5) 靶基因可置換成 一系列的不同報告基因， 一套污染了就可立即換一套系 統(tǒng)，規(guī)避了一套系統(tǒng)的易交叉污染。


圖l為本發(fā)明原理示意圖
兩段序列相鄰的探針(與待測模板互補的序列)分別連接在一段無關(guān)序列的 首尾末端構(gòu)成報告基因，報告基因可通過首尾與待測模板互補雜交，從而其首 尾末端靠近銜接，雜交體單鏈缺口被連接酶連接，使報告基因成環(huán)，再反向PCR 擴(kuò)增報告基因環(huán)。如果沒有待測模板的存在，報告基因不能成環(huán)，反向PCR不 擴(kuò)增。其中圖示粗直線代表待測模板有意義鏈，細(xì)直線代表待測模板反意義 鏈；環(huán)線代表與待測模板無關(guān)的序列，短直線代表探針序列，短箭頭代表反向 PCR引物。
圖2為本發(fā)明實施例檢測樣本腸道病毒的結(jié)果
圖中，M電泳道DNA標(biāo)準(zhǔn)品；l.電泳道陽性對照，共有360bp， 300bp , 200bp三條帶，2.電泳道空白陰性對照；3.樣品道產(chǎn)生300bp主帶，同時出 現(xiàn)200bp條帶則為EV71型腸道病毒陽性；4.樣品道僅一條300bp主條帶則為 EV71、 CoxA16以外其它型腸道病毒感染。
具體實施例方式
以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在 不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或 替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
實施例l手足口病腸道病毒的置換報告基因多重擴(kuò)增
目前傳染病源包括腸道病毒的診斷一般釆用分離培養(yǎng)法、基因克隆測序法、 免疫血清學(xué)等診斷法和分子檢測的實時熒光PCR方法。前兩種方法檢測結(jié)果最 為可靠，但耗時很長，依賴一定的實驗技術(shù)條件。后兩種為臨床檢驗廣泛使用 的臨檢診斷方法。
人腸道病毒為小RNA病毒科致病株，包括腸道病毒(EV) A、 B、柯薩病 毒(COX) A16，?？刹《?echorirus30 )和EVA新血清型EV71, EV71又包括 BrCr、 Bl、 2、 3、 4、 5和Cl， 2, 3， 4亞型。亞洲常年散發(fā)流行，以6、 7月 份高峰，病毒易高度變異,幾年一小流行，每九年一次大流行。最近，安徽阜陽 一次大的流行將腸道病毒診斷研究提到一個高度重要位置。腸道病毒象流感病 毒一樣高度變異，幾乎沒有兩個基因相同的腸道病毒，所以免疫學(xué)診斷方法的 建立象流感病毒疫苗研究一樣困難。更重要的是5歲以上的人口 50%以上腸病 毒抗體陽性，只有定量測定抗體增加4倍以上才能疑似感染。實時熒光PCR不 僅儀器昂貴，熒光探針(外國專利)更貴，更困難的是在EV所有致病株中找不 出一段合適的兩端保守基因序列來作為共同的靶基因擴(kuò)增，目前報道的腸道病 毒PCR引物序列只對少量腸道病毒株特異性配對，必然存在大量漏檢。
本實施例"手足口病腸道病毒的置換報告基因多重擴(kuò)增"的基本原理是將 原來檢測腸道病毒就擴(kuò)增其一段基因的直接PCR舊觀念創(chuàng)新為待測基因通過一 小段保守序列雜交帶探針的無關(guān)報告基因，再擴(kuò)增報告基因間接檢測病源的新 概念間接PCR方法。即將特異性高的探針雜交技術(shù)與極其靈敏度的PCR技術(shù)整 合，將PCR擴(kuò)增信號代替常規(guī)的探針同位素、熒光等物理標(biāo)記信號的檢測。其 技術(shù)概要將腸道病毒共同的一段5，-NTR非編碼區(qū)約50bp 98%高度同源的保 守區(qū)(BrCr株nt441-491 )作為探針序列，其探針序列分成相鄰的右、左探針 分別加在一段無關(guān)的報告基因首尾末端，帶探針的報告基因就可通過其首尾特 異的互補序列與待測腸道病毒保守區(qū)雜交，從而帶首尾報告基因通過預(yù)設(shè)的雜 交排列方式，其首尾末端靠近銜接，雜交體單鏈缺口被耐熱連接酶連接，使報 告基因成環(huán)，釆用報告基因正中間的序列作為引物反向PCR擴(kuò)增環(huán)狀的報告基 因。如果沒有待測特異性基因的幫助，報告基因不能成環(huán)，反向PCR因報告基 因模板末端斷開也就不能擴(kuò)增。(原理示意圖1)。
利用同一套只是大小不同的報告基因(兩末端不同延伸長度，中間大部份相同)，不同大小Reportl,2，3加上不同的首尾探針，在同一反向系統(tǒng)中就可同時 檢測幾種不同的保守靶序列。腸道病毒5，-NTR保守序列g(shù)tagtcctccggcccctgaatgcg gct-aatcctaactgcggagcacat在致病株中98%高度同源，保守區(qū)探針加在序列無關(guān)的 植物擬南芥LFY基因(260bp片段)首尾生成帶首尾的報告基因，反向PCR產(chǎn) 生一約300bp片段間接指示總的腸道病毒感染指標(biāo)。同時在腸道病毒EV71型編 碼區(qū)衣壹蛋白VP1選取一段EV71所有亞型高度同源的相對保守序列(不與 coxA16等其它型雜交)gagcta…一gttgcg，并參考EV71亞型同源變異作為探針 加在兩端各縮短50bp的同一LFY基因片段的首尾，生成EV71亞型的報告基因， 反向PCR產(chǎn)生一約200bp大小的間接指示腸道病毒EV71型的感染。腸道病毒
Coxsackirirms A16 Vpl的一段特異序列g(shù)accca------gccagt加在兩段各延長30bp
的同一 LFY基因片段的首尾，生成CoxA16的報告基因，反向PCR產(chǎn)生一約 360bp大小的間接指示腸道病毒CoxA16的感染。將三種報告基因混合，同時與 待測標(biāo)本雜交-耐熱連接酶反應(yīng)，再采用同一對反向引物，反向PCR報告基因， 結(jié)果分析，產(chǎn)生300bp主帶診斷腸道病毒感染，如果同時出現(xiàn)200bp條帶則為 EV71型，如果同時出現(xiàn)360bp條帶則為CoxA16型。僅一條300bp條帶則為 EV71、 CoxA16以外其它型腸道病毒感染。
技術(shù)及操作步聚
本項目腸道病毒的報告基因擴(kuò)增檢測法較常規(guī)的腸道病毒基因直接PCR 法，只增加了報告基因制備及雜交-耐熱連接酶反應(yīng)，但沒有了常規(guī)PCR繁瑣的 標(biāo)本處理及純化逆轉(zhuǎn)錄步聚。而且報告基因可以大批量廠家預(yù)先生產(chǎn)好。
(1)帶首尾探針的報告基因制備
選取與腸道病毒種屬很遠(yuǎn)的植物似南芥LFY兩段約300bp左右的片段分別 作為第一套和第二套(備用)報告基因，報告基因長度標(biāo)準(zhǔn)以反向PCR效率最 佳為主要考慮。
第一套帶首尾探針的報告基因(Reportl)制備
Report I又包括三種不同首尾探針的不同大小LFY報告基因?？偟牟呗运?路是將CoxA16VPl編碼區(qū)特異性片段作為探針序列加在第一套約320bp大小 LFY序列，生成CoxA16型特異的360 bp大小報告基因；將所有腸道病毒致病 株共同5，-NTR非編碼區(qū)(BrCr株nt441-491 )保守序列作為探針序列加在同一 套但兩端各縮短30bp (約260bp)的LFY序列，生成總的腸道病毒指示感染的 300bp大小報告基因；再將EV71型中高度同源的相對保守序列(參考各亞型變 異后)作為探針序列加在同一套但兩端各再縮短50bp (約160bp)的LFY序列，生成EV71型指示的200bp大小報告基因。
合成報告基因引物時，將待測的三對雙探針序列分別加在三段不同大小 (320bp，260bp和160bp)同一段LFY序列上、下游引物外側(cè)，即右邊探針序列 (約20base)以有意義鏈加在LFY 5'端引物前面;左邊探針序列(約20base ) 以反意義鏈接在LFY3，端引物后面。使用此三對引物(上游引物5'端生物素標(biāo) 記，下游引物5'端磷酸化)和pfu酶分別擴(kuò)增LFY生成三條加首尾的報告基因， 瓊酯糖凝膠電泳純化，透析袋回收后乙醇沉淀，沉淀的報告基因DNA分別重溶 于dH20。
第二套帶首尾探針的報告基因(ReportII)制備
Report II以腸道病毒致病株EVA，CoxA16，EV71,也包括poliovirus共同的 protein 2C保守序列作為探針序列，其右左部分分別加在另 一段約260bp LFY片 段首尾形成第二套備用報告基因。在陰性對照組假陽性反應(yīng)后，替換第一套報告 基因系統(tǒng)工作一段時間，待實驗室自凈后或第二套亦對照組出現(xiàn)假陽性后才換回 第一套系統(tǒng)。
(2) 雜交-耐熱連接酶反應(yīng) 將第一套三種不同大小的報告基因DNA混合，與待測標(biāo)本雜交，如有陽性
模板則通過其預(yù)選保守序列與加首尾報告基因DNA兩側(cè)末端互補探針序列雜 交，使加首尾報告基因DNA5'末端和3'末端因結(jié)合待測模板保守雜交序列而相 互首尾靠近銜接，并經(jīng)Taq連接酶連接，缺口修復(fù)而生成環(huán)狀報告基因DNA。并 且可以進(jìn)行95°C x 5mins-50°C x 5mins熱循環(huán)2-10次。而未雜交的雙鏈報告基 因DNA鏈的首尾平末端在耐熱連接酶50。C以上工作時不會連接,低溫時耐熱Taq 連接酶又不會工作。結(jié)果只有陽性標(biāo)本中因有陽性模板雜交序列幫助，報告基 因DNA才能形成環(huán)狀DNA，而陰性標(biāo)本則只存在線性報告基因DNA。
耐熱連接酶反應(yīng)從第二個循環(huán)開始，不僅待測特異性陽性基因幫助報告基 因DNA成環(huán)，而且已經(jīng)成環(huán)的報告基因DNA亦協(xié)助斷開的報告基因DNA成環(huán), 所以成環(huán)的報告基因DNA也是以指數(shù)方式增長。
(3) 環(huán)狀報告基因反向PCR:
釆用報告基因正中間的序列作為反向PCR引物，向外延伸反向擴(kuò)增環(huán)狀報告 基因DNA, PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)生三種360bp, 300bp和200bp大小 PCR條帶，僅出現(xiàn)300bp條帶指示總的腸道病毒感染，300bp+200bp條帶為EV71 型感染，300bp+360bp條帶為CoxA16型感染，而陰性標(biāo)本因報告基因不成環(huán)， 線性DNA釆用中間序列作為反向引物，向外延伸反向擴(kuò)增不出，電泳沒有DNA條帶。
調(diào)節(jié)置換報告基因步聚的反應(yīng)條件，可使系統(tǒng)檢測靈敏度在納克(ng)、皮 克(pg)及飛克(fg)等不同水平范圍內(nèi)有效調(diào)節(jié)，總可以找出一個調(diào)節(jié)關(guān)鍵點， 使真正陽性標(biāo)本有效反應(yīng)陽性，下調(diào)/放棄一點剩余/過度的靈敏度換取系統(tǒng)對氣 霧膠交叉污染的數(shù)十或數(shù)百個以下拷貝不反應(yīng)/不敏感，減少交叉污染引起的假
陽性。加上良好的PCR實驗室操作(如實驗室分區(qū)，在超凈工作臺內(nèi)工作，帶 手套，使用過濾芯吸頭等)，反向PCR產(chǎn)物在另設(shè)一間專門獨立的電泳實驗室進(jìn) 行凝膠電泳，并且PCR產(chǎn)物單向傳至電泳室，效果就等同于實時熒光PCR的閉 管操作。同時使用了 5'端01igo d(A)標(biāo)記的反向引物，在電泳緩沖液盒中加入 適量Oligod(T)交聯(lián)的纖維素凝膠顆粒，結(jié)果從電泳凝膠中滲出少量的反向PCR 產(chǎn)物，就會通過Oligod(A)-Oligod(T)結(jié)合至凝膠顆粒，減少揮發(fā)。再則，反向 PCR底物釆用dUTP代替dTTP,揮發(fā)的PCR產(chǎn)物進(jìn)一步可用尿嘧啶N-糖基化 酶降解破壞。如果陽性與陰性對照均不工作，說明污染，就可換第二套報告基 因系統(tǒng)，再污染再輪換。 以下是優(yōu)選的實施例
(一)第一套報告基因的制備
選取與腸道病毒種屬很遠(yuǎn)的植物擬南芥LFY基因一段序列(CDS nt781-1080)作為第一套ReportI共同的報告基因。其序列如下
CCACTTGTAC
(GAACAATGCC GTGAGTTCCT TCTTCAGGTC CAGACAATTG CTAAAGACCG TGGCGAAAAA TGCCCCACCA AGGTGACGAA CCAAGTATTC AGGTACGCGA AGAAATCAGG AGCGAGTTAC ATAAACAAGC CTAAAATGCG ACACTACGTT CACTGTTACG CTCTCCACTG CCTAGACGAA GAAGCTTCAA ATGCTCTCAG AAGAGCGTTT AAAGAACGCG GTGAGAACGT TGGCTCATGG CGTCAGGCTT GTTACAAGCC ACTTGTGAAC ATCGCTTGTC GTCATGGCTG GGATATAGAC)
GCCGTCTTTAA.
(l)EV總報告基因的制備
選取腸道病毒致病株共同5'-NTR非編碼區(qū)(BrCr株nt441-491 )絕對保守序 歹'J作為探針序歹'J,即gta gtc etc egg ccc ctg aat gcg gct-aat cct aac tgc gga gca cat,其 右左部分分別加在約250bp LFY報告基因的首尾。具體方案是首先生成首尾帶 探針序列的LFY片段的克隆質(zhì)粒，然后以該質(zhì)粒為模板，僅以5'-NTR非編碼 區(qū)探針序列作為引物，擴(kuò)增、純化EV總報告基因。 質(zhì)?？寺∩嫌我顱amffl位點+右半探針有意義鏈+上游LFY引物有意義鏈pI/EVFl: 5'畫gga gca cat acc ctt cag gtc cag aca att get aaa g-3 ， pI/EVF: 5，-eg gga tcc aat cct aac tgc gga gca cat acc ctt cag-3'
質(zhì)?？寺∠掠我顴coRI位點+左半搮針反意義鏈+下游LFY引物反意義
pI/EVRl: 5，-cag ggg ccg gag gac tac gtt cac aag tgg ctt gta ac-3， pI/EVR: 5 ，-cg gaa ttc age cgc att cag ggg ccg gag gac tac畫3'
以此對引物(pI/EVF: Fl =9:1 )/(pI/EVRl:R二l:9)常規(guī)PCR,產(chǎn)物純化、 酶切，克隆至pUC19質(zhì)粒載體，測序鑒定。
合成EV總報告基因制備引物(且F生物素化，R磷酸化) I/EVF: 5，-aat ccY aac tgc gga gca cat acc-3' I/EVR: 5 ，-agc cgc att cag ggg ccg gag gac隱3 ，
以此對磷酸化引物制備EV總報告基因
pUC-I/EV 5'I/EVF引物(5)iM) 3，I/EVR引物(5jiM) lOmMdNTPs lOxpfu聚合酶緩沖液 pfu聚合酶 dH2Q_
1^1 ljil
5 |il l|_il 40^1
54。C30秒，72。C35秒，經(jīng) 透析袋回收后乙醇沉淀，
首先94'C變性5分鐘，再進(jìn)行循環(huán)，94'C30秒， 過25個循環(huán)后，最后72。C10分鐘。
EV總報告基因PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊酯糖凝膠電泳純化， 沉淀的DNA重溶于dH20。 (2)EV71型報告基因的制備
選取腸道病毒EV71型衣殼蛋白編碼區(qū)VP1的一段相對保守序列作為探針 序列，該區(qū)序列不與其它腸道病毒亞型交叉，但在EV71的亞型之間仍存在一些 變異。排列、比較所有從Genebank收集的EV71亞型(BrCr, B，C等)該區(qū)序 列，總結(jié)出兩個具有代表性的序列，a: gag cta ttc acc tac atg cgc t-tt gat gca gag ttc act ttt gtt gcg和b: gag ctg ttc acc tac atg cgc t-tt gac gca gaa ttc act ttt gtt gcg。每個 右左部分分別加在兩端各縮短一些約150bp的小LFY片段首尾，首先克隆這兩種帶EV71首尾探針的LFY片段質(zhì)粒pUC- I 71a和pUC- I 71b。然后以該質(zhì)粒 為模板，以更廣泛代表性的簡并性VP1區(qū)引物擴(kuò)增，純化EV71型報告基因,可 以指示絕大部EV71亞型的檢測。 pUC-I71a上游引物BamH I位點+右半探針有意義鏈+小LFY上游引物 pI71 aF 1: 5 ， -ttt gtt gcg tgc act cccgaa cca agt att cag gto c-3 ， pI71aF: 5，-eg gga tec gca gag ttc act ttt gtt gcg tgc act ccc ac-3'
pUC-I71a下游引物EcoR I位點+左半探針有意義鏈+小LFY下游引物 pI71 aRl: 5 ，-gaa tag etc cac ctt tct cgc gtt ctt taa acg ctc-3 ， pI71 aR: 5 ，-cg gaa ttc cat gta ggt gaa tag etc cac ctt tct c-3'
以此對引物(pI71aF: Fl =9:1 ) / (pI71aRl:R4:9)常規(guī)PCR,產(chǎn)物純化、酶 切，克隆至pUC19質(zhì)粒載體,產(chǎn)生pUC-I71a，測序鑒定。
合成EV71a型報告基因制備簡并性引物(且F生物素化，R磷酸化) 171 aF: 5 ，畫tt gat/c gca gag ttc act ttt gtt/a gcg tgc act ccc ac-3' 171aF， 5，國tt gac gca gag ttc act/c ttt gtc gcg tgc act ccc ac匿3， 171 aR: 5 ，-a gcg cat g/ata ggt gaa tag etc cac -3'
以此對磷酸化引物制備EV71a型報告基因 pUC-I71a l(J 5'I71aF引物(5iiM) 0.5|il 5'niaF，引物(5(iM) 0.5^1 3'I71aR引物(5^M) 1^1 10mMdNTPs 1^1 10xpfu聚合酶緩沖液 5|il pfu聚合酶
dH20_
首先94。C變性5分鐘，再進(jìn)行循環(huán)，94。C30秒，54。C30秒，72°C35秒，經(jīng) 過25個循環(huán)后，最后72t:i0分鐘。
EV71 a報告基因PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊酯糖凝膠電泳純化，透析袋回收后乙醇沉淀， 沉淀的DNA重溶于dH20。
pUC-I71b上游引物BamH I位點+右半搬針有意義鏈+小LFY上游引物 pI71bFl: (5，-ttt gtt gcg tgc act ccc ac gaa cca agt att cag gta c-3")(同pI71aFl)
p171 bF: 5 ，畫cg gga tcc gca gaa ttc act ttt gtt gcg tgc act ccc ac-3 ，
pUC-I71b下游引物BamH I位點+左半探針有意義鏈+小LFY下游引物 pI71 bRl: 5' -gaa cag etc cac ctt tct cgc gtt ctt taa acg ctc國3' pI7 IbR: 5' -eg gga tcc cat gta ggt gaa cag etc cac ctt tct c-3 ，
以此對引物(pI71bF: Fl-9:l)/(pI71bRl:R二l:9)常規(guī)PCR，產(chǎn)物純化、酶 切，克隆至pUC19質(zhì)粒(BamHI alone酶切,Cip)，產(chǎn)生pUC-I71b，測序鑒定。
合成EV71b報告基因制備簡并性引物(且F生物素化，R磷酸化) 171 bF: 5 ，-tt gac/t gca/g gaa ttc act ttt gtt gcg tgc ac-3' I71bF， 5，-tt gac/t gca gag ttc acc ttt gtt gcg tgc act ccc ac-3， 17IbR: 5'畫a g/acg cat gta ggt gaa cag etc cac -3，
以此對磷酸化引物制備EV71 b報告基因
pUC-I71b l^il
5'I71bF引物(5pM) 0.5^1
5,171bF，引物(5iaM) 0.5|il 3'I71bR引物(5pM) 10mMdNTPs
lOxpfii聚合酶緩沖液 5|il
pfu聚合酶 1(^1
叫o_
50|il
首先94。C變性5分鐘，再進(jìn)行循環(huán)，94。C30秒，54。C30秒，72°C35秒，經(jīng) 過25個循環(huán)后，最后72。C10分鐘。
EV71 b報告基因PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊酯糖凝膠電泳純化，透析袋回收后乙醇沉淀， 沉淀的DNA重溶于dH20,并與EV71a報告基因DNA合并。 (3) CoxAl6型報告基因的制備
選取腸道病毒CoxA16型編碼區(qū)衣殼蛋白VP1的一段特異性序列作為探針 序歹U ， 即gac cca cca get caa gtg tca-gtc ccc ttc atg tea cca gec agt。 將其右左部分 分別加在兩端各延長 一 些約320bp的大LFY片段首尾，首先克隆這種帶CoxA 16 型首尾探針的LFY片段質(zhì)粒pUC-IA16。然后以該質(zhì)粒為模板，以其簡并性的 VP1區(qū)引物擴(kuò)增，純化CoxA16型報告基因，可以指示絕大部CoxA16型的檢測。質(zhì)粒pUC-IA16上游引物BamH I位點+右半探針有意義鏈+大LFY上游引
物
pIA16Fl: 5'-atg tea cca gcc agt cca ctt gta cga aca atg cc國3' pIA16F: 5'-cg gga tcc gtc ccc ttc atg tea cca gcc agt cca c-3'
質(zhì)粒pUC-IA16下游引物EcoR I位點+左半探針反意義鏈+大LFY下游引
pIA16Rl: 5，-ttg age tgg gtc tta aag acg gcg tct ata tcc-3' pIAl 6R: 5 ，-cg gaa ttc tga cac ttg age tgg tgg gtc tta aag-3'
以此對引物(pIA16F: Fl =9:1 ) /(pIA16Rl:R-l:9)常規(guī)PCR，產(chǎn)物純化、 酶切，克隆至pUC19質(zhì)粒載體，產(chǎn)生pUC-IA16,測序鑒定。
合成CoxA16型報告基因制備引物(且F生物素化，R磷酸化) IA16F: 5，-gtc/a ccc ttc atg tca/t cca gcc agt cca ctt gta c-3' IA16R: 5'-tga cac ttg a/tgc t/egg tgg gtc tta aag acg g-3'
以此對轔酸化引物制備C o x A16型報告基因 pUC-IA16 5， IA16F引物(5pM) 3，IA16R引物(5pM) ljul 10mMdNTPs lOxpfU聚合酶緩沖液 5jil pfU聚合酶 l|il dH20_1^1
50|il
首先94。C變性5分鐘，再進(jìn)行循環(huán)，94。C30秒，54。C30秒，72°C35秒，經(jīng) 過25個循環(huán)后，最后72TM0分鐘。
CoxA16型報告基因PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊酯糖凝膠電泳純化，透析袋回收后乙醇 沉淀，沉淀的DNA重溶于dH20。
最后EV總報告基因DNA, EV71a報告基因+EV71b報告基因DNA和 CoxA16型報告基因DNA混合合并為第一套Reportl報告基因。
(二)第二套報告基因的制備
選取與腸道病毒種屬很遠(yuǎn)的植物擬南芥LFY基因另一段序列(CDS
19ntl05-355 )約250bp作為第二套ReportII的報告基因。其序列如下 ACACCGCAGA CGGCTGCTTT TGGGATGCGA CTTGGTGGTT TAGAGGGACT ATTCGGTCCG TACGGTATAC GTTTCTACAC GGCGGCGAAG ATAGCGGAGT TAGGTTTTAC GGCGAGCACG CTTGTGGGTA TGMGGACGA GGAGCTTGAA GAGATGATGA ATAGTCTCTC TCATATCTTT CGTTGGGAGC TTCTTGTTGG TGAACGGTAC GGTATCAAAG CTGCCGTTAG AGCTGAACGG AGACGATTGC.
選取腸道病毒致病株共同的編碼區(qū)Protein 2C —段絕對保守序列作為探針 序歹ll,即atg aat aac tac atg cag ttc aag a-gc aaa cac cgt att gaa cct gta tgc， 其右左部 分分別加在約250bp第二段LFY報告基因的首尾。具體方案是首先生成首尾帶 探針序列的LFY片段的克隆質(zhì)粒pUCII/EV,然后以該質(zhì)粒為模板，僅以Protein 2C編碼區(qū)探針序列作為引物，擴(kuò)增、純化ReportII總報告基因。
質(zhì)?？寺∩嫌我顱amHI位點+右半掇針有意義鏈+上游LFY引物有意義
鏈
pII/EVFl: 5'畫att gaa cct gta tgc aca ccg cag acg get get ttt g-3， pII/EVF: 5,-eg gga tec cac cgt att gaa cct gta tgc aca cc-3'
質(zhì)粒克隆下游引物EcoRI位點+左半極針反意義鏈+下游LFY引物反意義
鏈
pII/EVRl: 5 ,-cat gta gtt att cat gca ate gtc tec gtt cag ctc-3, pII/EVR: 5 ，-cg gaa ttc gaa ctg cat gta gtt att cat gca atc-3'
以此對引物(pII/EVF: Fl二9:l)/(pII/EVRl:R二l:9)常規(guī)PCR，產(chǎn)物純化、 酶切，克隆至pUC19質(zhì)粒載體，測序鑒定。
合成ReportII總報告基因制備引物(且F生物素化，R磷酸化) II/EVF: 5 ，畫gc aaa cac cgt att gaa cct gta tg-3 ， II/EVR: 5 ，畫t ctt gaa ctg cat gta gtt att cat g-3'
以此對磷酸化引物制備ReportII總報告基因
pUCII/EV ljil
5，II/EVF引物(5jiM) ljil
3，II/EVR引物(5pM) 1^1
10mMdNTPs l^il
lOxpfb聚合酶緩沖液 5|il
pfu聚合酶 lfll
dH20_40|il50nl
首先94。C變性5分鐘，再進(jìn)行循環(huán)，94。C30秒，54。C30秒，72°C35秒，經(jīng) 過25個循環(huán)后，最后72。C10分鐘。
ReportII總報告基因PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊酯糖凝膠電泳純化，透析袋回收后乙醇沉 淀，沉淀的DNA重溶于dH20。 (三)雜交——耐熱連接酶反應(yīng)
血液、膿液及分泌物標(biāo)本可直接加樣1^1,或用生理鹽水稍做稀釋直接加樣。 對于糞便標(biāo)本，需要富集病毒RNA，即標(biāo)本加0.3%SDS,RNAsin抑制劑和5'端 Oligo d(A)標(biāo)記的短序列(EV5，-NTR非編碼序列5'-aag agt cta ttg age tag tta-3，和 Protein3D序列5，-gtg tac ttg gtg gaa tgc cct cag gct-3，小段保守區(qū)反意義鏈做富集 Oligo)，于10ml生理鹽水中稍稍混勻，沉一會兒，棄固體殘渣，上清于一新15ml 離心管中，加入適量Oligod(T)交聯(lián)的纖維素凝膠顆粒，生理鹽水洗滌凝膠顆粒 一次，加2-5ial顆粒進(jìn)行雜交-耐熱連接酶反應(yīng)。
待測樣本(血液直接加樣) l-2pl 帶首尾報告基因DNA 1^1 10xTaq連接酶緩沖液 2^1 Taq連接酶(2x稀釋) 1^1 dH20_
進(jìn)行10-20循環(huán)的95°01分鐘和52°05分鐘。循環(huán)數(shù)依靈敏范圍需要而 定。反應(yīng)完成后立即置-20'C冷藏待用。耐熱連接酶熱變性95"C時加入或釆用熱 啟動連接酶可進(jìn)一步減少非特異性。
(四)環(huán)狀報告基因反向PCR:
合成反向PCR引物釆用報告基因DNA正中間的序列(即報告基因LFY片
段中間黑體標(biāo)示的序列)設(shè)計合成反向PCR引物。
5,端反向引物F: 5'-CAC TGT TAC GCT CTC CAC TGC C-3， 3 ，端反向引物R: 5 ，-G AAC GTA GTG TCG CAT TTT AG-3 ，
雜交連接酶反應(yīng)液 2^1 5，端反向引物F 1^1 3，端反向引物R 1^1 10mMdNTP10xTaq buffer 5|il Taq polymerase 1 |ol
dH2Q_12|4
50nl
首先94。C變性5分鐘，然后20-30個循環(huán)，94°C 30秒，52°C 30秒，72°C 35秒。25個循環(huán)后72'C10分鐘。
(五)PCR產(chǎn)物分析
用1.5-2.5%瓊酯糖凝膠agarose電泳分析。三種360bp, 300bp和200bp大 小PCR條帶，僅出現(xiàn)300bp條帶指示總的腸道病毒感染，300bp+200bp條帶為 EV71型感染，300bp+360bp條帶為CoxA16型感染。
取兩例疑似手足口病病人腸道分泌物樣本，分別抽提RNA,按照上述檢測 樣本腸道病毒，結(jié)果如圖2所示M電泳道DNA標(biāo)準(zhǔn)品；l.電泳道陽性對 照，共有360bp， 300bp ， 200bp三條帶，2.電泳道空白陰性對照；3.樣品道 產(chǎn)生300bp主帶，同時出現(xiàn)200bp條帶，說明其為EV71型腸道病毒陽性；4. 樣品道僅一條300bp主條帶，說明其為EV71、 CoxA16以外其它型腸道病毒
;i、列說明
SEQ ID NO.l為用于第一套Reportl共同報告基因序列，SEQ ID N0.2~5依次為引物 pI/EVFl 、pI/EVF、pI/EVRl和pI/EVR, SEQ ID N0.6&7為引物I/EVF和I/EVR, SEQ ID N0.8 l 1 依次為引物pI71aFl 、 pI71aF、 pI71aRl和pI71aR， SEQ ID NO,12 14依次為引物I71aF、 I71aF' 和I71aR， SEQ ID N0.15~18依次為引物pI71bFl、 pI71bF、 pI71bRl和pI71bR, SEQ ID NO,19~21依次為引物I71bF 、 nibF' 和I71bR， SEQ ID N0.22 25依次為引物pIA16Fl 、 pIA16F、 pIA16Rl和pIA16R， SEQ ID N0.26&27為引物IA16F和IA16F， SEQ ID N0.28為 用于第二套ReportII共同報告基因序列，SEQIDN0.29 32依次為引物pII/EVFl、 pII/EVF、 pII/EVRl和pII/EVR, SEQ ID N0.33&34為引物II/EVF和II/EVR、 SEQ ID N0.35&36為擴(kuò) 增報告基因的引物。序列表
<110>北京泰格瑞分子檢驗有限公司 〈120〉鏈置換聚合酶鏈反應(yīng) <130>
〈160〉 36
<170> Patentln version 3. 5
〈210〉 1
〈211> 321
<212〉 腿
<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 1
ccacttgtacgaacaatgccgtgagttccttcttcaggtcctaaagaccg60
tgccccaccaaggtgacg犯ccaagtattc鄉(xiāng)t3CgCg3agaaatcagg120
agcgagtta_cataaacaagcct肌犯tgcgacactacgttcactgttacgctctccactg180
ccta^cg33gadget tcsa_atgctctcagaagagcgtttaaagaacgcggtg,acgt240
tggctcatggegtcaggettgttacaagccacttgtgaacatcgcttgtcgtC3tggCtg300
gccgtcttta3321
<210〉 2
<211〉 37
<212〉 腿 <213〉人工序列
<400〉 2
ggagcacata cccttcaggt ccagac33tt gctsaeig 37
<210〉 3
〈211〉 38
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
<400〉 3
cgggatccaa tcctaactgc ggagcacata cccttcag 38
〈210〉 4
<211> 38
<212〉 DNA 〈213>人工序列
<400> 4
caggggccgg aggactacgt tcac肌gtgg cttgtssc 38
〈210〉 5
<211> 35
〈212〉 DNA <213>人工序列cggaattxag ccgcattxag gggccggagg actac
<210> 6 〈211〉 24 <212> 腿 〈213〉人工序列 <400> 6
aatccyaact gcggagcaca tacc
<210> 7 <211> 24 <212〉 DNA 〈213〉人工序列 <400> 7
agccgcattc aggggccgga ggac
<210> 8 <211〉 39 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400> 8
tttgttgcgt gcactcccac gaaccaagta ttcaggtac
<210〉 9 <211> 40 <212〉 DNA <213>人工序列 〈400〉 9
cgggatccgc agagttcact tttgttgcgt gcactcccac
<210〉 10 <211> 36 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400> 10
gaatagctcc acctttctcg cgttctttaa acgctc
〈210〉 11 <211> 36 〈212〉 DNA <213>人工序列 <400> 11
cggaattcca tgtaggtgaa tagctccacc tttctc
<210〉 12<211>37
<212>腿
<213>人工序列
<220>
<221>misc—feature
<222>(5),, (5)
<223>n二〃t〃 or 〃c〃
<220>
<221>misc_feature
<222>(23)..咖
<223〉n二〃t〃 or 〃a_〃
<400〉12
ttgangcaga gttcactttt gtngcgtgca ctcccac
〈210〉 13
<211> 37
<212> DNA <213>人工序列 <220>
<221〉 misc_feature
<222〉 (17).. (17)
<223> n=〃t〃 or "c〃
<400〉 13
ttgacgcaga gttcacnttt gtcgcgtgca ctcccac
<210〉14
〈211〉25
<212>DNA
<213〉人工序列
<220>
〈221〉raise—feature
<222〉(8)…(8)
<223>n二〃g〃 or 〃a〃
<400〉14
agcgcatnta ggtgaatagc tccac
<210> 15 <211〉 39 〈212〉 DNA 〈213>人工序列 〈400〉 15
tttgttgcgt gcactcccac gaaccaagta ttcaggtac 39
<210〉 16 <211〉 40 <212> 醒<213>人工序列 <400> 16
cgggatccgc agaattcact tttgttgcgt gcactcccac
<210〉 17 <211> 36 <212〉 腿 <213>人工序列 〈柳> 17
gaacagctcc acctttctcg cgttctttaa acgctc 36
<210> 18 <211> 36 <212〉 薩 <213> 人工序列 <400> 18
cgggatccca tgtaggtgaa cagctxcacc "tt"tctc 36
<210〉19
<211>31
<212>DNA
〈213>人工序列
〈220〉
〈221〉misc_feature
〈222〉(5)…(5)
<223>n二〃c〃 or 〃t〃
<220〉
<221>misc—feature
<222>(8)…(8)
〈223〉n=V or 〃g〃
<400>19
ttgangcnga attcactttt gttgcgtgca c
<210> 20
<211〉 37
212〉 廳
<213〉 人工序列
<220〉
<221〉 misc_feature <222> (5).. (5) 〈223〉 n="c〃 or 〃t〃 <400> 20
ttgangcaga gttcaccttt gttgcgtgca ctcccac
〈210〉 21〈211〉 25
<212> 腿 〈213〉人工序列 <220>
<221> misc—feature
〈222〉 (2).. (2)
<223> n=〃g〃 or 〃a〃
<400> 21
ancgcatgta ggtgsacsgc tccsc
<210〉 22
〈211> 35
<212〉 DNA <213>人工序列
<400> 22
atgtcaccag ccagtccact tgtacgaaca atgcc
〈210> 23
<211〉 36
<212〉 DNA <213〉人工序列
<400> 23
cgggatccgt ccccttcatg tcaccagcca gtccac
〈210〉 24
〈211〉 33
<212〉 DNA <213>人工序列
<400> 24
ttgagctggg tcttaaagac ggcgtctata tcc
〈210> 25
<211〉 35
<212> DNA <213〉人工序列
<400> 25
cggaattctg acacttgagc tggtgggtct taaag
<210> 26
<211> 34
<212> DNA 〈213〉人工序列 <220>
<221〉 raise—feature 〈222〉 (3). ■ (3)
<223〉 n=〃c〃 or 〃a〃
27<220>
<221> misc_feature <222〉 (15),,(15) <223> n=〃a〃 or 〃t〃 〈400〉 26
gtncccttca tgtcnccagc cagtccactt gtac 34
<210〉27
<211〉31
<212>鵬
〈213〉人工序列<220>
〈221>misc一—feature
<222>(10)..(10)
<223>n二"a/''or 〃t〃
<220〉
<221>niisc——f6atur6
<222〉(13)..(13)
<223>n二〃t"or 〃c〃
<400>27
tgacacttgn gcnggtgggt cttaaagacg g 31
<210〉 28 〈211> 250 <212〉 DNA
<213〉 擬南芥(Arabidopsis thaliana) <400> 28
gicaccgc卿cggctgcttt tgggatgcga cttggtggtt tag恥ggact Eittcggtccg 60 tacggtatac gtttctacac ggcggcgaag atagcggagt t鄉(xiāng)ttttac ggcgagcacg 120 cttgtgggta tgaaggacga ggagcttgaa gagatgatga atagtctctc tcatatcttt 180 cgttgggagc ttcttgttgg tgaacggtac ggtatcaaag ctgccgttag agctgaacgg 240 agacgattgc 250
〈210〉 29 〈211〉 37 <212〉 DNA <213>人工序列 <400> 29
attgaacctg tatgcacacc gcagacggct gcttttg 37
<210> 30 <211〉 34 <212> DNA <213>人工序列 <400〉 30
cgggatccca ccgtattgaa cctgtatgca cacc 34<210> 31 <211〉 36 <212> 薩 〈213>人工序列 <400> 31
catgtagtta ttcatgcaat cgtctccgtt cagctc 36
〈210〉 32
〈211〉 35
〈212〉 DNA <213〉人工序列
<400〉 32
cggaattcga actgcatgta gttattcatg caatc
<210> 33
<211〉 25
<212〉 DNA <213〉人工序列
<400〉 33
35
gcaaacaccg tattgaacct gtatg
<210〉 34 <211> 26 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400〉 34
tcttgaactg catgtagtta ttcatg
<210〉 35 <211> 22 <212〉 DNA <213>人工序列 <400〉 35
cactgttacg ctctccactg cc
<210〉 36 <211> 21 <212> DNA <213〉人工序列 <400〉 36
gaacgtagtg tcgcatttta g
權(quán)利要求
1“鏈置換聚合酶鏈反應(yīng)”，其特征是將靶分子DNA和/或RNA鏈置換成與靶分子不同的報告基因鏈，再擴(kuò)增報告基因鏈間接指示靶分子。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的"鏈置換聚合酶鏈反應(yīng)"，鏈置換特征在于以乾分子DNA鏈和/或RNA鏈上的 一段或多段預(yù)選序列作為乾序列與 一種或多種報告基因鏈的首尾預(yù)加探針雜交，使報告基因鏈的首尾預(yù)加探針的末端相鄰，用連接酶連接，使報告基因鏈成環(huán)，然后反方向PCR擴(kuò)增將待測乾分子直接擴(kuò)增轉(zhuǎn)換成包括一套以上的報告基因環(huán)，如果沒有特異性待測基因幫助，報告基因不能成環(huán)，也就不能反向PCR擴(kuò)增。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述"鏈置換聚合酶鏈反應(yīng)"，其適用于PCR分子檢測應(yīng)用領(lǐng)域，包括PCR及產(chǎn)物凝膠電泳檢測、實時熒光PCR定量檢測，PCR產(chǎn)物生物芯片分析、分子組化和分子病理原位PCR。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的"鏈置換聚合酶鏈反應(yīng)"，所述雙探針為待測耙DNA鏈和/或RNA鏈通過預(yù)選的兩小段保守序列或特異序列作為探針互補序列，所述雙探針長度為20-200base，單個探針長度為10-100base。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的"鏈置換聚合酶鏈反應(yīng)"，所述報告基因鏈指與靶分子無關(guān)的、或種系不同的核酸單鏈或有效單鏈，其首尾分別預(yù)加上靶分子的兩相鄰的小段保守序列或特異序列互補的探針，所述報告基因長度為80-1000
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的"鏈置換聚合酶鏈反應(yīng)"，所述鏈置換耐熱連接酶反應(yīng)指帶末端探針的報告基因首尾與待測靶基因模板變性后雜交，連接酶或耐熱連接酶連接報告基因首尾成環(huán)，95。C變性，15。C-70'C復(fù)性雜交，連接進(jìn)行熱循環(huán)，所述循環(huán)次數(shù)為1-50次。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的"鏈置換聚合酶鏈反應(yīng)"，所述置換耐熱連接酶反應(yīng)的連接酶指DNA連接酶或耐熱連接酶Taq DNAligase。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的"鏈置換聚合酶鏈反應(yīng)"，所述報告基因環(huán)的反向PCR擴(kuò)增的是無關(guān)的報告基因序列和靶分子預(yù)選的小段保守序列或特異序列互補的探針序列，所述報告基因環(huán)反方向PCR為1至多重PCR。
9. 一種DNA或RNA單鏈，包括報告基因，在所述報告基因首尾兩端具有 探針，該探針能夠與靶分子DNA或RNA鏈雜交，并且使得報告基因首尾兩端 探針的末端相鄰。
10. —種試劑盒，其包括權(quán)利要求9所述的DNA或RNA單鏈、Taq連 接酶及其緩沖液、10mMdNTPs、 Taq聚合酶及其緩沖液、反向引物F/R和凝膠 電泳試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種“鏈置換聚合酶鏈反應(yīng)”，其特征在于將待測靶基因鏈置換成帶探針的序列不同的報告基因鏈間接擴(kuò)增，所述探針序列為選擇靶基因相鄰的兩小段保守或特異序列作為雙探針的互補序列，所述序列不同的報告基因鏈指與靶基因鏈同源最小，或種系較遠(yuǎn)的基因序列，其首尾加上預(yù)設(shè)的雙探針序列作為線性帶探針報告基因。待測靶基因與報告基因預(yù)設(shè)的首尾探針序列互補雜交，從而線性報告基因首尾靠近銜接，雜交體單鏈缺口被連接酶連接，靶鏈置換為報告基因環(huán)，反向PCR擴(kuò)增報告基因環(huán)。通過監(jiān)測反向PCR擴(kuò)增的不同大小(兩端)或帶不同編碼的報告基因，就可間接指示多重靶分子。一套以上的報告基因可以輪換使用。
文檔編號C12Q1/68GK101638684SQ20081011760
公開日2010年2月3日 申請日期2008年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月1日
發(fā)明者輝 張, 洪 江, 江必勝 申請人:北京泰格瑞分子檢驗有限公司