專利名稱：一種中空多聚糖微球固定化酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中空多聚糖微球固定化酶及其制備方法。
背景技術(shù)：
酶是一種在許多領(lǐng)域都有重要應(yīng)用價(jià)值的生物催化劑，具有催化速率高、催化 條件溫和、能耗低以及不產(chǎn)生污染等優(yōu)點(diǎn)。傳統(tǒng)的游離酶存在一些缺點(diǎn)，如本身結(jié) 構(gòu)易受外界環(huán)境影響出現(xiàn)失活現(xiàn)象；使用后分離回收困難，難以實(shí)現(xiàn)連續(xù)利用。酶 的固定化技術(shù)可以有效地解決這些問題，不僅保留了酶的催化特性，提高了酶的貯 存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性，同時(shí)還可以實(shí)現(xiàn)酶的回收和連續(xù)利用，從而減低了生產(chǎn)中 酶制劑的投入成本，并且簡化了后續(xù)的產(chǎn)品提純工藝。微米級的中空球形結(jié)構(gòu)，因 其極高的比表面積和可容納大量客體分子的中空結(jié)構(gòu)，在酶固定化領(lǐng)域具有廣闊的 應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種中空多聚糖微球固定化酶及其制備方法。 本發(fā)明提供的中空多聚糖微球固定化酶，包括酶和載體，所述載體是中空多聚 糖微球；所述中空多聚糖微球按照如下方法制備在恒溫條件下，將酵母在液體中 進(jìn)行碳化，得到中空多聚糖微球；所述恒溫的溫度選自150-24(TC之間的任一溫度。 其中，所述酶具體可為水解酶，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等、過 氧化物酶、脫氫酶、氧化酶或漆酶等。中空多聚糖微球的制備中所述酵母在液體中 的濃度為10-200g/L。所述恒溫的時(shí)間為10-24小時(shí)。所述液體可以為水，也可以 是水溶液，所述水溶液的溶質(zhì)選自如下10種化合物中的至少一種鹽酸、硫酸、 硝酸、醋酸、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鉀、乙醇、乙醛或戊二醛，所述水溶液中溶質(zhì) 的終濃度可為0. 01-0. lmol/L。所述酵母為球形或橢球形，酵母可以是死的，也可 以是活的。當(dāng)所述液體為水溶液時(shí)，不同的溶質(zhì)，制備出的中空多聚糖微球可以有 不同的形狀，如球形或蘋果形或壇子形，還可以是球壁完整的中空微球或球壁上有 一個(gè)孔的中空微球。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種中空多聚糖微球固定化酶的制備方法。 本發(fā)明所提供的中空多聚糖微球固定化酶的制備方法，是對中空多聚糖微球的表面進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾，在中空多聚糖微球表面引入大量的氨基和/或環(huán)氧基，然
后利用氨基和/或環(huán)氧基與酶之間的化學(xué)鍵合實(shí)現(xiàn)酶的固定化。該方法有兩種，其中一種方法具體可包括如下步驟
1) 在堿性條件下，將所述中空多聚糖微球用環(huán)氧氯丙烷水溶液處理，使所述中空多聚糖微球表面帶有環(huán)氧基；
2) 將步驟1)得到的中空多聚糖微球與所述酶溶液混合，使所述酶與所述中空
多聚糖微球形成固定化酶。
另一種方法具體可包括如下步驟
1) 在堿性條件下，將所述中空多聚糖微球用環(huán)氧氯丙垸水溶液處理，使所述中空多聚糖微球表面帶有環(huán)氧基；
2) 將步驟1)得到的中空多聚糖微球用氨水處理，使所述中空多聚糖微球表面帶有氨基；
3) 將步驟2)中得到的中空多聚糖微球用戊二醛水溶液處理；
4) 將步驟3)得到的中空多聚糖微球與所述酶溶液混合，使所述酶與所述中空多聚糖微球結(jié)合形成固定化酶。
其中，所述環(huán)氧氯丙垸水溶液的體積百分含量為1-50%;所述氨水的濃度為0. 0卜2. 0mol/L;所述戊二醛水溶液的體積百分含量為0. 1-20%。
本發(fā)明的中空多聚糖微球固定化酶的酶蛋白負(fù)載量高，酶活性高，酶的穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性強(qiáng)。
本發(fā)明的中空多聚糖微球固定化酶的制備方法是以酵母碳化得到的中空多聚糖微球?yàn)槊傅墓潭ɑd體。其中，制備載體的原料來源廣泛，載體的制備、表面修飾和酶的固定化技術(shù)簡單易行，且載體具有高比表面積、大內(nèi)部空間、豐富的表面官能團(tuán)以及良好的生物相容性等特點(diǎn)。本發(fā)明的中空多聚糖微球固定化酶的制備方法適合各種水解酶。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l、中空多聚糖微球固定化酶
a)中空多聚糖微球的制備
稱橢球形啤酒酵母(Sacc/2aram^^"wWw'fle) 5 g，分散于100ml去離子水中，制成酵母懸浮液，然后將酵母懸浮液轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜中，置于恒溫箱中在18(TC下加熱18h，反應(yīng)結(jié)束后，收集沉淀，將得到的沉淀用去離子水洗滌，然后在2(TC下干燥24h。干燥后，即得到中空多聚糖微球。用掃描電鏡觀察中空多聚糖微球，中空
多聚糖微球?yàn)橹睆?-3微米的球形。
b)中空多聚糖微球固定化酶的制備
取步驟a)球形中空多聚糖微球5g，分散于100mL 20%環(huán)氧氯丙垸的堿性溶液中，振蕩12小時(shí)后用去離子水徹底洗凈殘留的環(huán)氧氯丙烷；取去離子水清洗后的中空多聚微球O. lg，均勻分散到4mL0.06。/。的e—葡萄糖苷酶溶液中，28'C振蕩10小時(shí)，離心分離沉淀，沉淀用醋酸緩沖液清洗，去除中空多聚糖微球上非共價(jià)結(jié)合的酶蛋白，獲得中空多聚糖微球固定化酶。
以水楊素為底物測定中空多聚糖微球固定化酶的酶活力，酶活力的測定方法如下將25mg中空多聚糖微球固定化酶和lmL經(jīng)過預(yù)熱的5g/100ml的水楊素溶液(由pH4.8醋酸緩沖液配制)混合，振蕩條件下5(TC水浴保溫30分鐘后迅速離心，向分離得的上清液中加入lmLDNS (3， 5-二硝基水楊酸)試劑，煮沸5分鐘，冷至室溫后在540nm下測定其吸光度。1個(gè)單位酶活(IU)指每分鐘水解得到1微摩爾葡萄糖所需的酶量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
為了測定中空多聚糖微球固定化酶的穩(wěn)定性，連續(xù)使用中空多聚糖微球固定化酶300小時(shí)，每隔一定時(shí)間回收中空多聚糖微球固定化酶，測定其酶活，酶活測定方法同上。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
酶活力和酶的穩(wěn)定性測定的結(jié)果表明，中空多聚糖微球固定化酶的酶活力為4. 1U/g載體，中空多聚糖微球固定化酶連續(xù)使用300小時(shí)后酶活力保留72. 4%，說明中空多聚糖微球固定化酶連續(xù)使用300小時(shí)酶活力未出現(xiàn)明顯下降。
實(shí)施例2、中空多聚糖微球固定化酶
a) 制備中空多聚糖微球
稱橢球形啤酒酵母(5"acc力aro/^ces cerew'si'ae) 5 g，分散于100ml去離子水中，制成酵母懸浮液，然后將酵母懸浮液轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜中，置于恒溫箱中在180"C下加熱18h，反應(yīng)結(jié)束后，收集沉淀，將得到的沉淀用去離子水洗滌，然后在20'C下干燥24h。干燥后，即得到中空多聚糖微球。用掃描電鏡觀察中空多聚糖微球，中空多聚糖微球?yàn)橹睆?-3微米的規(guī)整的球形。
b) 制備中空多聚糖微球固定化酶
取步驟a)的球形中空多聚糖微球5g，分散于100mL 1%環(huán)氧氯丙垸的堿性溶液中，振蕩12小時(shí)后，用去離子水徹底洗凈殘留的環(huán)氧氯丙烷；將洗后的中空多聚糖微球用0.01M氨水處理9小時(shí)，處理后離心分離沉淀，再用O. 1%戊二醛處理沉淀3小時(shí)，得到的中空微球用去離子水洗凈后取0. lg，均勻分散到4mL 0. 06%的e—葡萄糖苷酶溶液中，28i:振蕩10小時(shí)，離心分離沉淀，沉淀用醋酸緩沖液清洗，洗去中空多聚糖微球上非共價(jià)結(jié)合的酶蛋白，獲得中空多聚糖微球固定化酶。
以水楊素為底物測定中空多聚糖微球固定化酶的酶活力，酶活力和酶的穩(wěn)定性的測定方法同實(shí)施例1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
酶活力和酶的穩(wěn)定性的測定結(jié)果表明，中空多聚糖微球固定化酶的酶活力為8. 1U/g載體，中空多聚糖微球固定化酶連續(xù)使用300小時(shí)后酶活力保留77. 5%，說明中空多聚糖微球固定化酶連續(xù)使用300小時(shí)酶活力未出現(xiàn)明顯下降。
實(shí)施例3、中空多聚糖微球固定化酶
a) 中空多聚糖微球的制備
稱酵母菌橢球形啤酒酵母(5"acc力ar咖yces cerew'w'3e) 5g，分散于100ml去離子水中，制成酵母懸浮液，然后向酵母懸浮液中加入稀鹽酸，使其終濃度為O. 1mol/L，在將上述懸浮液轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜中，置于恒溫箱中在15(TC下加熱24h，反應(yīng)結(jié)束后，收集沉淀，將得到的沉淀用去離子水洗滌，然后在2(TC下干燥24 h。干燥后，即得到中空多聚糖微球。用掃描電鏡觀察中空多聚糖微球，中空多聚糖微球?yàn)橹睆?-3微米的壇子狀。
b) 中空多聚糖微球固定化酶的制備
取步驟a)的壇子狀中空多聚糖微球5g，分散于100mL50X環(huán)氧氯丙烷的堿性溶液中，振蕩12小時(shí)后用去離子水徹底洗凈殘留的環(huán)氧氯丙烷；將洗后的中空多聚糖微球用2M氨水處理9小時(shí)，處理后離心分離沉淀，再用20%戊二醛處理沉淀3小時(shí)，得到的中空微球用去離子水洗凈后，取O. lg，均勻分散到4raL 0.06%的0一葡萄糖苷酶溶液中，28C振蕩10小時(shí)，離心分離沉淀，沉淀用醋酸緩沖液清洗，洗去中空多聚糖微球上非共價(jià)結(jié)合的酶蛋白，獲得中空多聚糖微球固定化酶。
以水楊素為底物測定中空多聚糖微球固定化酶的酶活力，酶活力和酶的穩(wěn)定性的測定方法同實(shí)施例1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
酶活力和酶的穩(wěn)定性的測定結(jié)果表明，中空多聚糖微球固定化酶的酶活力為10. 5U/g載體，中空多聚糖微球固定化酶連續(xù)使用300小時(shí)后酶活力保留80. 7%，說明中空多聚糖微球固定化酶連續(xù)使用300小時(shí)酶活力未出現(xiàn)明顯下降。
實(shí)施例4、中空多聚糖微球固定化酶a) 中空多聚糖微球的制備
稱酵母菌橢球形啤酒酵母(5"3cc力a^ro/z7/cescarew'5^3e) 5g，分散于100ml去離子水中，制成酵母懸浮液，然后向酵母懸浮液中加入戊二醛，使其終濃度為0.05mol/L，在將上述懸浮液轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜中，置于恒溫箱中在240。C下加熱10h，反應(yīng)結(jié)束后，收集沉淀，將得到的沉淀用去離子水洗滌，然后在2(TC下干燥24 h。干燥后即得到中空多聚糖微球。用掃描電鏡觀察中空多聚糖微球，中空多聚糖微球?yàn)橹睆?-5微米的蘋果形。
b) 制備中空多聚糖微球固定化酶
取步驟a)的蘋果形中空多聚糖微球5g，分散于100mL20X環(huán)氧氯丙垸的堿性溶液中，振蕩12小時(shí)后用去離子水徹底洗凈殘留的環(huán)氧氯丙烷；將洗后的中空多聚糖微球用0. 5M氨水處理9小時(shí)，處理后離心分離沉淀，再用1%戊二醛處理沉淀3小時(shí)，得到的中空微球用去離子水洗凈后，取O. lg，均勻分散到4mL 0.06%的0一葡萄糖苷酶溶液中，28t:振蕩10小時(shí)，離心分離沉淀，沉淀用醋酸緩沖液清洗，洗去中空多聚糖微球上非共價(jià)結(jié)合的酶蛋白，獲得中空多聚糖微球固定化酶。
以水楊素為底物測定中空多聚糖微球固定化酶的酶活力，酶活力和酶的穩(wěn)定性的測定方法同實(shí)施例1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
酶活力和酶的穩(wěn)定性的測定結(jié)果表明，中空多聚糖微球固定化酶的酶活力為11. 4U/g載體，中空多聚糖微球固定化酶連續(xù)使用300小時(shí)后酶活力保留83. 5%，說明中空多聚糖微球固定化酶連續(xù)使用300小時(shí)酶活力未出現(xiàn)明顯下降。
權(quán)利要求
1、一種固定化酶，包括酶和用于固定所述酶的載體，其特征在于所述載體是中空多聚糖微球；所述中空多聚糖微球按照如下方法制備在恒溫條件下，將酵母在液體中進(jìn)行碳化，得到中空多聚糖微球；所述恒溫的溫度選自150-240℃之間的任一溫度。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化酶，其特征在于所述酶為水解酶。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的固定化酶，其特征在于所述酵母在液體中的濃度為10-200g/L。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的固定化酶，其特征在于所述恒溫的時(shí)間為10-24小時(shí)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述酵母為球形或橢球形；所述酵母為死的或活的。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的固定化酶，其特征在于所述中空多聚糖微球?yàn)榍蛐位蛱O果形或壇子形；所述中空多聚糖微球?yàn)榍虮谕暾闹锌瘴⑶蚧蚯虮谏嫌幸粋€(gè)孔的中空微球。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一所述的固定化酶，其特征在于所述液體為水或水溶液；所述水溶液中的溶質(zhì)選自下述10種物質(zhì)中的至少一種鹽酸、硫酸、硝酸、醋酸、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鉀、乙醇、乙醛和戊二醛；所述水溶液中溶質(zhì)的終濃度為0. Ol-O. lmol/L。
8、 權(quán)利要求1至7中任一所述的固定化酶的制備方法，包括如下步驟1) 在堿性條件下，將所述載體用環(huán)氧氯丙垸水溶液處理，使所述載體表面帶有環(huán)氧基；2) 將步驟l)得到的載體與所述酶溶液混合，使所述酶與所述載體形成固定化酶。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述方法中，在步驟1)和步驟2)間還包括如下步驟a) 將步驟l)得到的載體用氨水進(jìn)行處理，使其表面帶有氨基；b) 將步驟a)中得到的載體用戊二醛水溶液處理。
10、 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于所述環(huán)氧氯丙垸水溶液的體體積百分比濃度為1-50%;所述氨水的濃度為0. 01-2. 0mol/L;所述戊二醛水溶液的體積百分比濃度為O. 1-20%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種中空多聚糖微球固定化酶及其制備方法。該固定化酶，包括酶和載體，所述載體是中空多聚糖微球；所述中空多聚糖微球按照如下方法制備在恒溫條件下，將酵母在液體中進(jìn)行碳化，得到中空多聚糖微球；所述恒溫的溫度選自150-240℃之間的任一溫度。本發(fā)明還公開了該中空多聚糖微球固定化酶的制備方法。本發(fā)明的中空多聚糖微球固定化酶的制備方法中制備載體的原料來源廣泛，載體的制備、表面修飾和酶的固定化技術(shù)簡單易行，且載體具有高比表面積、大內(nèi)部空間、豐富的表面官能團(tuán)、以及良好的生物相容性等特點(diǎn)。
文檔編號C12N11/00GK101643727SQ20081011776
公開日2010年2月10日 申請日期2008年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月5日
發(fā)明者倪德志, 周克斌, 森 楊, 雷 王 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)