專利名稱：：體外檢測遺傳性耳聾相關(guān)縫隙連接蛋白26基因gjb2突變的方法及檢測用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體是涉及遺傳性耳聾相關(guān)縫隙連接蛋白26基因GJB2突變的檢測方法。本發(fā)明還涉及根據(jù)該方法在體外檢測遺傳性耳聾相關(guān)縫隙連接蛋白26基因GJB2突變的試劑盒。
背景技術(shù)：
：耳聾是臨床上最常見的遺傳病之一，是導致言語交流障礙最常見的疾病。據(jù)各國統(tǒng)計，有1/20001/1000的兒童出生時為極重度耳聾；同時，一半以上的兒童期耳聾是由于遺傳因素造成的(MarazitaML,等，AmJMedGenet.1993，46:486491;KalatzisV等，HumMolGenet.1998,7:1589-1597;MortonCC，HumMolGenet.2002，11:1229-1240)。遺傳性耳聾中有70%為非綜合征型耳聾(nonsyndromichearingimpairment,NSffl)，其余30%為綜合征型耳聾(syndromichearingimpairment,SHI)。大約75%85%的NSHI表現(xiàn)為常染色體隱性遺傳模式，15%24%為常染色體顯性遺傳模式，其余1%2%為乂連鎖遺傳模式。GJB2基因突變與遺傳性非綜合征型耳聾密切相關(guān)，包括常染色體顯性遺傳性聾DFNA3和常染色體隱性遺傳性聾DFNB1，是遺傳性耳聾最常見的原因(KelleyPM等,AmJHumGenet.19訴，62:792-799)。此外，GJB2基因還與部分綜合征型耳聾有關(guān)(RichardG等，HumGenet,1998,103:393-399)。GJB2基因編碼的縫隙連接蛋白26屬于縫隙連接蛋白基因家族，與相鄰細胞的縫隙連接蛋白組成一個完整的縫隙連接通道，這些通道在信息傳導和物質(zhì)交換中起重要作用，是完成電解質(zhì)、第二信使和代謝產(chǎn)物的細胞間轉(zhuǎn)換的重要通道。當毛細胞受到外界刺激后，鉀離子經(jīng)內(nèi)耳毛細胞循環(huán)回流進入耳蝸內(nèi)淋巴液，縫隙連接蛋白通道在此過程中具有調(diào)控作用，縫隙連接蛋白26在人類的耳蝸毛細胞中高表達，因此GJB2基因突變與耳聾密切相關(guān)。GJB2基因1993年被克隆，定位于13qll-12，DNA全長6710bp(ENSG00000165474)，被一個內(nèi)含子分成一個非編碼的上游外顯子和一個較大的含有完整編碼序列的第二外顯子。編碼區(qū)為681bp，存在于第二外顯子。GJB2基因的篩查方法多種多樣，包括限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)、限制酶切指紋一單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(REF-SSCP)、聚合酶鏈反應-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)、變性梯度凝膠電泳法(DGGE)、變性髙效液相色譜分析(dHPLC)及直接測序等。直接測序(directsequencing,DS)是將PCR擴增產(chǎn)物進行測序反應后純化、變性，在測序儀上進行測序，利用軟件將測序結(jié)果與標準序列進行比對尋找突變，是突變鑒定的金標準。中國聾人群體中21.01%耳聾與GJB2基因有關(guān)，其中14.96%攜帶GJB2編碼區(qū)雙等位基因突變，可以明確為GJB2基因突變致聾，另外6.05%攜帶&舊2編碼區(qū)單等位基因突變，耳聾與GJB2基因突變有關(guān)，但還待尋找另外一個等位基因上的突變以確定耳聾病因(于飛等，中華醫(yī)學雜志，2007,87:2814-2819)。目前，對GJB2基因突變的檢測僅限于對編碼區(qū)即外顯子2的序列測定或針對單個常見突變位點的限制性內(nèi)切酶分析，此種檢測分析方法雖然可以檢測出GJB2基因是否突變，但僅僅限于對GJB2基因編碼區(qū)即外顯子2的序列測定或針對單個常見突變位點的限制性內(nèi)切酶分析，無法全面準確分析耳聾與GJB2基因突變之間的關(guān)系，也因此無法準確判定是否是遺傳性耳聾。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對目前檢測遺傳性耳聾相關(guān)縫隙連接蛋白26基因GJB2突變的方法所存在的缺點，提供一種準確、可靠、穩(wěn)定的覆蓋GJB2基因基礎(chǔ)啟動區(qū)、外顯子l及剪切區(qū)域和外顯子2及剪切區(qū)域的突變檢測方法。本發(fā)明的另一個目的是提供檢測遺傳性耳聾相關(guān)縫隙連接蛋白26基因GJB2突變的試劑盒。研究發(fā)現(xiàn)不但GJB2編碼區(qū)(外顯子2)基因突變是致聾原因，GJB2基因外顯子1與內(nèi)含子1的剪切區(qū)突變IVS1+1G>A也是致聾原因之一，尤其在攜帶GJB2編碼區(qū)即外顯子2單等位基因突變的個體，進行GJB2外顯子1的篩査，更有利于明確耳聾病因。此外，GJB2基因外顯子1上游基礎(chǔ)啟動區(qū)的突變也參與該基因致聾，因此，對GJB2基因基礎(chǔ)啟動區(qū)、外顯子1及剪切區(qū)域和外顯子2及剪切區(qū)域進行檢測是診斷遺傳性耳聾又一有力手段。本發(fā)明即提供一種體外檢測遺傳性耳聾相關(guān)縫隙連接蛋白26基因GJB2突變的方法，通過進行聚合酶鏈反應，對GJB2基因基礎(chǔ)啟動區(qū)、外顯子l、外顯子2及剪切區(qū)域進行完整擴增，然后進行DNA序列測定，檢測GJB2基因突變的存在。本發(fā)明的方法，在進行聚合酶鏈反應時，所設(shè)計的引物為擴增基礎(chǔ)啟動區(qū)、外顯子l及其剪切區(qū)域的正向引物Fl是GJB2基因的核苷酸414-445，其序列為序列表中的SEQIDNO:l;擴增基礎(chǔ)啟動區(qū)、外顯子l及其剪切區(qū)域的反向引物Rl是GJB2基因的核苷酸895-921，其序列為序列表中的SEQIDN0:2;擴增外顯子2及其剪切區(qū)域的正向引物F2是GJB2基因的核苷酸3860-3879，其序列為序列表中的SEQIDNO:3;擴增外顯子2及其剪切區(qū)域的反向引物R2是GJB2基因的核苷酸48004819，其序列為序列表中的SEQIDNO:4。本發(fā)明中的引物設(shè)計可以使用GenetoolLite程序(美國Biotools公司提供的軟件)協(xié)助設(shè)計兩對引物F1、R1和F2、R2。Fl、Rl擴增片段覆蓋GJB2基因基礎(chǔ)啟動區(qū)、外顯子1及其剪切區(qū)域，F(xiàn)2、R2擴增片段覆蓋GJB2基因外顯子2及其剪切區(qū)域。將得到的PCR擴增產(chǎn)物分別進行測序反應及其后的純化、變性，在測序儀上進行測序，利用軟件將測序結(jié)果與標準序列進行比對，檢測GJB2基因突變的存在。本發(fā)明還提供一種根據(jù)上述方法進行體外檢測GJB2基因突變的試劑盒或類似產(chǎn)品，其含有-(1)PCR擴增反應試劑包括dNTP、2xPCR緩沖液(擴增外顯子1專用)、10xPCR緩沖液(擴增外顯子2專用)、Mg++、三蒸水、T叫酶l(擴增外顯子1專用)、Taq酶2(擴增外顯子2專用)；(2)等比例混合的權(quán)利要求2所述的擴增GJB2基因基礎(chǔ)啟動區(qū)、外顯子l及其剪切區(qū)域的正向引物F1和擴增GJB2基因基礎(chǔ)啟動區(qū)、外顯子1及其剪切區(qū)域的反向引物R1，等比例混合的權(quán)利要求2所述的擴增GJB2基因外顯子2及其剪切區(qū)域的JH向引物F2和擴增外顯子2及其剪切區(qū)域的反向引物R2。本發(fā)明的試劑盒或類似產(chǎn)品，其中還包含提取血樣DNA的試劑；所述的提取血樣DNA的試劑可以為提取足根血DNA的溶液I，其主要成分為Chdex;或者為外周血DNA提取試劑盒。本發(fā)明的試劑盒或類似產(chǎn)品，其中還包含使用說明書。在本發(fā)明中，GJB2基因基礎(chǔ)啟動區(qū)、外顯子1及其剪切區(qū)域富含GC堿基，GC比例達到76.78%，PCR擴增困難，針對這一特點我們采用專門擴增高GC含量DNA序列的PCR緩沖液和Taq酶，并針對該序列特點制定專門的PCR反應條件以確保得到產(chǎn)量高、特異性強的PCR產(chǎn)物進行序列測定。F1R1擴增片段長508bp。F2R2擴增片段長960bp。通過對該兩片段進行序列測定，可以覆蓋迄今為止發(fā)現(xiàn)的全部GJB2基因致病突變。本發(fā)明人還根據(jù)本發(fā)明中設(shè)計的引物序列，通過人工合成(通過給定序列由自動化核酸合成儀合成)獲得引物，并與提取血樣DNA的試劑、PCR擴增反應試劑，包括dNTP、2xPCR緩沖液(擴增外顯子l專用)、10xPCR緩沖液(擴增外顯子2專用)、Mg++、三蒸水、Taq酶l(擴增外顯子l專用)、T叫酶2(擴增外顯子2專用)，以及使用說明書組合起來，提供了用于體外檢測遺傳性耳聾相關(guān)縫隙連接蛋白26基因GJB2突變的試劑盒，其主要功能在于將所有試劑集成在一個小盒內(nèi)，使得DNA提取、核酸片段擴增可以在試劑盒提供的試劑的基礎(chǔ)上順序完成。根據(jù)取血方式或被測樣本形式的不同，本發(fā)明的試劑盒有三種類型可供選用，三種類型中除了提取血樣DNA的試劑外，其余組分都相同。一型試劑盒提取血樣DNA的試劑為用作DNA裂解液的溶液1，其主要成分是Chelex(ABI公司產(chǎn)品)，適用于足跟血血片被測樣本;二型試劑盒提取血樣DNA的試劑為外周血DNA試劑盒(選用市售產(chǎn)品配套使用)，適用于外周血被測樣本；三型試劑盒不含提取血樣DNA的試劑，適用于直接提供DNA的被測樣本。用本發(fā)明的方法檢測遺傳性耳聾相關(guān)縫隙連接蛋白26基因GJB2突變的技術(shù)與現(xiàn)有技術(shù)檢測GJB2基因編碼區(qū)即外顯子2技術(shù)相比有以下優(yōu)點本發(fā)明的方法能完整覆蓋GJB2基因基礎(chǔ)啟動區(qū)、外顯子1和外顯子2及剪切區(qū)域的所有突變，能提高GJB2基因突變的檢出率和GJB2基因相關(guān)性遺傳性耳聾的診斷率，較單獨進行GJB2編碼區(qū)測序更全面、可靠，有利于遺傳性耳聾的診斷。圖l:實施例l中的家系系譜圖。圖2:2-24泳道為耳聾患者DNA樣本FlRl引物擴增的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，擴增片段508bp，其中包含GJB2基因基礎(chǔ)啟動區(qū)、外顯子1及其剪切區(qū)域；1泳道為空白對照；M為DNA分子量標記Marker。圖3:l-23泳道為耳聾患者DNA樣本F2R2引物擴增的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，擴增片段960bp，其中包含GJB2基因編碼區(qū)即外顯子2及其剪切區(qū)域；24泳道為空白對照；M為DNA分子量標記Marker。具體實施例方式實施例1常染色體隱性遺傳家系遺傳性耳聾相關(guān)縫隙連接蛋白26基因GJB2突變的檢測l.檢測樣本選擇以常染色體隱性遺傳為傳遞特征的耳聾家系1個，總?cè)藬?shù)為27人，其中耳聾患者共3人。受檢者中，耳聾患者為2人，從被檢個體提取外周全血DNA(袁慧軍等，中華耳鼻咽喉科雜志，1998，33(2):67-70;李為民等，臨床耳鼻咽喉科雜志，2001，15(增刊):53-58)，作為檢測樣本。家系的系譜圖見圖1。先證者，男，15歲，漢族，足月順產(chǎn)。l歲時發(fā)現(xiàn)耳聾，用藥史不詳。査體全身情況正常，鼓膜完整，顳骨CT檢査排除內(nèi)耳畸形。家庭情況父親有噪音接觸史；姐姐18歲，聽力稍差。2.引物設(shè)計根據(jù)己公開的GJB2基因序列(ENSG00000165474)使用GenetoolLite程序協(xié)助設(shè)計引物。擴增基礎(chǔ)啟動區(qū)、外顯子1及其剪切區(qū)域的正向引物F1是GJB2基因的核苷酸414-445，其序列為序列表中的SEQIDNO:l;擴增基礎(chǔ)啟動區(qū)、外顯子1及其剪切區(qū)域的反向引物Rl是GJB2基因的核苷酸895-921，其序列為序列表中的SEQIDN0:2;擴增外顯子2及其剪切區(qū)域的正向引物F2是GJB2基因的核苷酸3860-3879，其序列為序列表中的SEQIDNO:3;擴增外顯子2及其剪切區(qū)域的反向引物R2是GJB2基因的核苷酸48004819，其序列為序列表中的SEQIDNO:4。3.PCR擴增反應根據(jù)上述設(shè)計的引物序列SEQIDNO:l和SEQIDNO:2，通過人工合成(通過給定序列由自動化核酸合成儀合成)得到正向引物F1和反向引物R1，并以上述提取的被測樣本周邊血DNA為模板，進行PCR擴增反應。反應體系DNA(20ng/nl)3^11F(5pmol/nl)lR(5pmol/fi1)lnl2xBuffer15jal10xdNTP4.7filMg++終濃度1.5mmol/LTaql1.5U加三蒸水至30nl體積。反應條件94。C預變性5分鐘后，接著94。C變性30秒，60。C退火30秒，72°C延伸30秒，共進行30個循環(huán)，最后在72°0;下再延伸7分鐘。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查產(chǎn)物。Fl、R1進行PCR擴增后能夠獲得明亮清晰的略大于500bp的條帶(見圖2)。根據(jù)上述設(shè)計的引物序列SEQIDNO:3和SEQIDNO:4，通過人工合成(通過給定序列由自動化核酸合成儀合成)得到正向引物F2和反向引物R2，并以上述提取的被測樣本周邊血DNA為模板，進行PCR擴增反應反應體系DNA(20ng4U)3mu12F(5pmol/nl)2.5nl2R(5pmo,2.5^110xBuffer5^110xdNTP5|il終濃度1.5mmol/LTaq25U加三蒸水至50W體積。反應條件94。C預變性5分鐘后，接著94。C變性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸30秒，共進行32個循環(huán)，最后在72°C下再延伸7分鐘。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢査產(chǎn)物。F2、R2進行PCR擴增后能夠獲得明亮清晰的略大于960bp條帶(見圖3)。4.PCR產(chǎn)物的純化及序列測定(1)PCR產(chǎn)物純化1)在被測樣本的PCR擴增產(chǎn)物中加入0.1倍體積3MNaAc(PH-5.2);2)加入2.5倍體積無水乙醉；3)4'C放置20分鐘；4)4t:下5700rpm/min離心25min，棄上清；5)加入75%乙醇200^1，4r下5700rpm/min離心25min，棄上清；6)置于PCR儀上95X:烘干1分鐘(開蓋)，加入2(Hil雙蒸水溶解。(2)純化后PCR產(chǎn)物定量加入5plPCR產(chǎn)物和ln氾uffer混合物，經(jīng)凝膠電泳測定DNA含量后，將其稀釋成5ng/pl。(3)測序PCR反應純化并稀釋后的PCR擴增產(chǎn)物按下述條件擴增反應體系純化后PCR產(chǎn)物(5ng/pl)1Ml1F(5pmol/n喊1R(5pmol/nl)1.5pl5xBuffer1.5^12.5xBigdye0.5^1加三蒸水至l(HU體積。反應條件96°C預變性1分鐘后，接著96°C變性10秒，50°C退火5秒,60。C延伸4分鐘，共進行25個循環(huán)。(4)測序反應PCR產(chǎn)物純化1)在10jil的測序反應PCR產(chǎn)物中加入lnl125mMEDTA到管底；2)加入lnl3MNaAc(PH=5.2)到管底；3)加入25nl無水乙醇；4)4C放置20分鐘；5)4"下5700rpm/min離心25min，棄上清；6)加入75%乙醇200nl，反復混勻，4"C下5700rpm/min離心20min，棄上清；7)重復步驟(6);8)置于PCR儀上95r烘干l分鐘(開蓋)，加入甲酰胺13ul溶解；9)置于PCR儀95C變性5min，后迅速置于冰上5min后上樣，進行測序。(5)測序結(jié)果使用GenetoolLite軟件包與來自NCBI網(wǎng)站的人類GJB2基因標準序列(ENSG00000165474)進行比對，發(fā)現(xiàn)可疑的突變位點后用Chromas軟件讀取測序結(jié)果的峰圖文件，進行確認或排除。注在沒有測序儀的單位可以直接將PCR擴增產(chǎn)物送至測序公司進行測序，可省略整個第4歩即PCR產(chǎn)物的純化及序列測定。5.結(jié)果在對F2R2擴增的PCR產(chǎn)物的測序中發(fā)現(xiàn)，患者為35delG/299-300delAT復合突變，進一步對該例患者的家屬進行GJB2基因檢測(其姐及其他8名家屬因在外地，未能參加檢測)，發(fā)現(xiàn)35delG來自父系(其中5例家屬為35delG攜帶者)，299-300delAT來自母系(其中2例家屬為299-300ddAT攜帶者)。該先證者耳聾的病因可以明確為由GJB2基因突變導致的常染色體隱性遺傳性耳聾。實施例2不明原因感音神經(jīng)性耳聾散發(fā)病例遺傳性耳聾相關(guān)縫隙連接蛋白26基因GJB2突變的檢測1.檢測樣本選擇不明原因感音神經(jīng)性耳聾散發(fā)患者50人，從被檢個體提取外周全血DNA(袁慧軍等，中華耳鼻咽喉科雜志，1998，33(2):67-70;李為民等，臨床耳昇咽喉科雜志，2001，15(增刊):53-58)，作為檢測樣本。2.引物設(shè)計3.PCR擴增反應4.PCR產(chǎn)物的純化及序列測定同實施例1。5.結(jié)果:見表1。表l實施例2GJB2基因檢測結(jié)果基因型人數(shù)9G>A/IVS1+1G>A1235delC/257C>G1235delC/299delAT2235delC/widetype1235delC/235delC1299delAT/299delAT1176dell6/139G〉T1widetype/widetype42實施例3遺傳性耳聾相關(guān)縫隙連接蛋白26基因GJB2突變的一型試劑盒及其應用1.適用于足跟血片的一型試劑盒(100人份)包含以下組分(1)溶液I(主要成份為5o/。Chelex)25ml;(2)PCR擴增反應試劑，包括dNTP、2xPCR緩沖液(擴增外顯子1專用)、10xPCR緩沖液(擴增外顯子2專用)、Mg++、三蒸水、Taq酶l(擴增外顯子l專用)、T叫酶2(擴增外顯子2專用)；(3)等比例混合的權(quán)利要求2所述的擴增GJB2基因基礎(chǔ)啟動區(qū)、外顯子1及其剪切區(qū)域的正向引物F1和擴增GJB2基因基礎(chǔ)啟動區(qū)、外顯子1及其剪切區(qū)域的反向引物R1，等比例混合的擴增外顯子2及其剪切區(qū)域的正向引物F2和擴增外顯子2及其剪切區(qū)域的反向引物R2;(4)使用說明書。2.檢測對象選擇不明原因感音神經(jīng)性耳聾散發(fā)患者25人為受檢對象(與實施例2檢測對象不重疊)。3.檢測方法及結(jié)果按照本試劑盒的使用說明書，用溶液I(主要成份為5。/。Chelex)提取受檢者的足根血血片DNA，反應體系和反應條件同實施例l。檢測結(jié)果見表2。表2實施例3GJB2基因檢測結(jié)果基因型人數(shù)235delC/235delC4235delC/299delAT1widetype/widetype20實施例4遺傳性耳聾相關(guān)縫隙連接蛋白26基因GJB2突變的二型試劑盒及其應用選擇不明原因感音神經(jīng)性耳聾散發(fā)患者25人為受檢對象(與實施例2、3檢測對象不重疊)。除了受檢樣本為周邊血，以及試劑盒中的血樣DNA提取劑為市售的周邊血DNA提取試劑盒，并用該試劑盒提取周邊血DNA以外，試劑盒中其他組分和檢測方法與實施例3相同。檢測結(jié)果見表3。表3實施例4GJB2基因檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>綜上所述，本發(fā)明用于體外檢測遺傳性耳聾相關(guān)縫隙連接蛋白26基因GJB2的突變，具有良好的準確性。注本說明書中涉及的％除有說明外，均指得是重量百分比。以上所述的實施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行描述，并非對本發(fā)明的范圍進行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進，均應落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護范圍內(nèi)。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權(quán)利要求1、一種體外檢測遺傳性耳聾相關(guān)縫隙連接蛋白26基因GJB2突變的方法，其特征在于通過進行聚合酶鏈反應，對GJB2基因基礎(chǔ)啟動區(qū)、外顯子1、外顯子2及剪切區(qū)域進行完整擴增，然后進行DNA序列測定，檢測GJB2基因突變的存在。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在進行聚合酶鏈反應時，所設(shè)計的引物為擴增基礎(chǔ)啟動區(qū)、外顯子1及其剪切區(qū)域的正向引物F1是GJB2基因的核苷酸414^445,其序列為序列表中的SEQIDNO:l;擴增基礎(chǔ)啟動區(qū)、外顯子1及其剪切區(qū)域的反向引物Rl是GJB2基因的核苷酸895-921，其序列為序列表中的SEQIDNO:2;擴增外顯子2及其剪切區(qū)域的TH向引物F2是GJB2基因的核苷酸3860-3879，其序列為序列表中的SEQIDNO:3;擴增外顯子2及其剪切區(qū)域的反向引物R2是GJB2基因的核苷酸4800-4819，其序列為序列表屮的SEQIDNO:4。3、一種根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法進行體外檢測GJB2基因突變的試劑盒或類似產(chǎn)品，其特征在于含有(1)PCR擴增反應試劑包括dNTP、2xPCR緩沖液(擴增外顯子l專用)、10xPCR緩沖液(擴增外顯子2專用)、Mg++、三蒸水、T叫酶l(擴增外顯子1專用)、T叫酶2(擴增外顯子2專用)；(2)等比例混合的權(quán)利要求2所述的擴增GJB2基因基礎(chǔ)啟動區(qū)、外顯子l及其剪切區(qū)域的正向引物F1和擴增GJB2基因基礎(chǔ)啟動區(qū)、外顯子1及其剪切區(qū)域的反向引物R1，等比例混合的權(quán)利要求2所述的擴增GJB2基因外顯子2及其剪切區(qū)域的正向引物F2和擴增外顯子2及其剪切區(qū)域的反向引物R2。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒或類似產(chǎn)品，其特征在于其中還包含提取血樣DNA的試劑'。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒或類似產(chǎn)品，其特征在于其中所述的提取血樣DNA的試劑為提取足根血DNA的溶液I，其主要成分為Chelex。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒或類似產(chǎn)品，其特征在于其中所述的提取血樣DNA的試劑為外周血DNA提取試劑盒。7、根據(jù)權(quán)利要求3或4或5或6任一項所述的試劑盒或類似產(chǎn)品，其特征在于其中還包含使用說明書。全文摘要一種體外檢測遺傳性耳聾相關(guān)縫隙連接蛋白26基因GJB2突變的方法，通過進行聚合酶鏈反應，對GJB2基因基礎(chǔ)啟動區(qū)、外顯子1、外顯子2及剪切區(qū)域進行完整擴增，然后進行DNA序列測定，檢測GJB2基因突變的存在；本發(fā)明的方法能完整覆蓋GJB2基因基礎(chǔ)啟動區(qū)、外顯子1和外顯子2及剪切區(qū)域的所有突變，能提高GJB2基因突變的檢出率和GJB2基因相關(guān)性遺傳性耳聾的診斷率，較單獨進行GJB2編碼區(qū)測序更全面、可靠，有利于遺傳性耳聾的診斷。文檔編號C12Q1/68GK101363054SQ20081011794公開日2009年2月11日申請日期2008年8月18日優(yōu)先權(quán)日2008年8月18日發(fā)明者樸戴,袁永一,金政策,韓東一申請人:金政策