專利名稱：水稻細胞色素p450基因引物輔助鑒定植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑的殘留的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻細胞色素P450基因引物輔助鑒定植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑的殘留。
背景技術(shù)：
利用生物技術(shù)發(fā)展生態(tài)農(nóng)藥是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究的一個重要方向，可以緩解農(nóng)民負 擔(dān)、減少生態(tài)環(huán)境污染和降低因大量農(nóng)藥殘留造成的人類健康危害。細胞色素P450 酶系是結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上含硫醇血紅素的氧化酶。細胞色素P450超基因家族存在 很強的生物多樣性，廣泛參與動植物的各類生命活動，比如生物分子合成、解毒和 藥物代謝途徑。利用功能基因組學(xué)和生物信息學(xué)手段，研究整合生物代謝途徑中的 細胞色素P450家族的功能信息，研究預(yù)測與降解農(nóng)藥殘留相關(guān)的水稻P450基因， 將有利于生產(chǎn)我國自主性的生態(tài)農(nóng)藥。以信號受體和轉(zhuǎn)錄途徑組分分析為基礎(chǔ)可進 行農(nóng)用化合物設(shè)計，結(jié)合化學(xué)信息學(xué)方法，可鑒定用于殺蟲劑和除草劑的潛在化學(xué) 成分。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供水稻細胞色素P450基因引物輔助鑒定植物培養(yǎng)基質(zhì)中除 草劑的殘留。本發(fā)明所提供的輔助鑒定植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑殘留的引物，是由序列表中序 列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列組成的。該引物對是根據(jù)水稻細胞色素 P450基因序列設(shè)計的，細胞色素P450基因命名為CYP709C5 ，其NCBI定位號為 NP—001060386， NCBI基因號(GENE ID)為Os07g0635500， DBJ號為AK121733， TIGR 號為LOC—0s07g44140，全長cDNA序列長度為1564個核苷酸，定位于第七號染色體 從26， 381， 064bp到26， 382， 763bp;該基因編碼的蛋白共有517氮基酸。CYP709C5 基因的表達受除草劑的誘導(dǎo)，所述除草劑為二氯喹啉酸、苯達松、甲磺隆、異惡草 酮或甲基紫精。本發(fā)明的另 一個目的是提供輔助鑒定植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑殘留的方法。 本發(fā)明所提供的輔助鑒定植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑殘留的方法，是將在不含除草 劑的植物培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)的水稻移栽到待測的植物培養(yǎng)基質(zhì)中，以所述水稻的總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，以序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸 序列為引物，進行實時熒光定量PCR擴增，通過擴增曲線計算待檢測的植物培養(yǎng)基 質(zhì)的水稻的總RNA中特異性擴增產(chǎn)物的初始拷貝數(shù)與不含除草劑的植物培養(yǎng)基質(zhì)的 水稻的總RNA中特異性擴增產(chǎn)物的初始拷貝數(shù)的比值，所述比值大于2. 0±0. 05， 待測植物培養(yǎng)基質(zhì)為有除草劑殘留的候選植物培養(yǎng)基質(zhì)。所述的植物培養(yǎng)基質(zhì)可為任何可培養(yǎng)植物的液體或固體基質(zhì)，如培養(yǎng)液、土壤、 蛭石等。當(dāng)所述待測的植物培養(yǎng)基質(zhì)為液體時，可將在不含除草劑的植物培養(yǎng)基質(zhì)中培 養(yǎng)的水稻移栽到所述待測的植物培養(yǎng)基質(zhì)中6小時-24小時；當(dāng)所述待測的植物培 養(yǎng)基質(zhì)為固體時，可將所述待測的植物培養(yǎng)基質(zhì)用5ml/100ml 二甲亞砜水溶液浸泡， 收集浸出液；將在不含除草劑的植物培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)的水稻移栽到待測的植物培養(yǎng) 基質(zhì)中6小時-24小時。進行所述移栽的水稻可處于二葉期-四葉期。所述除草劑為 二氯喹啉酸、苯達松、甲磺隆、異惡草酮或甲基紫精。通過本發(fā)明提供的輔助鑒定植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑殘留的方法，可初步鑒定植 物培養(yǎng)基質(zhì)中是否有除草劑殘留，再結(jié)合現(xiàn)有的儀器分析方法可確定植物培養(yǎng)基質(zhì) 中是否有除草劑殘留。為了方便、快速輔助鑒定植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑殘留，本發(fā)明還提供了一種專 用的熒光定量PCR試劑盒，該熒光定量PCR試劑盒包含一對引物，該引物對由序列 表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列組成。本發(fā)明根據(jù)一個對多種除草劑具有明顯應(yīng)答特征的水稻細胞色素P450基因的 基因序列設(shè)計了一對引物，用該引物對可輔助檢測植物培養(yǎng)基質(zhì)中是否有除草劑殘 留。利用本發(fā)明的輔助鑒定植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑殘留的方法可對植物培養(yǎng)基質(zhì)進 行初步篩查，將篩出的候選植物培養(yǎng)基質(zhì)再用現(xiàn)有的儀器分析方法進行確定有無除 草劑殘留，可大大降低儀器分析的工作強度，使對植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑殘留的檢 測快速簡便。


圖1為水稻細胞色素P450基因，CYP709C5，在水稻基因組序列上的位置示意 圖及基因結(jié)構(gòu)。圖2為CYP709C5基因在二氯喹啉酸的處理條件下表達變化。 圖3為CYP709C5基因在多種除草劑的處理條件下表達變化。
具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。 下述實施例中的水稻品種來自國家種質(zhì)資源庫。實施例1、 CYP709C5在基因組序列的定位及引物設(shè)計通過Blast分析，將已命名的水稻細胞色素P450基因和TIGR水稻數(shù)據(jù)庫中的 基因位點對應(yīng)起來，CYP709C5對應(yīng)LOC一Os07g44140，位于第七號染色體第 26,381,064bp到26,382,763bp，具有兩個外顯子和一個內(nèi)含子，該基因的結(jié)構(gòu)如圖 1所示。根據(jù)CYP709C5的mRNA序列，用primer3工具，在CYP709C5的mRNA序列 靠近3'端設(shè)計一對特異引物ChemR5-1和ChemR5-2，引物ChemR5-1和ChemR5-2 的序列分別為序列表中的序列1和序列2。實施例2、用引物ChemR5-l和ChemR5-2檢測CYP709C5在除草劑處理下的表達以5ml/100ml 二甲亞砜水溶液為溶劑分別配制濃度為1. 65mM 二氯喹啉酸溶液、 濃度為19. 98mM苯達松溶液、濃度為1. 31raM甲磺隆溶液、濃度為1. 75raM異惡草酮 溶液和濃度為10uM甲基紫精溶液。在正常生長條件下(溫度為28。C / 25°C ，相對濕度83%， 12小時晝夜循環(huán)) 生長的水稻日本晴的幼苗，在兩葉一心期分別用L65mM二氯喹啉酸溶液、19.98mM 苯達松溶液、L31mM甲磺隆溶液、1.75mM異惡草酮溶液和lOiiM甲基紫精溶液噴 霧處理，以用5ml/100ml二甲亞砜水溶液噴霧處理作為對照，實驗重復(fù)3次，每個 重復(fù)處理10-20株水稻。提取1. 65mM 二氯喹啉酸溶液處理3小時、6小時和24小時及5ml/100ml 二甲 亞砜水溶液處理3小時、6小時和24小時的水稻日本晴幼苗的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA;以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，ChemR5-1和ChemR5-2為引物通過實時熒光定量 PCR技術(shù)檢測CYP709C5的表達水平。取上述5種除草劑處理6小時的水稻日本晴幼苗和對照幼苗分別提取總RNA， 反轉(zhuǎn)錄成cDNA;以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，ChemR5-1和ChemR5-2為引物通過實 時熒光定量PCR技術(shù)檢測CYP709C5的表達水平。熒光定量PCR反應(yīng)條件如下以18S rRNA作為內(nèi)標(biāo)，按下列條件進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，反 體系IO y L:10XPCR Buffer 1 u L， 25mmol/L Mg2+ 1 u L， 10 mmol/L dNTPs 0.5 u L， 25wmol/L上下游引物各0. 25 y L， cDNA模板l y L， Taq酶(Promega) 0.25 u L，20XSYBR Green I 0. 5 u L， ddH20 6.25 u L。檢測CYP81A6的表達水平實時熒光定量PCR的反應(yīng)條件95'C變性3 mi n，循環(huán) 40次9 5 °C變性4 0 s — 6 1 °C退火2 5 s — 7 2 。C延伸l mi n 20 s，融 解95。C 0 s(20。C/s)—71°C 15 s(2(TC/s—95°C0 s(O, l°C/s),冷卻40。C 30 s(20 °C/s)。所有熒光定量PCR反應(yīng)均在LightCycler (Roche)上進行。實時熒光定量PCR結(jié)果表明，1. 65mM 二氯喹啉酸處理3小時開始CYP709C5的 表達水平就已經(jīng)高于對照，此時1. 65mM 二氯喹啉酸處理組與對照組的CYP709C5的 拷貝數(shù)比值為9. 87; 1. 65mM 二氯喹啉酸處理24小時，CYP709C5的表達水平仍高于 對照，此時1. 65mM 二氯喹啉酸處理組與對照組的CYP709C5的拷貝數(shù)比值為14. 19 (圖2)。圖2中"1"代表用5ral/100ml 二甲亞砜水溶液處理3小時，"2"代表二氯喹 啉酸處理3小時，"3"代表用5ml/100ml 二甲亞砜水溶液處理6小時，"4"代表 二氯喹啉酸處理6小時，"5"代表用5ml/100ml二甲亞砜水溶液處理24小時，"6" 代表二氯喹啉酸處理24小時。雖然不同除草劑的處理CYP709C5的應(yīng)答不同，但經(jīng)6小時的二氯喹啉酸、苯 達松、甲磺隆、異惡草酮和甲基紫精處理后，CYP709C5的表達水平均明顯高于對照 組，此時，二氯喹啉酸處理組與對照組的CYP709C5的拷貝數(shù)比值為4.43，苯達松 處理組與對照組的CYP709C5的拷貝數(shù)比值為12. 91，甲磺隆處理組與對照組的 CYP709C5的拷貝數(shù)比值為2. 88，異惡草酮處理組與對照組的CYP709C5的拷貝數(shù)比 值為12. 91，甲基紫精處理組與對照組的CYP709C5的拷貝數(shù)比值為2. 94。其中， 異惡草酮和苯達松的誘導(dǎo)作用最強，二氯喹啉酸次之，甲基紫精和甲磺隆較弱(圖 3)。圖3中"1"代表用二氯喹啉酸處理6小時，"2"代表用苯達松處理6小時， "3"代表用甲磺隆處理6小時，"4"代表用異惡草酮處理6小時，"5"代表用 甲基紫精處理6小時。6序列表<110〉 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>水稻細胞色素P450基因引物輔助鑒定植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑的殘留<130> CGGNARW81586〈160〉 2〈210> 1〈211〉 20〈212〉 DNA <213>〈220〉 〈223〉<400〉 1tatcgattcc gattgcaaca 20<210〉 2<211〉 20〈212〉 DNA <213〉<220> <223>〈400> 2tattttcccg cctttgacac 20
權(quán)利要求
1、一種輔助鑒定植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑殘留的引物，是由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列組成的一對引物。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的引物，其特征在于所述除草劑為二氯喹啉酸、苯達 松、甲磺隆、異惡草酮或甲基紫精。
3、 一種輔助鑒定植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑殘留的方法，是將在不含除草劑的植物 培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)的水稻移栽到待測的植物培養(yǎng)基質(zhì)中，以所述水稻的總RNA反轉(zhuǎn)錄獲 得的cDNA為模板，以序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列為引物， 進行實時熒光定量PCR擴增，通過擴增曲線計算待測的植物培養(yǎng)基質(zhì)中的水稻的總RNA 中特異性擴增產(chǎn)物的初始拷貝數(shù)與不含除草劑的植物培養(yǎng)基質(zhì)中的水稻的總RNA中特 異性擴增產(chǎn)物的初始拷貝數(shù)的比值，所述比值大于2.0士0.05，待測植物培養(yǎng)基質(zhì)中 為有除草劑殘留的候選植物培養(yǎng)基質(zhì)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述待測的植物培養(yǎng)基質(zhì)為液體， 將在不含除草劑的植物培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)的水稻移栽到所述待檢測的植物培養(yǎng)基質(zhì)中6 小時-24小時。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述待測的植物培養(yǎng)基質(zhì)為固體 時，將所述待檢測的植物培養(yǎng)基質(zhì)用5ml/100ml 二甲亞砜水溶液浸泡，收集浸出液； 將在不含除草劑的植物培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)的水稻移栽到待測的植物培養(yǎng)基質(zhì)中6小時 -24小時。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的方法，其特征在于所述移栽的水稻處于二 葉期-四葉期。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述除草劑為二氯喹啉酸、苯達 松、甲磺隆、異惡草酮或甲基紫精。
8、 一種輔助鑒別植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑殘留的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒 包括一對引物，其特征在于所述引物對是由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2 的核苷酸序列組成。
9、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述除草劑為二氯喹啉酸、苯 達松、甲磺隆、異惡草酮或甲基紫精。
10、 權(quán)利要求1所述的引物在鑒定水稻生長中有無噴施除草劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了水稻細胞色素P450基因引物輔助鑒定植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑的殘留。該引物是由序列表中序列1和序列2組成的。本發(fā)明公開的方法，是將在不含除草劑的植物培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)的水稻移栽到待測的植物培養(yǎng)基質(zhì)中，以所述水稻的總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，用上述引物進行實時熒光定量PCR擴增，通過擴增曲線計算待檢測的植物培養(yǎng)基質(zhì)中的水稻的總RNA中特異性擴增產(chǎn)物的初始拷貝數(shù)與不含除草劑的植物培養(yǎng)基質(zhì)中的水稻的總RNA中特異性擴增產(chǎn)物的初始拷貝數(shù)的比值，所述比值大于2.0±0.05，待測植物培養(yǎng)基質(zhì)為有除草劑殘留的候選植物培養(yǎng)基質(zhì)。本發(fā)明的方法使對植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑殘留的檢測快速簡便。
文檔編號C12Q1/68GK101643777SQ200810118019
公開日2010年2月10日 申請日期2008年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月6日
發(fā)明者周少霞, 張蓋華, 徐文英, 震 蘇, 超 邸 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)