專利名稱：水稻細(xì)胞色素p450基因?qū)Ｓ靡镙o助鑒別植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑的殘留的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻細(xì)胞色素P450基因?qū)Ｓ靡镙o助鑒別植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑的殘留。
背景技術(shù)：
利用生物技術(shù)發(fā)展生態(tài)農(nóng)藥是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究的一個(gè)重要方向，可以緩解農(nóng)民負(fù)擔(dān)、減少生態(tài)環(huán)境污染和降低因大量農(nóng)藥殘留造成的人類健康危害。細(xì)胞色素P450酶系是結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上含硫醇血紅素的氧化酶。細(xì)胞色素P450超基因家族存在很強(qiáng)的生物多樣性，廣泛參與動(dòng)植物的各類生命活動(dòng)，比如生物分子合成、解毒和藥物代謝途徑。利用功能基因組學(xué)和生物信息學(xué)手段，研究整合生物代謝途徑中的細(xì)胞色素P450家族的功能信息，研究預(yù)測(cè)與降解農(nóng)藥殘留相關(guān)的水稻P450基因，將有利于生產(chǎn)我國(guó)自主性的生態(tài)農(nóng)藥。以信號(hào)受體和轉(zhuǎn)錄途徑組分分析為基礎(chǔ)可進(jìn)行農(nóng)用化合物設(shè)計(jì)，結(jié)合化學(xué)信息學(xué)方法，可鑒定用于殺蟲劑和除草劑的潛在化學(xué)成分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供水稻細(xì)胞色素P450基因?qū)Ｓ靡镙o助鑒別植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑的殘留。
本發(fā)明所提供的輔助鑒別植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑殘留的引物，是由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列組成的一對(duì)引物。該引物對(duì)是根據(jù)水稻細(xì)胞色素P450基因序列設(shè)計(jì)的，細(xì)胞色素P450基因命名為CYP81A6 ，其NCBI定位號(hào)為NP—001051342， NCBI基因號(hào)(GENE ID)為0s03g0760200， DBJ號(hào)為AK104825， TIGR號(hào)為L(zhǎng)0C—0s03g55240，全長(zhǎng)cDNA序列長(zhǎng)度為2199個(gè)核苷酸，定位于第三號(hào)染色體從31，379,697bp到31， 384， 722bp，該基因編碼的蛋白共有732氨基酸。CYP81A6基因的表達(dá)受除草劑的誘導(dǎo)，所述除草劑為二氯喹啉酸、苯達(dá)松、甲磺隆、異惡草酮或甲基紫精。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種輔助鑒別植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑殘留的方法。本發(fā)明所提供的輔助鑒別植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑殘留的方法，是將在不含除草劑的植物培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)的水稻移栽到待測(cè)的植物培養(yǎng)基質(zhì)中，以所述水稻的總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，以序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列為引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，通過(guò)擴(kuò)增曲線計(jì)算待測(cè)的植物培養(yǎng)基質(zhì)的水稻的總RNA中特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的初始拷貝數(shù)與不含除草劑的植物培養(yǎng)基質(zhì)的水稻的總RNA中特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的初始拷貝數(shù)的比值，所述比值大于2.0土0.05，待測(cè)植物培養(yǎng)基質(zhì)為有除草劑殘留的候選植物培養(yǎng)基質(zhì)。
所述的植物培養(yǎng)基質(zhì)可為任何可培養(yǎng)植物的液體或固體基質(zhì)，如培養(yǎng)液、土壤、蛭石等。
當(dāng)所述待測(cè)的植物培養(yǎng)基質(zhì)為液體時(shí)，可將在不含除草劑的植物培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)的水稻移栽到待檢測(cè)的植物培養(yǎng)基質(zhì)中6小時(shí)-24小時(shí)；當(dāng)所述待測(cè)的植物培養(yǎng)基質(zhì)為固體時(shí)，可將待測(cè)的植物培養(yǎng)基質(zhì)用5ml/100ml 二甲亞砜水溶液浸泡，收集浸出液；將在不含除草劑的植物培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)的水稻移栽到待測(cè)的植物培養(yǎng)基質(zhì)中6小時(shí)-24小時(shí)。進(jìn)行所述移栽的水稻可處于二葉期-四葉期。所述除草劑為二氯喹啉酸、苯達(dá)松、甲磺隆、異惡草酮或甲基紫精。
通過(guò)本發(fā)明提供的輔助鑒定植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑殘留的方法，可初步鑒定植物培養(yǎng)基質(zhì)中是否有除草劑殘留，再結(jié)合現(xiàn)有的儀器分析方法可確定植物培養(yǎng)基質(zhì)中是否有除草劑殘留。
為了方便、快速輔助鑒定植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑殘留，本發(fā)明還提供了一種專用的熒光定量PCR試劑盒，該熒光定量PCR試劑盒包含一對(duì)引物，該引物對(duì)由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列組成。
本發(fā)明根據(jù)一個(gè)對(duì)多種除草劑具有明顯應(yīng)答特征的水稻細(xì)胞色素P450基因的基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，用該引物對(duì)可輔助檢測(cè)植物培養(yǎng)基質(zhì)中是否有除草劑殘留。利用本發(fā)明的輔助鑒定植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑殘留的方法可對(duì)植物培養(yǎng)基質(zhì)進(jìn)行初步篩査，將篩出的候選植物培養(yǎng)基質(zhì)再用現(xiàn)有的儀器分析方法進(jìn)行確定有無(wú)除草劑殘留，可大大降低儀器分析的工作強(qiáng)度，使對(duì)植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑殘留的檢測(cè)快速簡(jiǎn)便。


圖1為水稻細(xì)胞色素P450基因，CYP81A6，在水稻基因組序列上的位置示意圖及基因結(jié)構(gòu)。
圖2為CYP81A6基因在二氯喹啉酸的處理?xiàng)l件下表達(dá)變化。圖3為CYP81A6基因在多種除草劑的處理?xiàng)l件下表達(dá)變化。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中的水稻品種來(lái)自國(guó)家種質(zhì)資源庫(kù)。實(shí)施例1、 CYP81A6在基因組序列的定位及引物設(shè)計(jì)
通過(guò)Blast分析，將已命名的水稻細(xì)胞色素P450基因和TIGR水稻數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因位點(diǎn)對(duì)應(yīng)起來(lái)，CYP81A6對(duì)應(yīng)L0C—0s03g55240，位于第三號(hào)染色體第31, 379， 697bp到31，384，722bp，具有五個(gè)外顯子和四個(gè)內(nèi)含子，該基因的結(jié)構(gòu)如圖l所示。根據(jù)CYP81A6的mRNA序列，用primer3工具，在CYP81A6的mRNA序列靠近3'端設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物ChemR3-1和ChemR3-2，引物ChemR3-1和ChemR3-2的序列分別為序列表中的序列1和序列2。
實(shí)施例2、用引物ChemR3-1和ChemR3-2檢測(cè)CYP81A6在除草劑處理下的表達(dá)以5ml/100ml 二甲亞砜水溶液為溶劑分別配制濃度為1. 65mM 二氯喹啉酸溶液、濃度為19.98mM苯達(dá)松溶液、濃度為1.31raM甲磺隆溶液、濃度為1.75mM異惡草酮溶液和濃度為10yM甲基紫精溶液。
在正常生長(zhǎng)條件下(溫度為28。C / 25°C ，相對(duì)濕度83%， 12小時(shí)晝夜循環(huán))生長(zhǎng)的水稻日本晴的幼苗，在兩葉一心期分別用1.65mM二氯喹啉酸溶液、19.98mM苯達(dá)松溶液、1. 31mM甲磺隆溶液、1.75mM異惡草酮溶液和10uM甲基紫精溶液噴霧處理，以用5ml/100ml二甲亞砜水溶液噴霧處理作為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)處理10-20株水稻。
提取1. 65mM 二氯喹啉酸溶液處理3小時(shí)、6小時(shí)和24小時(shí)及二甲亞砜處理3小時(shí)、6小時(shí)和24小時(shí)的水稻日本晴幼苗的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA;以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，ChemR3-1和ChemR3-2為引物通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)CYP81A6的表達(dá)水平。
取上述5種除草劑處理6小時(shí)的水稻日本晴幼苗和對(duì)照幼苗分別提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA;以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，ChemR3-1和ChemR3-2為引物通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)CYP81A6的表達(dá)水平。
熒光定量PCR反應(yīng)條件如下
以18S rRNA作為內(nèi)標(biāo)，按下列條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系IO w L:10 XPCR Buffer 1 u L， 25mmol/L Mg2+ 1 y L， 10 mmol/L dNTPs 0. 5 u L， 25 u mol/L上下游引物各O. 25 uL， cDNA模板l u L， Taq酶(Promega) 0.25 n L， 20XSYBR GreenI 0. 5 u L， ddH20 6. 25 u L。
檢測(cè)CYP81A6的表達(dá)水平實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)條件95匸變性3 mi n，循環(huán)40次9 5 °C變性4 0 s — 6 1 °C退火2 5 s — 7 2 。C延伸l mi n 20 s，融解95。C 0 s(20°C/s)—71°C 15 s(20°C/s—95°C0 s(0.rC/s),冷卻40。C 30 s(20°C/s)。所有熒光定量PCR反應(yīng)均在LightCycler (Roche)上進(jìn)行。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，1. 65rnM 二氯喹啉酸處理3小時(shí)開始CYP81A6的表達(dá)水平就已經(jīng)高于對(duì)照，此時(shí)1. 65mM 二氯喹啉酸處理組與對(duì)照組的CYP81A6的拷貝數(shù)
5比值為8. 32; 1. 65mM 二氯喹啉酸處理24小時(shí)，CYP81A6的表達(dá)水平仍高于對(duì)照，此時(shí)1. 65mM 二氯喹啉酸處理組與對(duì)照組的CYP81A6的拷貝數(shù)比值為29. 31。(圖2)
圖2中"1"代表用二甲亞砜處理3小時(shí)，"2"代表二氯喹啉酸處理3小時(shí)，"3"代表用二甲亞砜處理6小時(shí)，"4"代表二氯喹啉酸處理6小時(shí)，"5"代表用二甲亞砜處理24小時(shí)，"6"代表二氯喹啉酸處理24小時(shí)。
雖然不同除草劑的處理CYP81A6的應(yīng)答不同，但經(jīng)6小時(shí)的二氯喹啉酸、苯達(dá)松、甲磺隆、異惡草酮和甲基紫精處理后，CYP81A6的表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，此時(shí)，二氯喹啉酸處理組與對(duì)照組的CYP81A6的拷貝數(shù)比值為8. 90;苯達(dá)松處理組與對(duì)照組的CYP81A6的拷貝數(shù)比值為5. 23;甲磺隆處理組與對(duì)照組的CYP81A6的拷貝數(shù)比值為2.61;異惡草酮處理組與對(duì)照組的CYP81A6的拷貝數(shù)比值為12.33;甲基紫精處理組與對(duì)照組的CYP81A6的拷貝數(shù)比值為12.04。其中，異惡草酮和甲基紫精的誘導(dǎo)作用最強(qiáng)，二氯喹啉酸次之，苯達(dá)松和甲磺隆較弱(圖3)。
圖3中"1"代表用二氯喹啉酸處理6小時(shí)，"2"代表用苯達(dá)松處理6小時(shí)，"3"代表用甲磺隆處理6小時(shí)，"4"代表用異惡草酮處理6小時(shí)，"5"代表用甲基紫精處理6小時(shí)。序列表
〈110〉 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120〉水稻細(xì)胞色素P450基因?qū)Ｓ靡镙o助鑒別植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑的殘留。
<130〉 CGGNARW81583 〈160> 2
<210〉 1
<211〉 21
<212> DNA 〈213>人工序列
<220〉 <223〉
〈400〉 1
gctagcaatc gctctttgag a 21
<210> 2 <211〉 22 <212> DNA <213〉人工序列
〈220〉 <223〉
<400> 2
gaaattgaaa tacctggcgt gt 22
權(quán)利要求
1、一種輔助鑒別植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑殘留的引物，是由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列組成的一對(duì)引物。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的引物，其特征在于所述除草劑為二氯喹啉酸、苯達(dá) 松、甲磺隆、異惡草酮或甲基紫精。
3、 一種輔助鑒別植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑殘留的方法，是將在不含除草劑的植物 培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)的水稻移栽到待測(cè)的植物培養(yǎng)基質(zhì)中，以所述水稻的總RNA反轉(zhuǎn)錄獲 得的cDNA為模板，以序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列為引物， 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，通過(guò)擴(kuò)增曲線計(jì)算待測(cè)的植物培養(yǎng)基質(zhì)中的水稻的總RNA 中特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的初始拷貝數(shù)與不含除草劑的植物培養(yǎng)基質(zhì)中的水稻的總RNA中特 異性擴(kuò)增產(chǎn)物的初始拷貝數(shù)的比值，所述比值大于2.0士0.05，待測(cè)植物培養(yǎng)基質(zhì)為 有除草劑殘留的候選植物培養(yǎng)基質(zhì)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述待測(cè)的植物培養(yǎng)基質(zhì)為液體， 將在不含除草劑的植物培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)的水稻移栽到所述待檢測(cè)的植物培養(yǎng)基質(zhì)中6 小時(shí)-24小時(shí)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述待測(cè)的植物培養(yǎng)基質(zhì)為固體 時(shí)，將所述待測(cè)的植物培養(yǎng)基質(zhì)用5ml/100ml 二甲亞砜水溶液浸泡，收集浸出液； 將在不含除草劑的植物培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)的水稻移栽到待測(cè)的植物培養(yǎng)基質(zhì)中6小時(shí) -24小時(shí)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的方法，其特征在于所述移栽的水稻處于二 葉期-四葉期。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述除草劑為二氯喹啉酸、苯達(dá) 松、甲磺隆、異惡草酮或甲基紫精。
8、 一種輔助鑒別植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑殘留的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒 包括一對(duì)引物，其特征在于所述引物對(duì)是由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2 的核苷酸序列組成。
9、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述除草劑為二氯喹啉酸、苯達(dá)松、甲磺隆、異惡草酮或甲基紫精。
10、 權(quán)利要求1所述的引物在鑒定水稻生長(zhǎng)中有無(wú)噴施除草劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了水稻細(xì)胞色素P450基因?qū)Ｓ靡镙o助鑒別植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑的殘留。該引物是由序列表中序列1和序列2組成的。本發(fā)明公開的方法，是將在不含除草劑的植物培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)的水稻移栽到待測(cè)的植物培養(yǎng)基質(zhì)中，以所述水稻的總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，用上述引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，通過(guò)擴(kuò)增曲線計(jì)算待檢測(cè)的植物培養(yǎng)基質(zhì)中的水稻的總RNA中特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的初始拷貝數(shù)與不含除草劑的植物培養(yǎng)基質(zhì)中的水稻的總RNA中特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的初始拷貝數(shù)的比值，所述比值大于2.0±0.05，待測(cè)植物培養(yǎng)基質(zhì)為有除草劑殘留的候選植物培養(yǎng)基質(zhì)。本發(fā)明的方法使對(duì)植物培養(yǎng)基質(zhì)中除草劑殘留的檢測(cè)快速簡(jiǎn)便。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101643779SQ20081011802
公開日2010年2月10日 申請(qǐng)日期2008年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月6日
發(fā)明者周少霞, 張蓋華, 徐文英, 震 蘇, 超 邸 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)