專利名稱：：一種植物抗逆蛋白master及其編碼基因的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種植物抗逆蛋白MASTER及其編碼基因的應(yīng)用。技術(shù)背景水稻是世界上最重要的糧食作物之一，在我國農(nóng)業(yè)和國民經(jīng)濟中占據(jù)重要的地位，因此提高水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。非生物逆境(干旱、鹽堿、低溫、高溫等)是造成水稻減產(chǎn)和品質(zhì)下降的主要原因之一，培育具有高抗逆性的水稻品種將有助于減輕逆境脅迫引起的損失。目前有關(guān)植物抗逆機理的研究取得了重要進展，如在擬南芥菜中克隆到了與低溫、干旱和高鹽脅迫相關(guān)的CBF/DREB基因，與鹽脅迫相關(guān)的S0S1、SOS2和SOS3等基因，與高溫脅迫相關(guān)的AtHsfA6a基因等。過氧化氫(H202)是需氧生物系統(tǒng)中含量最豐富的一類活性氧，在正常的生命活動過程(如綠色植物葉綠體的光合作用、線粒體的呼吸作用等)中產(chǎn)生。過氧化氫具有很高的化學(xué)反應(yīng)活性，高含量下促進細(xì)胞中的脂肪、蛋白質(zhì)和核酸等重要的功能分子的氧化反應(yīng)，但在低濃度下又可以作為重要的信號分子參與許多重要的生命活動過程，如抗逆反應(yīng)、超敏反應(yīng)、氣孔開閉、光合反應(yīng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞伸長、激素作用等。過氧化氫在細(xì)胞內(nèi)的積累受到不同代謝反應(yīng)、不同組織以及不同環(huán)境條件的影響。在非生物逆境脅迫條件下(如干旱、高溫、鹽堿、紫外線照射)，過氧化氫合成相關(guān)的酶(如NADPH氧化酶)被激活，過氧化氫含量升高。過高含量的HA導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)重要功能分子的氧化和細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的不可逆損傷。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種植物抗逆蛋白MASTER及其編碼基因的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的與抗逆性相關(guān)的蛋白，來源于水稻(&，/za^firaL.)，名稱為MASTER(multipleabioticstresstoleranceenhancer)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗逆性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。序列表中的序列1由251個氨基酸殘基組成。所述一個或數(shù)幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過io個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。為了使(a)中的MASTER便于純化，可在由序列表中序列l(wèi)所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表l標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述(b)中的MASTER可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(b)中的MASTER的編碼基因可通過將序列表中序列2自5'端第1至756位堿基所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。所述MASTER蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述MASTER蛋白的編碼基因為如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)其編碼序列是序列表中序列2所示的DNA分子；2)其編碼序列是序列表中序列4所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子;4)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90y。以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。序列表中的序列2由756個核苷酸組成，編碼序列為自5'端第1位至756位核苷酸。序列表中的序列4由1917個核苷酸組成，其開放閱讀框架為自5'端起第l位-1917位核苷酸，該基因含有9個外顯子(自序列4的5'端起第1位-122位核苷酸，第216位-390位核苷酸，第476位-541位核苷酸，第734位-782位核苷酸，第1141位-1226位核苷酸，第1316位-1395位核苷酸，第1512位-1614位核苷酸，第1749位-1807位核苷酸，第1902位-1917位核苷酸)，8個內(nèi)含子(自序列4的5'端起第123位-215位核苷酸，第391位-475位核苷酸，第542位-733位核苷酸，第783位-1140位核苷酸，第1227位-1315位核苷酸，第1396位-1511位核苷酸，第1615位-1748位核苷酸，第1808位-1901位核苷酸)。所述嚴(yán)格條件可為在O.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.ly。SDS的溶液中，在65。C下雜交并洗膜。用于擴增所述基因或所述基因中的任一DNA片段的引物對均屬于本發(fā)明的保護范圍。含有所述基因的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達載體構(gòu)建含有MASTER基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3'端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組植物表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、玉米的泛素啟動子(Ubiquitin)、水稻肌動蛋白(Actl)的啟動子，它們可單獨使用或與其它植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。所述的重組表達載體具體可為圖3所示的重組表達載體。圖3所示的表達載體的載體骨架為pCAMBIA2300，在載體骨架中先插入水稻肌動蛋白(Actinl)的啟動子，再出入所述外源基因，外源基因由水稻肌動蛋白(Actinl)的啟動子啟動。本發(fā)明還提供了一種培育抗逆植物的方法，是將所述基因?qū)胫参锛?xì)胞中，得到耐抗逆植物。利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達的載體，將本發(fā)明所提供的MASTER的編碼基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得對干旱、鹽、高溫、低溫等非生物逆境脅迫耐受力增強的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。攜帶有編碼基因的表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，所述雙子葉植物包括煙草、油菜、棉花、大豆、楊樹、桉樹、馬鈴薯和苜蓿等；所述單子葉植物包括水稻、玉米、小麥、大麥、高粱、谷子、牧草或草坪草。所述基因具體可通過圖3所示的重組表達載體導(dǎo)入植物細(xì)胞中。本發(fā)明提供的蛋白在&02清除過程中起著的極其重要的作用，保護細(xì)胞免受活性氧造成的傷害。將本發(fā)明蛋白的編碼基因?qū)胨?，得到了過量表達的轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因植株對高溫、低溫、干旱和鹽堿等逆境脅迫的抗性大大增強。廁57S基因的表達量和水稻的抗逆性水平密切相關(guān)。本發(fā)明提供的蛋白及其編碼基因在水稻、小麥、玉米、棉花、大豆、牧草、蔬菜、果樹等植物的抗逆育種工作中具有良好的應(yīng)用前景。以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。圖1為水稻i/A57a基因結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為野生型水稻MASTER基因在逆境脅迫下的相對表達量。圖3為水稻MASTER過量表達載體示意圖。圖4為T。代MASTER過量表達轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定圖。圖5為L代過量表達轉(zhuǎn)基因植株中MASTER基因的表達量。圖6為低溫脅迫下L代過量表達轉(zhuǎn)基因植株的生長狀況。圖7為高溫脅迫下L代過量表達轉(zhuǎn)基因植株的生長狀況。圖8為干旱脅迫下L代過量表達轉(zhuǎn)基因植株的生長狀況。圖9為鹽脅迫下L代過量表達轉(zhuǎn)基因植株的生長狀況。圖10為不同濃度NaCl處理下L代過量表達轉(zhuǎn)基因種子的萌發(fā)情況。具體實施方式下面結(jié)合具體實例對本發(fā)明做進一步說明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。以下實施例中的T。代表示由愈傷組織得到的植株，T,代表示T。代自交產(chǎn)生的種子及其長成的植株。實施例1、水稻MASTER基因的篩選及其cDNA克隆一、水稻MASTER基因編碼序列的獲得根據(jù)NCBI上公布的基因組序列，設(shè)計一對引物(P1和P2)如下Pl(正向引物)5，-CGGTCGACGGGATTGATTGATTGATTCG-3，(Sail);P2(反向引物)5，-GCTCTGCAGTGATCGTACTGACTCTAAGG-3，(Pstl)。使用TRIZOL(Invitrogen，USA)—步法提取日本晴水稻葉片的總RNA。取2ug總RNA，采用Superscriptfirst-strandsynthesissystem(Invitrogen，USA)制備cDNA，整個操作均按照試劑盒推薦的條件進行。以cDNA為模板，用上述引物對進行PCR擴增，DNA聚合酶為AccuPrimePfx(Invitrogen,USA),擴增條件為先94°C3min;94。C1min，52°C1min，72°Clmin，5個循環(huán)；94°C1min，62°C1min，72°Clmin，25個循環(huán)；最后72°C5rain。對PCR產(chǎn)物進行0.8。/。瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到分子量約為900kb的條帶。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(NucleoSpinExtractII，MACHEREY-NAGEL，GERMANY)回收該片段，連入中間載體pEASY-T,中，送Invitrogen測序。測序結(jié)果表明，擴增到的DNA序列由870個脫氧核糖核苷酸組成，見序列表的序列3，序列3中含有序列表中序列2所示的基因，該基因的開放閱讀框(0RF)為序列表中序列2的自5'末端第1至756位脫氧核糖核苷酸，編碼氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白質(zhì)。將序列1所示的氨基酸序列命名為MASTER蛋白，將序列2所示的DNA序列命名湖6T^基因。將含有序列表中序列2的自5'末端第1-756位脫氧核糖核苷酸的pEASY-L載體命名為pEASY-T「鵬57^7。二、水稻J/A57S基因全序列的獲得提取日本晴水稻葉片的基因組DNA，用引物P3和P4進行PCR擴增，得到#AST^P基因的基因組DNA序列。測序結(jié)果表明擴增到的DNA片段由1917個脫氧核糖核苷酸組成，見序列表的序列4。MASTER基因組從5，端起始密碼子ATG開始至3，端終止密碼子TAA，全長1917個核苷酸，包括9個外顯子，8個內(nèi)含子。鵬57^7基因的基因結(jié)構(gòu)見圖1。P3:5，-ATGGGCAGCAAGTCGTACC-3';P4:5，-TTATTCCTCAGCAAATCTGAAACC-3，。序列1中自氨基端第4位至251位為抗壞血酸過氧化物酶，該酶是植物亞鐵血紅素依賴型過氧化物酶的一個亞組，有一個亞鐵血紅素輔基，催化有關(guān)HA的多步氧化反應(yīng)，作為電子受體；自氨基端第35，42，133，160，164，166，170，174，236位氨基酸殘基為亞鐵血紅素結(jié)合位點(hemebindingsite)，自氨基端第112，164，166，167，169，194，203，204位氨基酸殘基為底物結(jié)合位點(substratebindingsite),自氨基酸165，181，188位氨基酸殘基為鉀結(jié)合位點(potassiumbindingsite)。因此推斷該蛋白為抗壞血酸過氧化物酶(ascorbateperoxoidase)。實施例2、逆境脅迫處理下水稻湖67^y基因的表達特征日本晴幼苗在培養(yǎng)皿中用MS培養(yǎng)基(GIBCO，USA)進行培養(yǎng)，將長勢一致的日本晴三葉一心幼苗分別進行以下脅迫處理l)低溫脅迫處理將幼苗連同培養(yǎng)皿置于4T低溫培養(yǎng)箱中；2)高溫脅迫處理將幼苗連同培養(yǎng)皿置于42。C光照培養(yǎng)箱中；3)干旱脅迫處理將幼苗置于培養(yǎng)皿(墊濾紙)中；4)鹽脅迫處理將幼苗置于NaCl濃度為200mM的MS液體培養(yǎng)基。分別在上述各種處理后0、0.5、1、2、4、8小時取樣，采集根和莖用來提取RNA，進行Real-timePCR，每個樣品重復(fù)三次。低溫試驗結(jié)果如圖2A所示。高溫試驗結(jié)果如圖2B所示。干旱試驗結(jié)果如圖2C所示?？果}試驗結(jié)果如圖2D所示。結(jié)果表明，在逆境脅迫下，MASTER基因的表達量明顯增加。實施例3、過量表達植株的獲得一、水稻MASTER過量表達載體的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶尸W/酶切實施例1構(gòu)建的重組載體pEASY-T「湖5T^，將870bp的DNA片段正向插入攜帶選擇標(biāo)記物基因(NPTII基因)的植物表達載體pCAMBIA23A的5^/和尸"/位點間，即得到過量表達載體pCAMBIA23A-#A57S，結(jié)構(gòu)見圖3。pCAMBIA23A的骨架來自pCAMBIA2300(CBAMIA，Australia)，是在pCAMBIA2300中插入水稻肌動蛋白(Actinl)的啟動子得到的。pCAMBIA23A-湖67F/中，植物選擇標(biāo)記為NPTII抗性，外源基因由水稻肌動蛋白(Actinl)啟動子驅(qū)動。二、過量表達轉(zhuǎn)基因水稻植株的獲得按常規(guī)方法制備日本晴的生長狀態(tài)良好、顆粒狀的愈傷組織。用pCAMBIA23A-MASTER轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，進行PCR及酶切鑒定后，將陽性菌株轉(zhuǎn)化日本晴愈傷組織，常規(guī)培養(yǎng)，用含有G418(Sigma，USA)的MS培養(yǎng)基進行篩選，得到18株陽性植株。提取陽性植株的基因組DNA，以如下引物對進行PCR鑒定正向引物5，-CGGTCGACGGGATTGATTGATTGATTCG-3，；反向引物5，-GCTCTGCAGTGATCGTACTGACTCTAAGG—3，。鑒定結(jié)果見圖4。圖4中，l-18為篩選得到的陽性植株，19為野生型日本晴水稻(陰性對照)。結(jié)果表明，1、3、4、5、8、10、15、16、17為過量表達轉(zhuǎn)基因植株，其它植株為假陽性植株。同上操作，得到轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA23A的對照植株。三、L代過量表達轉(zhuǎn)基因植株中MASTER的表達以L代轉(zhuǎn)空載體對照植株(NT)和T,代過量表達轉(zhuǎn)基因植株1、4、10、16的幼苗為材料，提取RNA，以水稻18S基因為內(nèi)參，使用Real-timePCR的方法檢測在不同轉(zhuǎn)基因植株中MASTER基因的表達。反應(yīng)在Real-timePCR反應(yīng)儀(FTC-200)上進行，每個樣品設(shè)三次重復(fù)。擴增18S基因使用的引物為0sl8Sfp和0sl8Srp;擴增MASTER基因使用的引物為MASTERF和MASTERR，引物序列如下0sl8Sfp:5,-CCACATCCAAGGAAGGCAGCAG-3，；0sl8Srp:5'-CTTGCCCTCCAATGGATCCTCG-3'。MASTERF:5，-CGACTTCTACCAGCTTGCTG-3，；MASTERR:5'-TCACTCAAACCCATCTGCG-3，。結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，過量表達轉(zhuǎn)基因植株中MASTER基因的表達量均高于轉(zhuǎn)空載體對照植株。四、L代過量表達轉(zhuǎn)基因植株的抗性分析將T。代過量表達轉(zhuǎn)基因植株株系1、4、10、16的L代種子和轉(zhuǎn)空載體植株(NT)的T,代種子先在培養(yǎng)皿中發(fā)芽，然后移栽到營養(yǎng)缽中培養(yǎng)至三葉一心，分別進行如下抗逆試驗，每個株系一個營養(yǎng)缽，每個營養(yǎng)缽中3株植株，以下試驗的數(shù)據(jù)結(jié)果均為3株的平均值1、耐低溫試驗將幼苗連同營養(yǎng)缽一起置于4。C低溫培養(yǎng)箱中，光照16h，黑暗8h。觀察轉(zhuǎn)空載體對照植株和過量表達轉(zhuǎn)基因植株的生長情況，處理后第10天和第16天分別采集照片，16天后測定電導(dǎo)率(RohdeP,HinchaDK，HeyerAG.Heterosisinthefreezingtoleranceofcrossesbetweentwo爿i"a6ic/o;357'51t/psJj.aoaaccessions(Columbia-0andC24)thatshowdifferencesinnon-acclimatedandacclimatedfreezingtolerance.尸2a/^7:2004:38:790-799)和HA含量(CreissenG，F(xiàn)irminJ，F(xiàn)ryerM,etal.Elevatedglutathionebiosyntheticcapacityinthechloroplastsoftransgenictobaccoplantsparadoxicallycausesincreasedoxidativestress.ThePlantCell(1999)11:1277-1292)。結(jié)果見圖6，圖6中，A為采集的照片，其中，甲為處理前的照片，乙為處理第10天的照片，丙為處理第16天的照片；B為H202測定結(jié)果；C為電導(dǎo)率測定結(jié)果。結(jié)果表明處理前，轉(zhuǎn)空載體植株、株系1植株、株系4植株、株系10植株、株系16植株的株高分別為12.67cm、12.94cm、12.76cm、12.63cm、12.96cm;處理第10天，轉(zhuǎn)空載體植株、株系1植株、株系4植株、株系10植株、株系16植株的株高分別為13.67cm、14.98cm、14.66cm、15.23cm、15,67cm;處理第16天，轉(zhuǎn)空載體植株、株系1植株、株系4植株、株系10植株、株系16植株的株高分別為13.97cm、17.08cm、16.99cm、16.67cm、17.14cm。過量表達轉(zhuǎn)基因株系的生長狀況顯著優(yōu)于轉(zhuǎn)空載體植株。2、耐高溫試驗將幼苗連同營養(yǎng)缽一起置于光照培養(yǎng)箱中。光照16h，42°C;黑暗8h，36'C。觀察轉(zhuǎn)空載體對照植株和過量表達轉(zhuǎn)基因植株的生長情況，處理后第10天和第16天分別采集照片，16天后測定電導(dǎo)率和&02含量。結(jié)果見圖7，圖7中，A為采集的照片，其中，甲為處理前的照片，乙為處理第10天的照片，丙為處理第16天的照片；B為H202測定結(jié)果；C為電導(dǎo)率測定結(jié)果。結(jié)果表明處理前，轉(zhuǎn)空載體植株、株系1植株、株系4植株、株系10植株、株系16植株的株高分別為11.98cm、12.04cm、11.87cm、12.01cm、12.14cm;處理第10天，轉(zhuǎn)空載體植株、株系1植株、株系4植株、株系10植株、株系16植株的株高分別為12.04cm、13.56cm、15.31cm、13.25cm、14.89cm;處理第16天，轉(zhuǎn)空載體植株、株系1植株、株系4植株、株系10植株、株系16植株的株高分別為12.67cm、15.53cm、17.56cm、16.03cm、17.99cm。過量表達轉(zhuǎn)基因株系的生長狀況顯著優(yōu)于轉(zhuǎn)空載體植株。3、抗旱試驗將轉(zhuǎn)空載體對照植株和過量表達轉(zhuǎn)基因植株的幼苗處于相同生長條件下，一次性澆足水后停止?jié)菜?，并測量土壤含水量，保證過量表達植株和對照的土壤含水量基本一致，觀察轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因的區(qū)別，處理后第10天和第16天分別采集照片，16天后測定電導(dǎo)率和H202含量。結(jié)果見圖8，圖8中，A為采集的照片，其中，甲為處理前的照片，乙為處理第10天的照片，丙為處理第16天的照片；B為HA測定結(jié)果；C為電導(dǎo)率測定結(jié)果。結(jié)果表明處理前，轉(zhuǎn)空載體植株、株系1植株、株系4植株、株系10植株、株系16植株的株高分別為12.04cm、12.47cm、11.98cm、12.05cm、12.5cm;處理第10天，轉(zhuǎn)空載體植株、株系1植株、株系4植株、株系10植株、株系16植株的株高分別為14.24cm、14.67cm、14.98cm、14.88cm、15.23cm;處理第16天，轉(zhuǎn)空載體植株、株系1植株、株系4植株、株系10植株、株系16植株的株高分別為14.24cm、16.87cm、15.86cm、15.69cm、19.03cm。過量表達轉(zhuǎn)基因株系的生長狀況顯著優(yōu)于轉(zhuǎn)空載體植株。4、抗鹽試驗將轉(zhuǎn)空載體植株和過量表達轉(zhuǎn)基因植株的幼苗同時置于NaCl含量為200mM的MS液體培養(yǎng)基中，處理后IO天和16天分別采集照片，并于第16天結(jié)束時，取葉片測定其電導(dǎo)率和HA含量。結(jié)果見圖9，圖9中，A為采集的照片，其中，甲為處理前的照片，乙為處理第10天的照片，丙為處理第16天的照片；B為HA測定結(jié)果；C為電導(dǎo)率測定結(jié)果。結(jié)果表明處理前，轉(zhuǎn)空載體植株、株系1植株、株系4植株、株系10植株、株系16植株的株高分別為12.14cra、11.89cm、11.96cm、12.15cm、12.32cm;處理第10天，轉(zhuǎn)空載體植株、株系1植株、株系4植株、株系10植株、株系16植株的株高分別為13.14cm、15.11cm、14.78cm、13.31cm、14.23cm;處理第16天，轉(zhuǎn)空載體植株、株系1植株、株系4植株、株系10植株、株系16植株的株高分別為13.53cm、16.97cm、16.36cra、17.01cm、16.69cm，過量表達轉(zhuǎn)基因株系的生長狀況顯著優(yōu)于轉(zhuǎn)空載體植株。五、不同濃度鹽脅迫條件下種子的萌發(fā)試驗將L代轉(zhuǎn)空載體對照植株(NT)的種子和L代過量表達轉(zhuǎn)基因植株4、10和16號株系的種子用次氯酸鈉滅菌30分鐘，無菌水沖洗7遍，然后播種在MS、MS+100mMNaCl和MS+200mMNaCl的固體培養(yǎng)基中，一周后觀察種子生長，采集照片。每個株系設(shè)6個重復(fù)，結(jié)果見圖IO。結(jié)果表明過量表達轉(zhuǎn)基因株系的萌發(fā)狀況顯著優(yōu)于轉(zhuǎn)空載體植株。序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所<120>—種植物抗逆蛋白MASTER及其編碼基因的應(yīng)用<130〉CGGNARY81589〈160〉4<210〉1<211〉251〈212〉PRT<213>稻屬水稻(Qrj^aL.)〈400〉1MetGlySerLysSerTyrProThrValSerAspGluTyrLeuAlaAla151015ValGlyLysAlaLysArgLysLeuArgGlyLeulieAlaGluLysAsn202530CysAlaProLeuMetLeuArgLeuAlaTrpHisSerAlaGlyThrPhe354045AspValSerSerArgThrGlyGlyProPheGlyThrMetLysAsnPro505560GlyGluGinSerHisAlaAlaAsnAlaGlyLeuAsplieAlaValArg65707580LeuLeuAspProlieLysAspGinLeuProlieLeuSerTyrAlaAsp859095PheTyrGinLeuAlaGlyValValAlaValGluValThrGlyGlyPro100105110<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>gctggcgttgtggccgtcgaggtcaccggcggacctgsggtccccttccatccgggcagg360caggacaagcctgagcctcctcctgaaggccgtcttcctgatgccacacaaggttctgac420cacctaaggcaggtcttttctgcgcagatgggtttgagtgacaaggacatagttgctctt■tctggtggtcacaccctgggaagatgccacaaggsg卿tctggctttgagggagcctgg540acgtccaaccctttgatctttgacaactcttacttcaccgagcttgtgagtggcg卿ag600gaaggccttcttcagctgcc33gtga_ca_a_3gccctcatggctgacccagccttccgtcca660ctggtggaga肌tatgctgcggatgaggacgccttctttgcggattacgccgaggcccac720ctcaagctctctgaactgggatttgctgagg犯ta3756〈210〉3〈211〉870〈212〉腿<213>稻屬水稻(Qrj^asaz^'raL.<■〉3gggattgattgattgattcggattgggaagaagaagaagcaggggagcatgggcagcaag60tcgtacccgacggtgagcgEitgagtacctggcggccgtgggc肌ggcg犯gcgcaagctc120cgcggcctcatcgccgagaagaactgcgccccactcatgctccgcctcgcgtggcactct180gctggcaccttcgatgtgtcgtcgaggaccggcgggcccttcggcaccatgaagaacccc240ggcgagcagtcccacgccgccaacgccggcctcgacatcgccgtcaggcttctcgacccc300atcaaggaccaacttcccatcctctcctacgccgacttctaccagcttgctggcgttgtg360gccgtcgaggtcaccggcggacctgaggtccccttccatccgggcaggcaggacaagcct420gagcctcctcctgaaggccgtcttcctgatgccac3C33ggttctgaccacctaaggca_g■gtcttttctgcgcagatgggtttgagtgacaaggeicatagttgctctttctggtggtcac540sccctgggaagatgccacaaggagagatctggctttgagggagcctggacgtccaaccct600ttgatctttgacaactcttacttcaccgagcttgtgagtggcgagaaggaaggccttctt660cagctgccaagtg3C犯3gCcctcatggctgacccagccttccgtccactggtgg卿aa720tatgctgcggatgaggacgccttctttgcggattacgccgaggcccacctcaagctctct780gaactgggatttgctgagga3tasg犯gccttt3g3g3gCgggatatccgcaaaagatta840atgccgatttgtattttgcgccttagagtc870〈211〉1917<212〉DNA〈213〉稻屬水稻(Crj^asafiraL.)〈400〉4atgggcagcsagtcgtacccgacggtgagcgatg3gt3CCtggcggccgtgggcaaggcg60aagcgcdagctccgcggcctcatcgccg3g3agaactgcgccccactcatgctccgcctc120gcgtaactttcttcttxttcttcttctactgattaatttccagaagatagagtaggagga180gt卿tgttg^ttgcagtggctggctggctgcaggtggcactctgctggcaccttcgat240gtgtcgtcgagg織ggcgggcccttcggcaccccggcgagcagtcccac300gccgcc犯cgccggcctcgacatcgccgtcaggcttctcg3cccca^ca^ggaccaactt360cccatcctctcctacgccgacttctaccaggtaaggttcacttccctcccttcctccctt420ccttcctctcaactcatcaacctcttaattggagtctxtccctctctattggcagcttgc480tggcgttgtggccgtcgaggtcaccggcggacctgaggtccccttccatccgggcaggca540gg"tc已g犯tcacatttcccatccctaaaccctctccctctctctccccccttcttctttc600ttxttctggta^tgcaa^tggtatttttctt犯gtcaattcttttctttcgtcatcttg660tacgccgctg"tttcctttccctgaattctccactgtcttgtg^tgttg3tgatgtgatg720tgtttgtttcctgagcctcctcctgaaggccgtcttcctgatgccacaca780a<ggtatta￡Lgatttcctctgtatt犯gttacccctatgacaatgcatttcccaatgtgtt840ggtgattaaattttctagatctatgaccagcatttgtatgtgctactgatggagtagttc900atattgc犯gtccattaccagaattctttxatgcttaagt犯gttgtgtsacctacataa960gactddaattttccaaccctgtttatgcaaaccacattactaaagtttgttttgtgttcc1020tgtttattcttctttcttat9"tgga_gc3ta<catgttacctgtgtgttctttaattaacag1080tgtgccaatttgtggatgcgtatgtcatggtcttctggctgttggtccag1140gttctgaccacctaeLggcaggtcttttctgcgcagatgggtttgagtgacaaggacatag1200ttgctctttctggtggtcacaccctggttggtacacttgtgcaattgccctagtgtgttt1260ctcatatcttgt犯ccggaagggttattcatgcagcttcacttcatcttctgtagggaag1320stgcca^agg卿gatctggctttgagggagcctggacgtccaaccctttgatctttga1380caactcttac"ttcacgtgcgtgatctctgataaacagccagccacagcttgtttccttgttcgatc犯c3gcggigcttgtga^gtggcgagaaagccctcatggctgacccagccttccgtcccttgatccttgcattattttctctcgtcaaaagaaataagagaaatggatcatcgttgatatgtaggatgaggacgccttctttgcgg認(rèn)tggggtaagggatgcaactggtgtgctgccagagtttcactaattattgttgtgtttttctttttaaagatgcatcctgtctgttga1440atgctaaagaatgaaaaccaaaatctcctc1500aagg^ggccttcttcagctgccaagtgac1560ccactggtggagaaatatgc1620ttctttctaaagagttgtttttttta^8t1680atxtcttaaaa^gtagatgattgttgcctg1740attacgccgaggcccacctcaagctctctg1800tgtctgtgatgcgttattggagtgctttgt1860gtgggUtcagatttgctgagga^taa191權(quán)利要求1、一種蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。2、權(quán)利要求l所述蛋白的編碼基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述蛋白編碼基因為如下l)或2)或3)或4)的DNA分子1)其編碼序列是序列表中序列2所示的DNA分子；2)其編碼序列是序列表中序列4所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與l)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；4)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。4、用于擴增權(quán)利要求2或3所述基因或所述基因中的任一DNA片段的引物對。5、含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體如圖3所示。7、一種培育抗逆植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述基因?qū)胫参锛?xì)胞中，得到抗逆植物。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2或3所述基因通過權(quán)利要求5或6所述的重組表達載體導(dǎo)入植物細(xì)胞中。9、根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述抗逆植物為抗低溫和/或抗高溫和/或抗寒和/或抗鹽的植物。10、根據(jù)權(quán)利要求7至9中任一所述的方法，其特征在于所述植物為水稻。全文摘要本發(fā)明公開了一種植物抗逆蛋白MASTER及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的蛋白是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。將本發(fā)明蛋白的編碼基因通過重組表達載體導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官，再將被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官培養(yǎng)成植株，可以得到對干旱、鹽脅迫、低溫和高溫的抗性增強的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的蛋白及其編碼基因?qū)τ谥参锟鼓嫘詸C制的研究，提高植物的抗逆性及相關(guān)性狀的改良具有重要的理論及實際意義，在作物的改良工作中具有良好的應(yīng)用前景。文檔編號C12N5/10GK101333250SQ20081011802公開日2008年12月31日申請日期2008年8月6日優(yōu)先權(quán)日2008年8月6日發(fā)明者吳金霞,孫學(xué)輝,張治國,路鐵剛,霞鄭申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所