專利名稱：：一種培養(yǎng)蘭花的方法及其專用菌株的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)蘭花的方法及其專用菌株。
背景技術(shù)：
：蘭科植物是植物界最大的類群之一，廣泛分布于溫帶、亞熱帶及熱帶區(qū)域，其中多數(shù)種是名貴藥用植物和著名的觀賞花卉。蘭花集觀賞和藥用于一身，不僅擁有廣大愛好者，而且還成為中國傳統(tǒng)文化的一個重要組成部分——蘭花文化。蘭科植物是典型的內(nèi)生菌根植物，通過與其共生的菌根真菌菌絲從周圍環(huán)境中吸收礦質(zhì)營養(yǎng)和水分等，再通過菌絲內(nèi)部的原生質(zhì)環(huán)流快速地將營養(yǎng)轉(zhuǎn)運到蘭花根系內(nèi)部，從而為其生長提供所需。蘭花本身還可以通過消解侵染到其細胞內(nèi)部的菌根真菌菌絲來吸收營養(yǎng)。菌根真菌能夠增加蘭花植株的抗性，增強其根的吸收能力。因此，蘭花的正常生長發(fā)育離不開菌根真菌。近年來，隨著蘭花市場需求的日益增長，蘭花組織培養(yǎng)技術(shù)迅速發(fā)展。但是，目前的問題是，組培苗移栽后的成活率低，生長緩慢，開花遲緩，花小甚至不開花，這嚴重影響了后續(xù)的蘭花成活數(shù)量，從而不能滿足市場的需要。存在以上問題的根本原因在于蘭花組培苗的菌根化技術(shù)不成熟，具體如下一、缺少優(yōu)良的與蘭花共生的菌根真菌，不能形成有效的菌根，導致蘭花營養(yǎng)吸收的匱乏；二，缺少有效的菌根真菌接種菌劑，接種后不能保證真菌的營養(yǎng)來源，需多次接種，對蘭花苗的根系破壞較大；三，接菌時機及接菌量不容易控制，易造成人為接種導致的蘭花苗死亡現(xiàn)象。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一株菌，該菌可用于蘭科植物的培養(yǎng)。本發(fā)明所提供的菌株為瘤菌根菌(^Wor力^a)GDB181。該菌株GDB181已于2008年07月03日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心地址是北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編是100101，保藏編號為CGMCCNo.2574。本發(fā)明所提供的菌株GDB181屬于瘤菌根菌屬(fp^02^^s)，其菌絲為有隔菌絲，隔間距長，隔膜明顯，近直角分枝，分支處部分縊縮，菌絲直徑約3.46-3.79Um，為多核菌絲；菌落白色近無色，正反面顏色一致，較稀疏，不易觀察，菌落邊緣不規(guī)則，菌絲稍長且向外延伸，老菌絲打結(jié)，占的面積較大，氣生菌絲較多白色巻曲。本發(fā)明的又一個目的是提供一種培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基可用于培養(yǎng)瘤菌根菌。本發(fā)明所提供的瘤菌根菌培養(yǎng)基，是由PDA液體培養(yǎng)基、蛭石和支持物組成；所述支持物可以是胡桃科植物樹葉剪成的面積為20-30mm2的塊狀物；所述PDA液體培養(yǎng)基、所述蛭石和所述支持物的體積比可以為0.8-1.2:1-2:0.5-1.5;優(yōu)選為1:1:1;所述胡桃科植物具體可以是胡桃、楓楊或黃杞。每升所述PDA液體培養(yǎng)基是由200g去皮馬鈴薯、20g葡萄糖和1L水組成。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培養(yǎng)基質(zhì)，該基質(zhì)可用于蘭科植物的培養(yǎng)。本發(fā)明所提供的蘭科植物培養(yǎng)基質(zhì)，是由沙子、蛭石和苔蘚組成；所述沙子、所述蛭石和所述苔蘚的體積比可以為0.5-1:0.8-1.2:1-2，優(yōu)選為1:1:1。其中，苔蘚具有透氣和保持水份的功能，蛭石有透水性，沙子有一定的保水性。本發(fā)明的最后一個目的是提供一種培育蘭科植物的方法。本發(fā)明所提供的培育蘭科植物的方法，是將上述瘤菌根菌(fpWoi^fzs印.)GDB181與蘭科植物的根共培養(yǎng)。在所述共培養(yǎng)中，可以使用上述蘭科植物培養(yǎng)基質(zhì)。在所述共培養(yǎng)中，可以通過調(diào)節(jié)接種時所述菌與所述植物根的距離，來控制所述菌侵染所述組培苗根的時機，具體可以在共培養(yǎng)起始時，將菌放置在距離所述蘭科植物根l-3cm處，優(yōu)選為1.5-2cm處。所述菌具體可以是用上述瘤菌根菌培養(yǎng)基在25-27。C的溫度下避光培養(yǎng)10-20天后得到的位于支持物上的菌；每條所述蘭科植物根所對應的所述支持物的面積可以為20-60mm2，所述支持物的面積優(yōu)選為25mm2。所述共培養(yǎng)過程中要補充營養(yǎng)液；所述營養(yǎng)液具體是由終濃度為120mg/L的Ca(N03)2，終濃度為80mg/L的(NH4)2S04，終濃度為100mg/L的KH2P04，終濃度為50mg/L的MgS04，終濃度為0.5mg/L的H肌終濃度為0.17mg/L的MnS04，終濃度為0.28mg/L的ZnS04，終濃度為0.025mg/L的CuS04，終濃度為1.1mg/L的FeC6'H507組成，用水定容。補充營養(yǎng)液的方法為常規(guī)方法即可，如葉面噴灑、根部灑施等，補充營養(yǎng)液的次數(shù)及頻率可因苗的大小、生長情況等靈活選擇。所述共培養(yǎng)的條件為溫度為25-27°C、濕度為75-85%、光強為2000-3000Lux、光照明暗周期為12—14h光照/10-12h黑暗；所述溫度優(yōu)選為25t:、所述濕度優(yōu)選為85%、所述光強優(yōu)選為2000Lux、所述光照明暗周期優(yōu)選為14h光照/10h黑暗。上述方法適合于一般的蘭花的培養(yǎng)，具體可如春蘭(Q^6W"mgoen7^7)。本發(fā)明菌株適合于蘭花菌根化培養(yǎng)，是與蘭花建立有效共生的優(yōu)良菌根真菌菌株。本發(fā)明的瘤菌根菌培養(yǎng)基質(zhì)地疏松，透氣性好，營養(yǎng)分布均勻，適合菌絲生長和蔓延，是培養(yǎng)菌根真菌的最佳培養(yǎng)基，而且在人工接種組培苗的時候可以有效控制接種量。本發(fā)明的盆栽蘭花的基質(zhì)成本低、原料易于獲得，還具有疏松、透氣透水性好、保水能力強的特點，在接菌的時候能很好的支撐和固定染菌菌支持物，使接菌位置保持不變，有利于以后內(nèi)生真菌對蘭花根部的入侵和建立共生關系，而且能與蘭花幼嫩的根緊密結(jié)合，使蘭花從基質(zhì)中吸收到水分等營養(yǎng)。本發(fā)明培養(yǎng)蘭花的方法，能很好的控制接種量，并能固定接種位置，充分保證了蘭花組培苗與優(yōu)良菌根真菌建立共生關系，同時還簡化了接種步驟，減少了接種次數(shù)，接種一次就可達到一勞永逸，避免了人為多次接種造成的死苗現(xiàn)象，從而提高了移栽的成活率，得到了生長旺盛健壯的菌根化蘭花苗。因此，本發(fā)明菌株、菌培養(yǎng)基、蘭花培養(yǎng)基質(zhì)及蘭花培養(yǎng)方法具有重要的經(jīng)濟價值，適合于推廣應用。圖1為菌株GDB181CGMCCNo.2574的生長情況。圖2為接菌后苗的生長情況。圖3為未接菌的苗的生長情況。圖4為接菌與未接菌苗的對比。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法，如無特殊說明均為常規(guī)方法。實施例1、利用組培苗菌根化技術(shù)培養(yǎng)蘭花實施例中用到的蘭花營養(yǎng)液的組成如下Ca(N03)2120mg/L，(MI4)2S0480mg/L，KH2P04100mg/L，MgS0450mg/L，H3B030.5mg/L，MnS040.17mg/L，ZnS040.28mg/L，CuS040.025mg/L，F(xiàn)eC6H5071.1mg/L，其余為水。一、菌的分離及培養(yǎng)1、菌的分離從采自安徽岳西的蕙蘭(0^力fW咖/WeW)中分離菌株GDB181，其方法如下選取長勢健壯旺盛的野生蕙蘭的新鮮營養(yǎng)根段，流水沖洗掉根表面的泥土和腐殖質(zhì)后，在超凈工作臺上將根段浸入ly。的次氯酸鈉(NaC10)溶液中8-10min進行表面滅菌，然后用無菌水沖洗4-5次，將根段切成2-3Mn的薄片，放置在1/5的PDA培養(yǎng)基上，25-27。C避光培養(yǎng)，待菌絲從根片中長成菌落后，挑取菌絲轉(zhuǎn)移至PDA培養(yǎng)基上進行純化，沒有污染，轉(zhuǎn)入PDA斜面培養(yǎng)基，4"C短期保存。每升1/5PDA培養(yǎng)基是由40g去皮馬鈴薯、4g葡萄糖、5-6g瓊脂和1L水組成。本發(fā)明所提供的菌為瘤菌根菌(f/w7o/^z'M邵.)GDB181。該菌株GDB181已于2008年07月03日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心地址是北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編是100101，保藏編號為CGMCCNo.2574。2、菌的培養(yǎng)(1)一級菌種培養(yǎng)將保存在斜面培養(yǎng)基上的菌株GDB181移接到PDA平板培養(yǎng)基上，25-27"避光培養(yǎng)，待菌絲長滿平板后作為一級菌種。(2)二級菌種培養(yǎng)將充分生長的一級菌種接種到二級菌種培養(yǎng)基上，25-27'C避光培養(yǎng)，定期觀察記錄，待菌絲長滿整個培養(yǎng)基后轉(zhuǎn)入冰箱保存?zhèn)溆?。二級菌種培養(yǎng)基是由楓楊樹葉、蛭石和PDA液體培養(yǎng)基組成，其體積配比為1:1:1;二級菌種培養(yǎng)基的制備方法如下采集新鮮的楓楊樹葉，洗凈，剪成5X5mm的小塊，滅菌lh;蛭石沖洗干凈，滅菌2h;然后將1L的剪成5X5腿的新鮮幼嫩楓楊樹葉與1L蛭石混合均勻后，邊攪拌邊加入1LPDA液體培養(yǎng)基，混勻后，滅菌30min。結(jié)果表明，二級菌種的培養(yǎng)中，菌很快從接種點向四周蔓延，半個月后，菌絲已布滿整個培養(yǎng)基中的蛭石和楓楊樹葉(圖l)。二、蘭花的培養(yǎng)本實施例中以春蘭(6y歷Z^^哪卵eri/^ii)的組培苗為實驗材料，組培苗是按照常規(guī)方法獲得的。本實施例中所用的蘭花的盆栽基質(zhì)是由河砂、蛭石和苔蘚組成，其體積比為1:1:1;該基質(zhì)的配制方法為將苔蘚充分浸泡，擰干，剪成l-2cra長的小段；將約1L河砂和1L蛭石混合均勻，然后加入lL的剪成l-2cm的小段苔蘚，充分攪拌混勻(可用特定大小的容器量取上述基質(zhì))，裝袋密封，滅菌2h，在無菌條件下分裝到花盆中。蘭花培養(yǎng)方法如下煉苗將待移栽的組培苗從恒溫光照培養(yǎng)室移到光照較弱，溫度為18—2(TC的環(huán)境培養(yǎng)l周左右，出瓶前24—48h打開封口膜。盆栽從瓶中取出組培苗洗去粘附在根上的瓊脂，然后在無菌條件下栽入蘭花盆栽基質(zhì)中，每盆4株，25。C恒溫培養(yǎng)，光照強度為2000Lux，光照明暗周期為14h光照/10h黑暗，每天向苗的葉面噴灑蒸餾水，保持室內(nèi)濕度在85%以上，定植2周后開始補充營養(yǎng)液，每隔半個月補充一次，每次每株定量10ml，定期觀察記錄。待苗適應外部環(huán)境后(大約一個月)，進行接菌。接菌選取按照步驟一2中菌培養(yǎng)方法培養(yǎng)菌GDB181，培養(yǎng)10-20天后，培養(yǎng)基中的楓楊樹葉上有菌，將約5X5mm的方形楓楊樹葉，放置在距苗新鮮營養(yǎng)根1.5-2cm處，每條根各放1-2片樹葉，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上，定期觀察記錄。同時以不接菌的組培苗為對照。培養(yǎng)6個月后，將苗取出并再次稱重，計算平均鮮重增長率。平均鮮重增長率(。/。)"處理后鮮重一處理前鮮重)X100/處理前鮮重。每種處理重復3次。三、結(jié)果1、組培苗接菌后的生長狀況組培苗在基質(zhì)中生長勢一直很旺盛，葉色翠綠，葉舒展，總體很健壯，高生長迅速，舊根伸長生長明顯，僅在舊根的中上部形成角質(zhì)層，產(chǎn)生大量新生根，新伸長的根嫩綠色，有的根先端出現(xiàn)分叉(圖2，圖4A)，死亡率低；未接菌的對照苗生長緩慢，高生長不明顯，外圍葉發(fā)黃干枯，新生根極少(圖3和圖4B)。圖4A為接菌苗，圖4B為未接菌苗。2、接菌后的春蘭苗生長量(即成活率和鮮重增長率)的變化對接菌并培養(yǎng)6個月后的春蘭蘭花苗及對照(未接菌的春蘭苗)進行生長量的測定，成活率ft卜處理后植株數(shù)X100/處理前植株數(shù)；平均鮮重增長率(%)=(處理后鮮重一處理前鮮重)X100/處理前鮮重；再對接菌苗的營養(yǎng)根進行重分離。實驗設3次重復，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果如表l所示，表明接菌的蘭花苗的成活率高于對照，平均鮮重增長率高于對照，應用SPSS統(tǒng)計軟件分析，與對照差異己達到顯著水平；并且接菌苗的營養(yǎng)根重分離獲得了原接種菌株GDB181。表l、菌株對蘭花組培苗生長量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注*含量低3F檢測線未檢出，**含量高于檢測會l未檢出。綜上表明，GDB181菌株接種的春蘭盆栽苗，不僅生長勢旺盛，苗色翠綠，葉舒展健壯，新生根多，根系發(fā)達，在苗生物量和各礦質(zhì)元素含量上也有明顯提高；重分離基本獲得原接種菌株，它是春蘭在盆栽條件下的共生菌根真菌。菌根真菌還誘導蘭花產(chǎn)生大量新根，不僅有利于真菌的大量入侵，而且蘭花也能吸收到更多的菌提供的營養(yǎng)，從而達到互惠互利的共生目的。權(quán)利要求1、瘤菌根菌(Epulorhizasp.)GDB181，其保藏編號為CGMCCNo.2574。2、一種瘤菌根菌培養(yǎng)基，由PDA液體培養(yǎng)基、蛭石和支持物組成；所述支持物是胡桃科植物樹葉剪成的面積為20-30nrai2的塊狀物；所述PDA液體培養(yǎng)基、所述蛭石和所述支持物的體積比為0.8-1.2:1-2:0.5-1.5;優(yōu)選為1:1:1;所述胡桃科植物是胡桃、楓楊或黃杞。3、一種蘭科植物培養(yǎng)基質(zhì)，由沙子、蛭石和苔蘚組成；所述沙子、所述蛭石和所述苔蘚的體積比為0.5-1:0.8-1.2:1-2，優(yōu)選為1:1:1。4、一種培育蘭科植物的方法，是將權(quán)利要求1所述菌與蘭科植物的根共培養(yǎng)。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述共培養(yǎng)中使用權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基質(zhì)。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述共培養(yǎng)起始時，所述菌放置在距離所述蘭科植物根1-3cm處。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述菌是用權(quán)利要求2所述培養(yǎng)基在25-27。C的溫度下避光培養(yǎng)10-20天后得到的位于支持物上的菌；每條所述蘭科植物根所對應的所述支持物的面積為20-60mm2。8、根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于所述共培養(yǎng)過程中要補充營養(yǎng)液；所述營養(yǎng)液由終濃度為120mg/L的Ca(N0》2，終濃度為80mg/L的(NH4)2S04，終濃度為100mg/L的KH2P04，終濃度為50mg/L的MgS04，終濃度為0.5mg/L的H3B03，終濃度為0.17mg/L的MnS04，終濃度為0.28mg/L的ZnS04，終濃度為0.025mg/L的CuS04，終濃度為1.1mg/L的FeC6，H507組成，用水定容。9、根據(jù)權(quán)利要求4-8中任一所述的方法，其特征在于所述共培養(yǎng)的條件為溫度為25-27°C、濕度為75-85%、光強為2000-3000Lux、光照明暗周期為12—14h光照/10-12h黑暗；所述溫度優(yōu)選為25。C、所述濕度優(yōu)選為85%、所述光強優(yōu)選為2000Lux、所述光照明暗周期優(yōu)選為14h光照/10h黑暗。10、根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一所述的方法，其特征在于所述蘭科植物為春蘭(Cjm6/(i/w附goen力g77)。全文摘要本發(fā)明公開了一種培育蘭科植物的方法及其專用菌株。本發(fā)明菌株名稱為GDB181，保藏編號為CGMCCNo.2574。本發(fā)明方法包括將本發(fā)明菌株與所述蘭科植物根共培養(yǎng)的步驟。本發(fā)明菌株適合于蘭花菌根化培養(yǎng)，是與蘭花建立有效共生的優(yōu)良菌根真菌菌株。本發(fā)明培養(yǎng)蘭花的方法，能很好的控制接種量，并能固定接種位置，充分保證了蘭花組培苗與優(yōu)良菌根真菌建立共生關系，同時還簡化了接種步驟，減少了接種次數(shù)，接種一次就可達到一勞永逸，避免了人為多次接種造成的死苗現(xiàn)象，從而提高了移栽的成活率，得到了生長旺盛健壯的菌根化蘭花苗。因此，本發(fā)明菌株、菌培養(yǎng)基、蘭花培養(yǎng)基質(zhì)及蘭花培養(yǎng)方法具有重要的經(jīng)濟價值，適合于推廣應用。文檔編號C12N1/20GK101338290SQ200810118128公開日2009年1月7日申請日期2008年8月12日優(yōu)先權(quán)日2008年8月12日發(fā)明者暉丁,輝金,韓素芬申請人:輝金