專利名稱：一種橡膠樹花藥愈傷組織玻璃化超低溫保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種橡膠樹花藥愈傷組 織玻璃化超低溫保存方法。
背景技術(shù)：
橡膠樹是多年生高大喬木，異花授粉，在遺傳上高度雜合，使得 橡膠樹的育種難度加大。生產(chǎn)上橡膠樹種植材料一般有兩種， 一是實(shí) 生樹，二是芽接樹。芽接樹個(gè)體間產(chǎn)量變異小、產(chǎn)量高、性狀一致， 但抗逆性較弱。實(shí)生樹個(gè)體間產(chǎn)量變異大、產(chǎn)量低、性狀不一致，但 抗逆性較強(qiáng)。目前生產(chǎn)上橡膠樹種植基本上是用芽接樹。橡膠樹選育 種按照常規(guī)育種程序，采用多代自交的辦法，時(shí)間長(zhǎng)且難以得到純合 的植株。
通過橡膠樹花藥組織培養(yǎng)，誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生、植株再生和進(jìn)行擴(kuò) 繁，獲得自根無性系，為培育橡膠樹產(chǎn)量高、抗逆性強(qiáng)而生長(zhǎng)快的優(yōu) 良品種，提供了新的技術(shù)手段和方法。
采用推廣品種花藥培養(yǎng)獲得的再生植株，起源于花藥壁體細(xì)胞， 具有與母體無性系同樣的遺傳信息，帶有無性繁殖的芽接樹的優(yōu)良性
狀；同時(shí)，它們又是經(jīng)過脫分化和再分化過程，經(jīng)過和合子胚十分相 似的途徑發(fā)育，回復(fù)到幼態(tài)，因而又帶有實(shí)生樹的優(yōu)良性狀。經(jīng)過多 年的橡膠樹田間栽培實(shí)驗(yàn)表明，花藥體細(xì)胞植株的表現(xiàn)型與母本植株 一致。因此，花藥體細(xì)胞植株是一種幼態(tài)自根無性系，能夠集芽接樹 和實(shí)生樹的優(yōu)點(diǎn)于一體，而且不受砧木對(duì)接穗的不良影響，能表現(xiàn)出 產(chǎn)量高、生長(zhǎng)快、抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性廣、經(jīng)濟(jì)壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，是一種 很有發(fā)展前途的新一代種植材料，具有廣闊的應(yīng)用前景。
在植物組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)胚性材料胚性 降低、體細(xì)胞無性系變異機(jī)率增加等問題；而且在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行較大 規(guī)模組織培養(yǎng)時(shí)，材料較多，管理難度加大。目前，花藥培養(yǎng)植株再
生頻率還不高， 一般為1~3%,即100個(gè)花藥出苗僅1~3株。
至今，橡膠樹進(jìn)行超低溫冷凍保存的研究還很少。1997年 Engdmami等研究了胚性愈傷組織的超低溫保存，保存后的胚性愈傷 組織解凍后可獲得體細(xì)胞胚，但未能獲得再生植株。2007年，法國(guó)農(nóng) 業(yè)研究國(guó)際合作中心(CIRAD)的Larde傳對(duì)從橡膠樹幼嫩種子內(nèi)株 被來源的愈傷組織成功地進(jìn)行了液氮超低溫冷凍保存，并獲得再生植 株，但他們釆用了程序降溫的處理過程。他們使胚性愈傷組織及其環(huán) 境溫度每分鐘下降0.2'C,當(dāng)溫度降至-4(TC,再投入液氮中保存，操 作不便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用液氮玻璃化超低溫方法保存巴西 橡膠樹花藥愈傷組織方法，該方法可長(zhǎng)期保存巴西橡膠樹優(yōu)良材料遺 傳資源，實(shí)現(xiàn)橡膠樹優(yōu)良種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存，為生物技術(shù)育種提供新途徑。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明所述橡膠樹花藥愈傷組織玻璃化超 低溫保存方法，包括如下步驟
1) 預(yù)培養(yǎng)將花藥愈傷組織接種到預(yù)培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)2 3天， 培養(yǎng)溫度為25~28°C;
2) 裝載然后在室溫下用60。/。的PVS2(玻璃化溶液)處理花藥 愈傷組織10~30分鐘；
3) 脫水及凍存脫水處理后，在0°。下用PVS2 (玻璃化溶液) 處理20 40分鐘，并去除玻璃化溶液，最后再重新加入玻璃化溶液， 于液氮中保存。
本發(fā)明所述的花藥愈傷組織為胚性愈傷組織，是在橡膠樹處于盛 花期的春、夏兩個(gè)花季，選取高產(chǎn)和性狀優(yōu)良的橡膠樹的花，選用花
粉發(fā)育狀態(tài)為單核期、少數(shù)為雙核期的花藥，在胚性愈傷組織誘導(dǎo)培 養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)出胚性愈傷組織。
本發(fā)明所述預(yù)培養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基中添加2,4-D(2，4-二氯苯 氧乙酸)1.0 ~ 3.0mg/L、KT( 6-糠氨基嘌呤，又名激動(dòng)素)1.0 ~ 3.0mg/L、 NAA (萘乙酸)1.0~3.0mg/L、 Phytagel (植物凝膠)2.0~3.0g/L、 蔗糖50.0~90.0g/L、 二甲基亞砜(DMSO) 5 ~ 10%(體積百分含量)。
本發(fā)明中用改良MS培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并將 MS培養(yǎng)基中的無水氯化鉤、磷酸二氫鉀、四水硫酸錳、七水硫酸鎂 的含量調(diào)整為無水氯化鉤150 ~ 400mg/L、磷酸二氫鉀300 - 450mg/L、 四水硫酸錳15 ~ 40mg/L、七水硫酸鎂400 ~ 600mg/L。
所述PVS2溶液由28 32。/。的甘油(Gly)、 12 ~ 18。/。己二醇(EG)、 12~18%的二甲基亞砜(DMSO)和136.9 g/L ( 0.4mol/L )的蔗糖所 組成。其中含量為體積百分含量。
60。/。PVS2溶液為含34.2 ~ 68.4 g/L (0.1 ~ 0.2 mol/L)蔗糖的愈 傷組織繼代液體培養(yǎng)基(不加Phytagel)與PVS2溶液按體積比40:60 配制而成，所述繼代液體培養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基中添加2,4-D 1.0 ~ 3.0mg/L、 KT 1.0~3.0mg/L、 NAA 1.0 ~ 3.0mg/L、蔗糖34.2 ~ 68.4 g/L (0.1-0.2 mol/L )、椰子水40-90ml/L。
本發(fā)明的脫水處理可釆用本領(lǐng)域常用的方法進(jìn)行。
釆用本發(fā)明所述橡膠樹花藥愈傷組織的液氮玻璃化超低溫保存 方法，可長(zhǎng)期保存橡膠樹花藥愈傷組織，保存時(shí)間可達(dá)一天至幾年。 一般將橡膠樹花藥愈傷組織存放在凍存管中(聚丙烯材料，PP， polypropylene )，常用量為0.2g/管。
釆用本發(fā)明的超低溫保存方法保存的橡膠樹花藥愈傷組織，化凍 復(fù)蘇后可以經(jīng)過胚狀體發(fā)生途徑得到再生植株。
所述復(fù)蘇及植株再生方法，包括如下步驟
花藥愈傷組織經(jīng)過超低溫保存后，愈傷組織再培養(yǎng)時(shí)，須先進(jìn)行化凍處理，即復(fù)蘇處理。將液氮中保存的橡膠樹花藥愈傷組織于40。C
水洛中浸泡2 3分鐘，然后用洗滌液洗2次，每次10~12分鐘； 洗滌后，轉(zhuǎn)移到愈傷組織繼代培養(yǎng)基上，在25 28。C進(jìn)行暗培養(yǎng)2 3天；再繼代培養(yǎng)一次，培養(yǎng)20~30天后存活的花藥愈傷組織開始 生長(zhǎng)；再繼代一次，相同條件下培養(yǎng)40 60天。
所述洗滌液為改良MS培養(yǎng)基中附加2，4-D 1.0~3.0mg/L、 KT 1.0~3.0mg/L、 NAA 1.0 ~ 3,0mg/L、蔗糖342.3 ~ 410.8g/L (1.0~ 1.2mol/L)。
所述繼代培養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基中添加2，4-D 1.0 ~ 3.0mg/L、 KT l,0~3.0mg/L、 NAA 1.0~3.0mg/L、 Phytagel 2.0 — 3.0 g/L、蔗糖 50.0 ~ 90.0g/L、椰子水40 90ml/L。
繼代后的愈傷組織便可進(jìn)行胚狀體的誘導(dǎo)，其過程為將繼代后 的愈傷組織接種于胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在25-2纊C之間暗培養(yǎng)20-50天。20~50天后，緊實(shí)的愈傷組織表面出現(xiàn)了長(zhǎng)勢(shì)旺盛的乳白色 小胚狀體， 一個(gè)愈傷組織可分化一至數(shù)十個(gè)胚狀體，胚狀體可進(jìn)一步 發(fā)育。胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以改良MS培養(yǎng)基中添加6-BA (6-芐氨 基ff呤)0.5 ~ 2.0mg/L、 KT 0.5 ~ 3,0mg/L、 NAAO.l ~ 1.0mg/L、 GA3 (赤霉素)0.1 ~ 1.0mg/L、 Phytagel 2.0 ~ 3.0g/L、蔗糖50.0 ~ 90.0g/L、 活性碳1.0 ~ 2.0g/L、椰子水40 ~ 90ml/L。
植株再生是將成熟子葉型胚狀體轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)， 每只培養(yǎng)皿(9厘米直徑)放6個(gè)胚狀體，每天光照12小時(shí)，溫度 為25 28'C,培養(yǎng)20 60天后開始出苗。分化培養(yǎng)基為改良MS培 養(yǎng)基中添加KT0.5 ~4.0mg/L、NAAO.l ~ 1.0mg/L、GA3 0.1 ~ 1.0mg/L、 Phytagel 2.0 ~ 3.0 g/L、蔑糖50.0 ~ 90.0g/L、活性碳1.0 ~ 2.0g/L、椰子 水40 ~ 90ml/L。
本發(fā)明中用液氮玻璃化超低溫(-196°C)方法保存橡膠樹花藥愈 傷組織，具有設(shè)備簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)程序簡(jiǎn)化、操作方便、凍存效果和重復(fù) 性好等優(yōu)點(diǎn)。在液氮-196。C低溫下，橡膠樹花藥愈傷組織中所有細(xì)胞 的分裂和代謝活動(dòng)停止，材料在此過程中不會(huì)產(chǎn)生遺傳性狀的改變。 液氮玻璃化超低溫保存法是長(zhǎng)期、穩(wěn)定保存植物器官、組織和細(xì) 胞的有效方法。用這一方法可以長(zhǎng)期保存橡膠樹花藥愈傷組織，為生 物技術(shù)育種提供材料，為橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化創(chuàng)造條件。它能長(zhǎng)期保持優(yōu) 良種質(zhì)資源的遺傳的穩(wěn)定性，為基礎(chǔ)研究和生產(chǎn)應(yīng)用研究提供有價(jià)值 的種質(zhì)資源。釆用液氮玻璃化超低溫保存方法對(duì)橡膠樹花藥愈傷組織 進(jìn)行超低溫冷凍保存，以期為長(zhǎng)期保存橡膠樹優(yōu)良材料的遺傳資源提 供技術(shù)支持，具有廣闊的應(yīng)用前景。
玻璃化凍存法的基本原理是生物材料經(jīng)高濃度玻璃化保護(hù)劑處 理后，快速投入液氮保存，使保護(hù)劑和細(xì)胞內(nèi)水分來不及形成冰，或 冰晶沒有充分的時(shí)間生成，水由液相變?yōu)楣滔?，進(jìn)入一種人工的完全 玻璃化狀態(tài)。在玻璃化狀態(tài)時(shí)，水分子沒有發(fā)生重排，不產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和 體積的變化，因而不會(huì)由于機(jī)械損傷或溶液效應(yīng)，造成組織和細(xì)胞傷 害，使得細(xì)胞在化凍后仍保持活性。而且在液氮低溫下，細(xì)胞分裂和 代謝活動(dòng)停止，不會(huì)產(chǎn)生遺傳性狀的改變。在理論上，生物的組織或 細(xì)胞用液氮超低溫冷凍保存方法可保存無限長(zhǎng)的時(shí)間。
液氣超低溫保存是目前植物種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存的理想方法。在此 溫度(-196。C)下，活細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)代謝和生長(zhǎng)活動(dòng)幾乎完全停止，植 物材料處于穩(wěn)定的生物學(xué)狀態(tài)，不會(huì)產(chǎn)生遺傳性狀的改變和形態(tài)發(fā)生 潛能的喪失。近幾年發(fā)展較快的玻璃化法顯示出較傳統(tǒng)的緩慢降溫法 和二步法設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便和重演性好等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。 預(yù)先按要求配制好各種培養(yǎng)基和所需溶液。在春、夏兩個(gè)花季， 橡膠樹處于盛花期，選取高產(chǎn)和性狀優(yōu)良的橡膠樹的花，選用花粉發(fā) 育狀態(tài)為單核期、少數(shù)為雙核期的花藥?；ɡ儆?0%的漂白粉溶液或
0.1%的升汞溶液消毒10分鐘，經(jīng)無菌水沖洗4-6次，在無菌條件下取
出花藥，放在胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基添加2,4-D 1.0mg/L、 KT0.6mg/L、 NAA0.5mg/L、 Phytagel 2.5g/L、蔗糖70.0g/L、 椰子水70ml/L。)上培養(yǎng)，誘導(dǎo)出胚性愈傷組織。將愈傷組織轉(zhuǎn)至預(yù) 先按要求配制好的預(yù)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度在26士rC,暗培養(yǎng)3天。愈 傷組織預(yù)培養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基添加2，4-D 2.0mg/L、 KT 2.0mg/L、 NAA2.0mg/L、 Phytagel 2.5g/L、蔗糖70.0g/L、 DMS0 8。/。(體積百分 含量)。
把經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)后的花藥愈傷組織0.2g放入凍存管中，室溫下加入 60%的玻璃化溶液(PVS2)處理30分鐘。60。/。PVS2溶液的組成含 51.3g/L (0.15mol/L)蔗糖的愈傷組織繼代液體培養(yǎng)基與PVS2溶液按 體積比40:60配制。繼代液體培養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基中添加2,4-D 2.0mg/L、 KT2.0mg/L、 NAA 1.0mg/L、蔗糖5L3 g/L (O.15mol/L)、 椰子水80ml/L。
再把經(jīng)過上述處理的花藥愈傷組織進(jìn)行脫水處理，在(TC下加入 PVS2,處理40分鐘。然后移去原液，在此凍存管中加入新的PVS2保 護(hù)劑，迅速將其投入液氮罐中，冷凍1 7天。PVS2溶液由30。/。的甘油
(Gly)、 15。/o己二醇(EG)、 15%的二甲基亞砜(DMSO)和136.9 g/L
(0如1/L)的蔗糖所組成。
對(duì)超低溫保存后的花藥愈傷組織進(jìn)行再培養(yǎng)前必須經(jīng)過化凍處 理，把凍存管在4(TC水洛中浸泡3分鐘，進(jìn)行化凍。然后把花藥愈傷 組織用洗滌液洗2次，每次12分鐘。再培養(yǎng)時(shí)，將經(jīng)化凍洗滌后的愈 傷組織立即轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上，每只培養(yǎng)皿(9厘米直徑)放6塊愈 傷組織，暗培養(yǎng)2天；然后再繼代培養(yǎng)一次，培養(yǎng)溫度27士rC，培養(yǎng) 30天后存活的花藥愈傷組織開始生長(zhǎng)；再繼代一次，相同條件下培養(yǎng) 40天。洗滌液為改良MS培養(yǎng)基添加2,4-D2.0mg/L、 KT2.0mg/L、 NAA 2.0 mg/L、蔗糖376.5 g/L (1.1mol/L)。繼代培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為
基本培養(yǎng)基，且將MS培養(yǎng)基中的無水氯化鉤、磷酸二氫鉀、四水硫
酸錳、七水硫酸鎂的含量調(diào)整為無水氯化每300mg/L、磷酸二氫鉀350 mg/L、四水硫酸錳30mg/L、七水硫酸鎂500mg/L，同時(shí)添加2，4-D 2.0mg/L、 KT2.0mg/L、 NAA2.0mg/L、 Phytagel 2.5g/L、蔗糖70.0g/L、 椰子水70ml/L。
繼代后的愈傷組織進(jìn)行胚狀體的誘導(dǎo)，將愈傷組織接種于誘導(dǎo)培 養(yǎng)基，在27土rC暗培養(yǎng)20 50天。20~50天后，緊實(shí)的愈傷組織表面出 現(xiàn)了長(zhǎng)勢(shì)旺盛的乳白色小胚狀體， 一個(gè)愈傷組織可分化出一至數(shù)十個(gè) 胚狀體，胚狀體可進(jìn)一步發(fā)育成成熟子葉型胚狀體。胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng) 基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且將MS培養(yǎng)基中的無水氯化鈣、磷 酸二氫鉀、四水硫酸錳、七水硫酸鎂的含量調(diào)整為無水氯化鈣 300mg/L、磷酸二氫鉀350mg/L、四水硫酸錳30mg/L、七水硫酸鎂 500mg/L,同時(shí)添力口6-BA1.5mg/L、 KT1.5mg/L、 NAA0.5mg/L、 GA3 0.1mg/L、 Phytagel 2.5g/L、蔗糖70.0g/L、活性碳1.5g/L、椰子水70ml/L。
將成熟子葉型胚狀體轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，每天光照12
小時(shí)，溫度為27土rC，培養(yǎng)20 60天后開始出苗，為再生植株。分化
培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且將MS培養(yǎng)基中的無水氯化
錦、磷酸二氫鉀、四水硫酸錳、七水硫酸鎂的含量調(diào)整為無水氯化鈣
300mg/L、磷酸二氫鉀350mg/L、四水硫酸錳30mg/L、七水硫酸鎂
500mg/L,同時(shí)添加KT 2.0mg/L、 NAA 0.5mg/L、 GA3 0.5mg/L、 Phytagel
2.5g/L、蔗糖70.0g/L、活性碳1.5g/L、椰子水70ml/L。
其中，MS培養(yǎng)基成分 大量元素 NH4N03 1650 mg/L
Na2EDTA FeS04*7H20
CaCl2 '2H20
MgS04.7H20
KH2P。4
1900 mg/L 440 mg/L 370 mg/L 170 mg/L 37.3 mg/L 27.8 mg/L
微量元素 H3B03 6.2mg/L
MnS04-4H20 22.3 mg/L
ZnS04'7H20 8.6 mg/L
KI 0.83 mg/L
Na2Mo04-2H20 0.25 mg/L
CuS04'5H20 0.025 mg/L
CoCl26H20 0.025 mg/L
有機(jī)成分肌醇 100 mg/L
甘氨酸 2.0 mg/L
煙酸 0.5 mg/L
鹽酸吡噴醇 0.5 mg/L
鹽酸硫胺素 0.1 mg/L
蔗糖 30g/L
瓊脂 lOg/L
pH 5.8。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳 盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本 領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ) 上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種橡膠樹花藥愈傷組織的玻璃化超低溫保存方法，其特征在于，包括如下步驟1)預(yù)培養(yǎng)將花藥愈傷組織接種到預(yù)培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)2～3天，培養(yǎng)溫度為25～28℃；2)裝載然后在室溫下用60％的玻璃化溶液處理花藥愈傷組織10～30分鐘；3)脫水及凍存脫水處理后，在0℃下用玻璃化溶液處理20～40分鐘，并去除玻璃化溶液，最后再重新加入玻璃化溶液，于液氮中保存。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的玻璃化超低溫保存方法，其特征在于， 所述預(yù)培養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基中添加2,4-二氯苯氧乙酸1.0 ~ 3.0mg/L、 6-糠氨基嘌呤1.0~3.0mg/L、萘乙酸l.O ~ 3.0mg/L、植物凝 膠2.0-3.0g/L、蔗糖50.0 90.0g/L、 二甲基亞砜5~10%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的玻璃化超低溫保存方法，其特征在 于，所述60%的玻璃化溶液為含34.2 68.4g/L蔗糖的愈傷組織繼代 液體培養(yǎng)基與玻璃化溶液按體積比40:60配制而成，所述繼代液體培 養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基中添加2，4-二氯苯氧乙酸1.0 ~ 3.0mg/L、 6-糠氨 基嘌呤1.0 3.0mg/L、萘乙酸1.0 3.0mg/L、蔗糖34.2 ~ 68.4 g/L、椰 子水40 ~ 90ml/L。
4. 一種釆用權(quán)利要求l-3任意一項(xiàng)所述方法保存的橡膠樹花藥愈 傷組織的復(fù)蘇及再培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟將液氮中保存的橡膠樹花藥愈傷組織于4(TC水洛中浸泡2 3分 鐘，然后用洗滌液洗2次，每次10~12分鐘；洗滌后，轉(zhuǎn)移到愈傷組 織繼代培養(yǎng)基上，在25 28'C進(jìn)行暗培養(yǎng)2-3天；再繼代培養(yǎng)一次， 培養(yǎng)20 30天后存活的花藥愈傷組織開始生長(zhǎng)；再繼代一次，相同條 件下培養(yǎng)40 60天。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的復(fù)蘇及再培養(yǎng)方法，其特征在于，所述洗滌液為改良MS培養(yǎng)基中附加2,4-二氯苯氧乙酸l.O ~ 3.0mg/L、 6-糠 氨基p票呤1.0 3.0mg/L、萘乙酸1.0 3.0mg/L、蔗糖342.3 ~ 410.8g/L。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的復(fù)蘇及再培養(yǎng)方法，其特征在于， 所述繼代培養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基中添加2，4-二氯苯氧乙酸1.0 3.0mg/L、 6-糠氨基嘌呤1.0 3.0mg/L、萘乙酸l.O ~ 3.0mg/L、植物凝 膠2-3g/L、蔗糖50.0 90.0g/L、椰子水40 ~ 90ml/L。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種橡膠樹花藥愈傷組織玻璃化超低溫保存方法，包括如下步驟將花藥愈傷組織接種到預(yù)培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)2～3天，培養(yǎng)溫度為25～28℃；然后在室溫下用60％的PVS₂處理花藥愈傷組織10～30分鐘；脫水處理后，在0℃下用PVS₂處理20～40分鐘，移去PVS₂原液，再加入新的PVS₂，在液氮中保存?；ㄋ幱鷤M織復(fù)蘇后，進(jìn)行繼代培養(yǎng)，進(jìn)一步誘導(dǎo)胚狀體及誘導(dǎo)成熟胚狀體分化后可獲得再生植株。本發(fā)明所涉及的液氮玻璃化超低溫保存方法具有設(shè)備簡(jiǎn)便、實(shí)驗(yàn)程序簡(jiǎn)化、效果和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可長(zhǎng)期保存橡膠樹花藥愈傷組織，解凍后經(jīng)培養(yǎng)得到再生植株，為橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化創(chuàng)造條件。
文檔編號(hào)C12N5/04GK101353639SQ20081011986
公開日2009年1月28日 申請(qǐng)日期2008年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月12日
發(fā)明者周權(quán)男, 孫愛花, 哲 李, 林位夫, 黃華孫, 黃天帶 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所